接供体 位点的下游超过约50-bp处。
[0182] (2)形成双运载体用于在植物细胞中短暂表达TAL效应子。这一载体含有（a)单 个右边界但无左边界；(b)可操作地连接于强组成性启动子的两个TAL效应基因；以及（c) 参与细胞分裂素制造的异戊烯基转移酶（ipt)基因的表达盒。可选择稳定转化，因为其将 导致整合全部载体并且因此产生过度表达细胞分裂素的矮化嫩枝，并且不能产生根。
[0183] (3)形成第二双运载体用于用包含来自马铃薯的遗传元件的转移DNA稳定转化， 所述DNA由以下边界划定界限：（a)右边界；(b)Ubi7启动子的内含子的部分，从靶向TAL 结合位点之间的序列开始；（c)Ubi7单体编码序列；（d)对至少一种选自包括以下的群组的 ALS抑制剂不敏感的经修饰乙酰乳酸合成酶（ALS)基因：磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、氧 基苯甲酸嘧啶基酯和磺酰基氨基羰基三唑啉酮；（e)泛素-3基因的终止子；（f)靶向天冬 酰胺合成酶l(Asnl)、多酚氧化酶（Ppo)和液泡转化酶（Inv)基因的沉默盒；（g)晚疫病抗 性基因Vntl，其可操作地连接于其原生启动子和终止序列；以及（h)左边界。除在大肠杆 菌和根癌农杆菌中维持和选择所需的序列之外，载体骨架含有ipt基因的表达盒。
[0184] (4)将两种双运载体分别引入到根癌农杆菌AGL-1病毒株中。
[0185] (5)马铃薯茎外植体用来自步骤⑷的两种病毒株共同感染，并且接着共同栽培 两天。
[0186] (6)将外植体转移到含有杀死农杆菌的选择试剂的培养基中。
[0187] (7)转化两周后，再将外植体转移到还含有ALS抑制剂的培养基中。
[0188] (8)在随后三个月内将由外植体产生的耐除草剂嫩枝转移到根诱导培养基中，并 且通过PCR分析Ubi7启动子与经修饰ALS基因之间接点的存在。至少80%再生植物含有 这类接点。
[0189] (9)使PCR阳性植物再生、繁殖和评估晚疫病抗性，块茎中的天冬酰胺含量降低、 黑斑碰伤耐受性和低温诱发的甜化降低。
[0190] 下文的实例描述所述方法的各方面。
[0191] 实例2:甲氧咪草烟杀灭曲线分析法
[0192] 为了测定杀灭未转化马铃薯细胞所需的甲氧咪草烟的浓度，用双运载体PSM1331 转化蓝吉鲁赛特节间茎外植体。这一载体含有（a)插入边界之间的可选标记基因nptll 的表达盒和（b)骨架中的ipt基因的表达盒。用于介导转化的病毒株为农杆菌病毒株 LBA4404,其生长到0D600为0. 2。在10分钟接种期之后，将外植体转移到共同培养基中并 且在过滤光下在24°C下置于I自西瓦尔生长室（Percival growth chamber)中48小时。将 节间外植体转移到含有抗生素特美汀但缺乏甲氧咪草烟的无激素的培养基（HFM)中。在 24°C和16小时光周期下将皮氏培养皿（Petri plate)置于珀西瓦尔生长室中。
[0193] 两周后，节间外植体转移到含有特美汀和五种处理浓度（0、0.5、1.0、1.5和 2.Omg/1)的植物选择除草剂甲氧咪草烟的HFM中。各处理由三次重复组成，每次重复每个 皮氏培养皿含有约20个节间外植体。在24°C和16小时光周期下将皮氏培养皿置于珀西 瓦尔生长室中。节间外植体每2周传代培养到含有各别处理浓度的甲氧咪草烟的新鲜HFM 中，促使嫩枝的任何再生并且减少任何农杆菌过度生长。
[0194] 结果指示少数节间外植体在所有甲氧咪草烟处理浓度中都展现一些Ipt分生愈 伤组织生长和主要嫩枝形成。然而，任何甲氧咪草烟处理浓度中都产生了未完全发育的正 常嫩枝。基于这些结果，确定2. Omg/1甲氧咪草烟为最佳体外选择浓度。最佳浓度定义为 使细胞生长到一定程度但不允许完全发育的嫩枝再生的选择性试剂的浓度。
[0195] 共同培养基包括0. 444g/l具有冈堡维生素（Gamborg vitamins)的村重和史库 格经修饰基础培养基（Murashige&Skoog modified basal medium) (M404;植物技术实验室 (PhytoTechnology Laboratories))、30g/1 鹿糖（S24060;研宄产品国际公司（Research Products International Corp.))以及 6. 0g/l 琼脂（S20400;研宄产品国际公司），并且 具有pH 5. 7。
