专利名称：：一种霍乱弧菌o1群检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及体外诊断试剂
技术领域：
，具体涉及一种霍乱弧菌01群检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：霍乱是一类以腹泻为主要症状的烈性传染病，至今已发生7次世界大流行，1961年开始由埃尔托霍乱弧菌引起的霍乱第7次世界大流行，波及140个国家和地区，报告病例400万以上。据WHO专家会议估计，全球每年约发生550万例，其中以亚洲、非洲和拉丁美洲较为严重，引起亚洲10万和非洲2万人死亡。时至今日，霍乱仍然是最危险的烈性传染病之一。因此，早期迅速和正确的诊断对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。目前霍乱弧菌已被分为200多个血清群，但只有01血清群和0139血清群能够引起流行，准确、快速地检测霍乱弧菌01群具有十分重要的意义传统霍乱弧菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(realtimePCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增(IsothermalAmplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导恒温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性。因此，需要一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的霍乱弧菌01群检测试剂盒及检测方法以解决上述问题。基于环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplicationofDNA,简称LAMP)是利用fetDNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎_环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(6365°C)条件下4590分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需23天，完成鉴定报告需1015天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时。并且，本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。_
发明内容本发明所要解决的技术问题之一是克服现有技术中耗时长，漏检率高的不足提供检测效果更全面、特异性高、漏检率低的霍乱弧菌01群检测试剂盒。霍乱弧菌01群有多个重要抗原。本发明检测的是基因，该基因为霍乱弧菌01群0抗原1型的编码基因，可以特异地检测出霍乱弧菌01群。与NCBI网站nt数据库的BLAST比对结果显示，除霍乱弧菌01群外，无其它菌带有该基因。本发明所提供的霍乱弧菌01群检测试剂盒包括下列组成以霍乱弧菌基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，Bstmk聚合酶，反应液，样品预处理液，显色液，稳定液和阳性对照。所述的两对内外引物分别为外引物F3:ACATCACCACAGCCTCTT(SEQIDN01)外引物B3TCGAACCTAGAAGTGTGTG(SEQIDN02)内引物FIP:AGTCTTTGTGAGTGTGGTAAAGCTTTTTCTGCTTTTTTTGCTCGTCC(SEQIDN03)内引物BIP:AGGTCATCTGTAAGTACAACATTCCTTTTGTAAAGTAGGCTTACTTGAGTT(SEQIDN04)或外引物F3:ACCCAATACTGAGGCGATA(SEQIDN05)外引物B3:CACTTGCGAGTGAAGAGC(SEQIDN06)内引物FIPTCAGGTTATTCATATTGGTGGTTGGTTTTTAAAGGTAATTTTATCCACCTTCTC(SEQIDN07)内引物BIP:GCAATTGAAACGAGATCCCCTTGTTTTGCTCATAATTTTTGGATTCACGT(SEQIDN08)或外引物F3GAGCTATGGCTAATATCTTTACG(SEQIDN09)外引物B3GCTAACCAACCATTAGAAGC(SEQIDN010)内引物FIP:AACCCAATCGTTTGAAAAACCTGCTTTTAAAATTATCCAAAAAAGCTCGCT(SEQIDN011)内引物BIP:GCTAGGAAGTTCAATCCAGTATGTTTTTTGGTTTAATCAATGAAGCGC(SEQIDN012)或外引物F3GCTCGTCCAATGACTTTGA(SEQIDN013)外引物B3CCTATTCTGACGTAATTATTCGT(SEQIDN014)内引物FIP:GTTGTACTTACAGATGACCTTGGTGTTTTTTTCCAGCTTTACCACACTC(SEQIDN015)内引物BIP:CCGGATATGAATGCGGTAGTGGTTTTGATGAATCGAACCTAGAAGTG(SEQIDN016)。所述的内引物FIP/BIP各为0.20.25iimol/L，外引物F3/B3的浓度各为1.22.0umol/L；优选内引物FIP/BIP的浓度为0.2umol/L,外引物F3/B3的浓度为1.6umol/L。所述的聚合酶酶浓度4-10U/iiL，优选酶浓度为8U/iiL。