[0196] 无激素的培养基（HFM)包括4. 44g/l具有冈堡维生素的村重和史库格经修饰基础 培养基（M404 ;植物技术实验室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄产品国际公司）、300mg/l特美 汀以及 2. 0g/l 吉尔赞（Gelzan) (G024 ;凯松（Caisson))，并且具有 pH 5. 7〇
[0197] 实例3:来自茎外植体的马铃薯植物的转化和再生
[0198] 单一品系法
[0199] (1)使用在原培养基上生长的3-4周大的体外蓝吉鲁赛特马铃薯植物，所述培养 基包含2. 22g/l具有闪堡维生素的村重和史库格经修饰基础培养基（M404;植物技术实验 室）、15g/l蔗糖（S24060 ;研宄产品国际公司）和2. 0g/l吉尔赞（G024 ;凯松），pH 5. 7。
[0200] (2)去除叶和节切片并且分离节间茎部分。将节间茎部分切成3-5mm外植体切片 并且置于15mL MS液体培养基中，所述培养基含有4. 44g/l具有闪堡维生素的村重和史库 格经修饰基础培养基（M404 ;植物技术实验室）和30g/l蔗糖（S24060 ;研宄产品国际公 司），pH 5. 7。
[0201] (3)来源于单一菌落的农杆菌（LBA4404)在28°C下，在震荡培育箱中，在卢里亚培 养液（Luria Broth)中生长隔夜，所述菌落含有双运载体TAL效应子盒和双运载体所关注 基因盒。第二天，将细菌溶液球粒化并且在MS液体培养基中再悬浮到0. 20D600。
[0202] (4)茎外植体在室温下在细菌溶液中培育10分钟，并且在无菌滤纸上印迹干燥以 去除过量细菌。
[0203] (5)在滤光下，将培植的茎外植体置于珀西瓦尔生长室中的无选择共同培养基 上48小时。共同培养基含有0. 444g/l具有闪堡维生素的村重和史库格经修饰基础培养 基（M404 ;植物技术实验室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄产品国际公司）以及6. Og/1琼脂 (S20400 ;研宄产品国际公司），pH 5. 7。
[0204] (6)茎外植体转移到含有抗生素（特美汀）并且无植物选择的愈伤组织诱导激素 培养基（CIHM)或无激素的培养基（HFM)。在24°C下将皮氏培养皿置于使用16小时光周期 的珀西瓦尔生长室中。CIHM含有4. 44g/l具有闪堡维生素的村重和史库格经修饰基础培养 基（M404 ;植物技术实验室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄产品国际公司）、2. 5mg/l玉米素核 糖苷、0? lmg/1 NAA、300mg/l特美汀和6. Og/1琼脂（S20400;研宄产品国际公司），pH 5. 7。 HFM含有4. 44g/l具有闪堡维生素的村重和史库格经修饰基础培养基（M404;植物技术实验 室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄产品国际公司）、300mg/l特美汀和2. Og/1吉尔赞（G024 ;凯 松），pH 5. 7。
[0205] (7)两周后，茎外植体转移到含有抗生素（特美汀）和植物选择的愈伤组织诱导激 素培养基（CIHM)或无激素的培养基（HFM)。在24°C下将皮氏培养皿置于使用16小时光周 期的珀西瓦尔生长室中。CIHM含有4. 44g/l具有冈堡维生素的村重和史库格经修饰基础 培养基（M404 ;植物技术实验室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄产品国际公司）、2. 5mg/l玉米 素核糖苷、〇? lmg/1 NAA、300mg/l特美汀、2. Omg/1甲氧咪草烟和6. Og/1琼脂（S20400;研 宄产品国际公司），pH 5. 7。HFM含有4. 44g/l具有闪堡维生素的村重和史库格经修饰基础 培养基（M404 ;植物技术实验室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄产品国际公司）、300mg/l特美 汀、2. Omg/1甲氧咪草烟以及2. Og/1吉尔赞（G024;凯松），pH 5. 7。
[0206] (8)转化后四周，茎外植体转移到含有抗生素（特美汀）和植物选择的发芽诱导激 素培养基（SIHM)或无激素的培养基（HFM)。在24°C下将皮氏培养皿置于使用16小时光周 期的珀西瓦尔生长室中。茎外植体每2-4周传代培养到新鲜SIHM或HFM中以促进嫩枝完 全再生。SIHM含有4. 44g/l具有闪堡维生素的村重和史库格经修饰基础培养基（M404;植 物技术实验室）、30g/l鹿糖（S24060;研宄产品国际公司）、2. 5mg/l玉米素核糖苷、0? 3mg/ 1 GA3、300mg/l特美汀、2. Omg/1甲氧咪草烟和6.Og/1琼脂（S20400;研宄产品国际公司）， pH 5. 7。HFM含有4. 44g/l具有闪堡维生素的村重和史库格经修饰基础培养基（M404;植物 技术实验室）、30g/l蔗糖（S24060;研宄产品国际公司）、300mg/l特美汀、2. Omg/1甲氧咪 草烟以及2. Og/1吉尔赞（G024;凯松），pH 5. 7。
[0207] (9)对完全发育的嫩枝进行繁殖用于将来测试和分析。
[0208] 实例4:来自茎外植体的马铃薯植物的转化和再生
[0209]双品系法
[0210] (1)使用在原培养基上生长的3-4周大的体外蓝吉鲁赛特马铃薯植物，所述培养 基含有2. 22g/l具有闪堡维生素的村重和史库格经修饰基础培养基（M404;植物技术实验 室）、15g/l蔗糖（S24060 ;研宄产品国际公司）和2. Og/1吉尔赞（G024 ;凯松），pH 5. 7。
[0211] (2)去除叶和节切片并且分离节间茎部分。将节间茎部分切成3-5mm外植体切片 并且置于15mL MS液体培养基中，所述培养基含有4. 44g/l具有闪堡维生素的村重和史库 格经修饰基础培养基（M404 ;植物技术实验室）和30g/l蔗糖（S24060 ;研宄产品国际公 司），pH 5. 7。
[0212] (3)两种各自来源于单一菌落的各别农杆菌品系（LBA4404)在28°C下，在震荡培 育箱中，在卢里亚培养液中生长隔夜，其中一种含有包含TAL效应子盒的双运载体并且另 一种含有包含所关注基因盒的双运载体。第二天，将各各别细菌溶液球粒化并且在MS液体 培养基中再悬浮到〇. 20D600。
[0213] (4)茎外植体在室温下在由相等体积的各个别细菌溶液组成的单一组合细菌溶液 中培育10分钟（共转化），并且在无菌滤纸上印迹干燥以去除过量细菌。
[0214] (5)在滤光下，将培植的茎外植体置于珀西瓦尔生长室中的无选择共同培养基 上48小时。共同培养基含有0. 444g/l具有闪堡维生素的村重和史库格经修饰基础培养 基（M404 ;植物技术实验室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄产品国际公司）以及6. Og/1琼脂 (S20400 ;研宄产品国际公司），pH 5. 7。
[0215] (6)茎外植体转移到含有抗生素（特美汀）并且无植物选择的愈伤组织诱导激素 培养基（CIHM)或无激素的培养基（HFM)。在24°C下将皮氏培养皿置于使用16小时光周期 的珀西瓦尔生长室中。CIHM含有4. 44g/l具有闪堡维生素的村重和史库格经修饰基础培养 基（M404 ;植物技术实验室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄产品国际公司）、2. 5mg/l玉米素核 糖苷、0? lmg/1 NAA、300mg/l特美汀和6. Og/1琼脂（S20400;研宄产品国际公司），pH 5. 7。 HFM含有4. 44g/l具有闪堡维生素的村重和史库格经修饰基础培养基（M404;植物技术实验 室）、30g/l蔗糖（S24060;研宄产品国际公司）、300mg/l特美汀和2. Og/1吉尔赞（G024;凯 松），pH 5. 7。
[0216] (7)两周后，茎外植体转移到含有抗生素（特美汀）和植物选择的愈伤组织诱导激 素培养基（CIHM)或无激素的培养基（HFM)。在24°C下将皮氏培养皿置于使用16小时光周 期的珀西瓦尔生长室中。CIHM含有4. 44g/l具有冈堡维生素的村重和史库格经修饰基础 培养基（M404 ;植物技术实验室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄产品国际公司）、2. 5mg/l玉米 素核糖苷、〇? lmg/1 NAA、300mg/l特美汀、2. Omg/1甲氧咪草烟和6. Og/1琼脂（S20400;研 宄产品国际公司），pH 5. 7。HFM含有4. 44g/l具有闪堡维生素的村重和史库格经修饰基础 培养基（M404 ;植物技术实验室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄产品国际公司）、300mg/l特美 汀、2. Omg/1甲氧咪草烟以及2. Og/1吉尔赞（G024;凯松），pH 5. 7。