所述的反应液含1.62mmol/LdNTPs、2025mmol/LTris_HCl、1012.5mmol/LKC1U012.5mmol/L(NH4)2S04、810mmol/LMgS04、0.10.125体积％TritonX-100、0.8lmol/L甜菜碱；优选2mmol/LdNTPs、25mmol/LTris-HCl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L(NH4)2S04、10mmol/LMgS04、0.125体积％TritonX-100、lmol/L甜菜碱。所述的显色液为SYBRGreenI或EvaGreen，优选SYBRGreenI。所述稳定液为石蜡油。所述的阳性对照为霍乱弧菌01群基因组DNA。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种霍乱弧菌01群检测方法，包括如下步骤(1)将待测样品离心，去上清，得到沉淀；(2)将步骤(1)的沉淀加入本发明检测试剂盒中的样品预处理液，混合均勻，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA；(3)在反应容器中加入本发明试剂盒中的BstDNA聚合酶0.91.8体积份数、反应液3840体积份数、稳定液5254.5体积份数、样品模板DNA4.59体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4体积份数，恒温反应；(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；步骤(3)中所述的恒温反应的反应条件为温度6365°C，反应时间4590min。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明的检测试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；6.由于选择了高保守性的基因作为靶基因设计引物，使得本发明的检测试剂盒检测霍乱弧菌01群的准确率更高。_具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1试剂盒的制备(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物外引物F3:ACATCACCACAGCCTCTT(SEQIDN01)外引物B3TCGAACCTAGAAGTGTGTG(SEQIDN02)内引物FIP:AGTCTTTGTGAGTGTGGTAAAGCTTTTTCTGCTTTTTTTGCTCGTCC(SEQIDN03)内引物BIP:AGGTCATCTGTAAGTACAACATTCCTTTTGTAAAGTAGGCTTACTTGAGTT(SEQIDN04)。(2)购置DNA聚合酶聚合酶置于容器；(3)配制反应液和引物反应液含有2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-Cl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L(NH4)2S04、10mmol/LMgS04、0.125体积％TritonX-100、lmol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各0.2iimol/L和外引物F3/B3各0.25iimol/L,置于容器；(4)配制样品预处理液样品预处理液含有20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mmol/LEDTA和1.2体积%TritonX-100,置于容器；(5)购置稳定液石蜡油，置于容器；(6)购置显色液SYBRGreenI，置于容器；(7)提取阳性对照提取霍乱弧菌01群基因组DNA，置于容器；(8)将上述7个容器装成试剂盒，封装。制备工艺简述如下1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；2、将上述(2广(4)步骤配制的液体无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；3、将稳定液分装，抽样质检；4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；5、组装试剂盒。在本发明霍乱弧菌01群检测试剂盒的其他实施例中，所采用的引物还可以是外引物F3GAGCTATGGCTAATATCTTTACG(SEQIDN09)外引物B3GCTAACCAACCATTAGAAGC(SEQIDN010)内引物FIP:AACCCAATCGTTTGAAAAACCTGCTTTTAAAATTATCCAAAAAAGCTCGCT(SEQIDN011)内引物BIP:GCTAGGAAGTTCAATCCAGTATGTTTTTTGGTTTAATCAATGAAGCGC(SEQIDN012)实施例2试剂盒的制备(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物外引物F3:ACCCAATACTGAGGCGATA(SEQIDN05)外引物B3:CACTTGCGAGTGAAGAGC(SEQIDN06)内引物FIPTCAGGTTATTCATATTGGTGGTTGGTTTTTAAAGGTAATTTTATCCACCTTCTC(SEQIDN07)内引物BIP:GCAATTGAAACGAGATCCCCTTGTTTTGCTCATAATTTTTGGATTCACGT(SEQIDN08)(2)购置DNA聚合酶-.Bstrnk聚合酶置于容器；(3)配制反应液和引物反应液含有1.6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-Cl、10mmol/LKCl、10mmol/L(NH4)2S04、8mmol/LMgS04、0.1体积％TritonX-100,0.8mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各0.25umol/L和外引物F3/B3各1.2iimol/L，置于容器；(4)配制样品预处理液样品预处理液含有10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、lmmol/LEDTA和1.0体积%TritonX-100,置于容器；(5)购置稳定液石蜡油，置于容器；(6)购置显色液EVAGreenI，置于容器；(7)提取阳性对照提取霍乱弧菌01群基因组DNA，置于容器；(8)将上述7个容器装成试剂盒，封装。其他同实施例1。在本发明霍乱弧菌01群检测试剂盒的其他实施例中，所采用的引物还可以是外引物F3GCTCGTCCAATGACTTTGA(SEQIDN013)外引物B3CCTATTCTGACGTAATTATTCGT(SEQIDN014)内引物FIP:GTTGTACTTACAGATGACCTTGGTGTTTTTTTCCAGCTTTACCACACTC(SEQIDN015)内引物BIP:CCGGATATGAATGCGGTAGTGGTTTTGATGAATCGAACCTAGAAGTG(SEQIDN016)。实施例3霍乱弧菌01群检测试剂盒的应用1材料与方法1.1材料1.1.1菌株本发明采用菌株有17株，主要来源于中国疾病预防控制中心、上海市疾病预防控制中心、浦东新区疾病预防控制中心。详见表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1.2分离菌株的鉴定1.2.1将标本接种至TCBS琼脂、双洗平板上，TCBS上出现黄色菌落，双洗平板上出现灰黑色中心的菌落均为可疑菌落。在显微镜下菌体为稍弯的杆菌，菌体短，逗点状，菌体单端有一根鞭毛，运动活泼呈穿梭状，革兰氏染色阴性。生化反应氧化酶+蔗糖+靛基质_硫化氢-动力+V-P+。血清学反应与霍乱弧菌01群多价诊断血清发生凝集，生理盐水不凝集。1.3样品处理(模板DNA提取)1.3.1取lmL液体培养的菌液样品，lOOOOrpm离心2分钟，获得菌体沉淀；1.3.2在上述菌体沉淀中加入100yL样品预处理液混合均勻，沸水中煮20分钟后立即置于冰上冷却10分钟，lOOOOrpm离心2分钟，上清即为样品模板DNA。1.4、采用实施例1或实施例2的试剂盒进行环介导等温扩增技术的反应过程1.4.1在200uL反应管配制反应体系反应液和引物共22uL，BstDNA聚合酶0.5yL(4U)，稳定液30uL，模板DNA2.5yL。1.4.2将配制好的反应管于65°C恒温反应1小时。1.5反应后处理向上述反应产物中加入2uLSYBRGreenI，混勻，同时也向阳性对照管(霍乱弧菌01群基因组DNA)和阴性对照管(去离子水)中加入SYBRGreenI混勻，若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现橙色则为阴性。1.6电泳配制0.2%琼脂糖凝胶电泳。以SYBRGreenI作为染料进行显色反应观察结果。1.7特异度试验1.7.1纯菌株LAMP检测用LAMP方法对25株细菌进行扩增，根据显色反应观察结果，绿色为阳性，橙色阴性，验证方法特异性。1.7.2几种菌株混合DNA检测用LAMP对霍乱弧菌01群及沙门氏、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌的DNA等体积混合液取2.5ul作LAMP检测。1.8灵敏度试验将霍乱弧菌01群于普通营养琼脂平板上纯培养18-24小时后，挑两满环菌落混悬于5mL无菌生理盐水中，用生理盐水10倍倍比稀释至10-10。选择适宜的3个浓度级取100ul平铺于普通营养琼脂平板上，分别作3个平板，37°C培养48h，取菌落数在30300之间的平板作平板计数，该浓度级的3个平板的菌落数的均数推算细菌浓度，为菌落平均数X稀释倍数X10；同时，各浓度级取lmL，提取DNA，作LAMP检测。1.8重复性试验特异度试验和灵敏度试验分别重复2次。2结果2.1霍乱弧菌01群LAMP检测方法的建立2.2特异度试验霍乱弧菌01群(编号N16961)检测结果阳性，11株非霍乱弧菌01群均阴性，霍乱弧菌01群的5例样品及霍乱弧菌01群、沙门氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌4种细菌DNA混合液为阳性，如表2所示。结果显示试剂盒具有高特异性。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>拟■靈._2.3灵敏度试验经菌落平板计数，选择第9个稀释度进行读数，平均菌落数为126cfu，推算细菌原液浓度为1.26X1011cfu/mL,LAMP方法可检测到第4个稀释度，为1.26X107cfu/mL。电泳结果也符合上述结果。2.4重复性试验特异度试验重复两次，结果一致。灵敏度试验重复两次，数量级一致。