[0217](8)转化后四周，茎外植体转移到含有抗生素（特美汀）和植物选择的发芽诱导激 素培养基（SIHM)或无激素的培养基（HFM)。在24°C下将皮氏培养皿置于使用16小时光周 期的珀西瓦尔生长室中。茎外植体每2-4周传代培养到新鲜SIHM或HFM中以促进嫩枝完 全再生。SIHM含有4. 44g/l具有闪堡维生素的村重和史库格经修饰基础培养基（M404;植 物技术实验室）、30g/l鹿糖（S24060;研宄产品国际公司）、2. 5mg/l玉米素核糖苷、0? 3mg/ 1 GA3、300mg/l特美汀、2. Omg/1甲氧咪草烟和6. Og/1琼脂（S20400 ;研宄产品国际公司）， pH 5. 7。HFM含有4. 44g/l具有闪堡维生素的村重和史库格经修饰基础培养基（M404;植物 技术实验室）、30g/l蔗糖（S24060;研宄产品国际公司）、300mg/l特美汀、2. Omg/1甲氧咪 草烟和2. Og/1吉尔赞（G024 ;凯松），pH 5. 7。
[0218] (9)对完全发育的嫩枝进行繁殖用于将来测试和分析。
[0219] 实例5:马铃薯蓝吉、伯班克（Burbank)和阿特兰替（Atlantic)栽培品种中的目 标位点序列
[0220] 为了判断不同马铃薯栽培品种之间的目标区（Ubi7启动子内含子的5'区）是否 保守，对引物对册175?1和册1751?1(5￡〇10勵 ：1和5￡〇10勵:2)进行设计并且用于扩增 来自马铃薯变种蓝吉、伯班克和阿特兰替的目标区。扩增片段克隆到pGEMT-easy载体中并 且定序。序列结果显示所测试的全部变种的目标区相同。ubi7启动子内含子序列以SEQ ID NO:3为代表。
[0221] 实例6 :TAL效应子的设计
[0222] TAL效应子对经设计以靶向所选区。正向和反向TALE识别位点分别列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO: 5。TALE骨架为Hax3,其为十字花科致病菌野油菜黄单胞假辣根变种 (Brassicaceae pathogen X.campestris pv.Armoraciae)病毒株 5 中鉴别出来的 AvrBs3 家族的成员。对此骨架作出的修饰包括：(a)截短初始Hax3的C端活化域；(b)在截短的 Hax3蛋白质的N端添加来自SV40病毒的核定位序列；（c)对初始Hax3DNA序列进行密码子 优化；（d)初始11. 5个重复可变双残基（RVD)置换为16. 5个对应于目标位点的RVD;(e) 在经修饰Hax3骨架的C端添加Fokl核酸酶的催化域。
[0223] 效应蛋白的组构显示于图5中。最终正向和反向TALE的DNA和蛋白质序列列为 SEQ ID N0:6、7、8 和 9。
[0224] 实例7:用于DNA转移的载体
[0225] 转移DNA由马铃薯产生的遗传元件组成并且由T-DNA类边界划定界限。其从左边 界到右边界包括三个盒：（a)晚疫病抗性盒；(b)靶向三种基因的块茎特异性沉默盒：参与 天冬酰胺形成的ASN1基因；与蔗糖的水解有关的酸性转化酶（INV)基因；以及编码碰撞碰 伤时氧化多酚的酶的多酚氧化酶（PP0)基因；以及（c)启动子较少的突变马铃薯乙酰乳酸 合成酶（ALS)基因（具有W563L和S642I取代），假设其在过度表达时赋予对ALS抑制除草 剂的耐药性。
[0226] 转移DNA经设计以插入到位于马铃薯的四个Ubi7基因中的一者的前导序列内的 内含子区中，使得相关Ubi7启动子将驱动ALS基因的表达并且赋予针对ALS抑制剂型除草 剂的耐药性。
[0227] 因为Ubi7单体在蛋白质稳定中起重要作用，但前面是内含子的部分的编码序列 同框融合到ALS基因。将转移DNA插入到双运载体中形成质粒pSM2168。转移DNA的组构 在图1中说明。野生型和突变ALS基因的DNA和蛋白质序列由SEQ