SEQUENCELISTING<110>广州华峰生物科技有限公司，中华人民共和国上海出入境检验检疫局<120>一种霍乱弧菌01群检测试剂盒及其检测方法<160>16<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1acatcaccacagcctctt18<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2tcgaacctagaagtgtgtg19<210>3<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>3agtctttgtgagtgtggtaaagctttttctgctttttttgctcgtcc47<210>4<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>4aggtcatctgtaagtacaacattccttttgtaaagtaggcttacttgagtt51<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>5acccaatactgaggcgata19<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6cacttgcgagtgaagagc18<210>7<211>54<212>DNA<213>人工序列<400>7tcaggttattcatattggtggttggtttttaaaggtaattttatccaccttctc54<210>8<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>8gcaattgaaacgagatccccttgttttgctcataatttttggattcacgt50<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>9gagctatggctaatatctttacg23<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10gctaaccaaccattagaagc20<210>11<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>11aacccaatcgtttgaaaaacctgcttttaaaattatccaaaaaagctcgct51<210>12<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>12gctaggaagttcaatccagtatgttttttggtttaatcaatgaagcgc48<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>13gctcgtccaatgactttga19<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>14cctattctgacgtaattattcgt23<210>15<211>49<212>DNA<213>人工序列<400>15gttgtacttacagatgaccttggtgtttttttccagctttaccacactc49<210>16<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>16ccggatatgaatgcggtagtggttttgatgaatcgaacctagaagtg4权利要求一种霍乱弧菌O1群检测试剂盒，包括BstDNA聚合酶，反应液，样品预处理液，显色液，稳定液和阳性对照，其特征在于还包括以以霍乱弧菌RfbN基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。2.根据权利要求1所述的霍乱弧菌01群检测试剂盒，其特征在于所述的霍乱弧菌01群的两对内外引物序列分别为外引物F3:ACATCACCACAGCCTCTTSEQIDN01外引物B3TCGAACCTAGAAGTGTGTGSEQIDN02内引物FIP:AGTCTTTGTGAGTGTGGTAAAGCTTTTTCTGCTTTTTTTGCTCGTCCSEQIDN03内引物BIPAGGTCATCTGTAAGTACAACATTCCTTTTGTAAAGTAGGCTTACTTGAGTTSEQIDN04或外引物F3:ACCCAATACTGAGGCGATASEQIDN05外引物B3:CACTTGCGAGTGAAGAGCSEQIDN06内引物FIPTCAGGTTATTCATATTGGTGGTTGGTTTTTAAAGGTAATTTTATCCACCTTCTCSEQIDN07内引物BIPGCAATTGAAACGAGATCCCCTTGTTTTGCTCATAATTTTTGGATTCACGTSEQIDN08或外引物F3GAGCTATGGCTAATATCTTTACGSEQIDN09外引物B3GCTAACCAACCATTAGAAGCSEQIDN010内引物FIPAACCCAATCGTTTGAAAAACCTGCTTTTAAAATTATCCAAAAAAGCTCGCTSEQIDN011内引物BIP:GCTAGGAAGTTCAATCCAGTATGTTTTTTGGTTTAATCAATGAAGCGCSEQIDN012或外引物F3GCTCGTCCAATGACTTTGASEQIDN013外引物B3CCTATTCTGACGTAATTATTCGTSEQIDN014内引物FIPGTTGTACTTACAGATGACCTTGGTGTTTTTTTCCAGCTTTACCACACTCSEQIDN015内引物BIP:CCGGATATGAATGCGGTAGTGGTTTTGATGAATCGAACCTAGAAGTGSEQIDN016。3.根据权利要求1所述的霍乱弧菌01群检测试剂盒，其特征在于所述的内引物FIP/BIP各为0.20.25μmol/L,外引物F3/B3的浓度各为1.22.0μmol/L。4.根据权利要求3所述的霍乱弧菌01群检测试剂盒，其特征在于内引物FIP/BIP的浓度为0.2“11101/1，外引物？3/83的浓度为1.6μmol/L。5.根据权利要求1所述的霍乱弧菌01群检测试剂盒，其特征在于所述的feiDNA聚合酶酶浓度4-10υ/μ1，所述的显色液为SYBRGreenI或EvaGreen。6.根据权利要求5所述的霍乱弧菌01群检测试剂盒，其特征在于所述的酶浓度为8υ/μL，所述的显色液为SYBRGreenI。7.根据权利要求1所述的霍乱弧菌01群检测试剂盒，其特征在于所述的反应液含1.62mmol/LdNTPs、2025mmol/LTris-HCl、1012.5mmol/LKCl、1012.5mmol/L(NH4)2S04、810mmol/LMgS04、0.10.125体积％TritonX_100、0.8lmol/L甜菜碱。8.根据权利要求7所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，其特征在于所述的反应液含2mmol/LdNTPs、25mmol/LTris-HCl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L(NH4)2S04、10mmol/LMgS04、0.125体积％TritonX-100、lmol/L甜菜碱。9.根据权利要求1所述的霍乱弧菌01群检测试剂盒，其特征在于所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为霍乱弧菌01群基因组DNA。10.一种根据权利要求1的试剂盒进行的霍乱弧菌01群检测方法，其特征在于包括如下步骤(1)将待测样品离心，去上清，得到沉淀；(2)将步骤(1)的沉淀加入权利要求1检测试剂盒中的样品预处理液，混合均勻，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA；(3)在反应容器中加入权利要求1检测试剂盒中的BstDNA聚合酶0.91.8体积份数、反应液3840体积份数、稳定液5254.5体积份数、样品模板DNA4.59体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、外引物F3/B3各4体积份数，恒温反应；其中所述的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以霍乱弧菌基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各两对引物，两对内外引物序列分别为外引物F3:ACATCACCACAGCCTCTTSEQIDN01外引物B3TCGAACCTAGAAGTGTGTGSEQIDN02内引物FIP:AGTCTTTGTGAGTGTGGTAAAGCTTTTTCTGCTTTTTTTGCTCGTCCSEQIDN03内引物BIPAGGTCATCTGTAAGTACAACATTCCTTTTGTAAAGTAGGCTTACTTGAGTTSEQIDN04或外引物F3ACCCAATACTGAGGCGATASEQIDN05外引物B3:CACTTGCGAGTGAAGAGCSEQIDN06内引物FIPTCAGGTTATTCATATTGGTGGTTGGTTTTTAAAGGTAATTTTATCCACCTTCTCSEQIDN07内引物BIPGCAATTGAAACGAGATCCCCTTGTTTTGCTCATAATTTTTGGATTCACGTSEQIDN08或外引物F3GAGCTATGGCTAATATCTTTACGSEQIDN09外引物B3GCTAACCAACCATTAGAAGCSEQIDN010内引物FIPAACCCAATCGTTTGAAAAACCTGCTTTTAAAATTATCCAAAAAAGCTCGCTSEQIDN011内引物BIP:GCTAGGAAGTTCAATCCAGTATGTTTTTTGGTTTAATCAATGAAGCGCSEQIDN012或外引物F3GCTCGTCCAATGACTTTGASEQIDN013外引物B3CCTATTCTGACGTAATTATTCGTSEQIDN014内引物FIPGTTGTACTTACAGATGACCTTGGTGTTTTTTTCCAGCTTTACCACACTCSEQIDN015内引物BIP:CCGGATATGAATGCGGTAGTGGTTTTGATGAATCGAACCTAGAAGTGSEQIDN016；(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。11.根据权利要求10所述的霍乱弧菌01群检测方法，其特征在于步骤(3)中所述的恒温反应的反应条件为温度6365°C，反应时间4590min。全文摘要本发明涉及一种霍乱弧菌O1群检测试剂盒，本发明的试剂盒包括BstDNA聚合酶，反应液，样品预处理液，显色液，稳定液和阳性对照，还包括以以霍乱弧菌RfbN基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明的霍乱弧菌O1群检测试剂盒检测效果更全面、特异性高、漏检率低，适用于霍乱弧菌O1群的快速检测。文档编号C12Q1/68GK101824482SQ20101019322公开日2010年9月8日申请日期2010年6月7日优先权日2010年6月7日发明者何宇平,冯雪梅,张晓航,张琳,张继伦,方筠,曹以诚,杜正平,柯佳佳,田桢干,阎俊,陈洵,韩晓辉申请人:广州华峰生物科技有限公司;中华人民共和国上海出入境检验检疫局