专利名称：一种体外保存/培养卵母细胞以抑制卵母细胞生发泡破裂的方法
技术领域：
本发明属于生殖生物学领域，是一种利用生理性成分维持生发泡期(Germinal Vesicle, GV)卵母细胞减数分裂停滞、抑制卵母细胞生发泡破裂(Germinal Vesicle Breakdown, GVBD)的方法，是猪卵泡液的一种新用途的开发利用。
背景技术：
体外成熟的卵母细胞发育能力显著低于体内成熟的卵母细胞。卵母细胞在进行核成熟的同时发生胞质成熟，从而支持随后成功发育到期。体内卵母细胞发生一系列的事件包括减数分裂前期的转录和翻译胞质逐渐成熟，然而体外从卵泡中获取的卵母细胞在转入培养液中后还没获得胞质成熟就提前发生减数分裂恢复。为了提高体外成熟卵母细胞的质量，目前主要采取药理学的方法维持减数分裂停滞，主要包括使用蛋白合成抑制剂或者磷酸化抑制剂(Fulka等，Mol Reprod Dev, 29 :379-384(1991) ；Lonergan 等，J Reprod Fertil, 109 :355-365(1997) ；Avery 等，Mol Reprod Dev，50 :334-344(1998) ；Li 等，Acta Zoologial Sinica，47(6) :684-690(2001)； Le Beux 等，Theriogenology，60 :1049-1058^003))以及 cAMP 转导抑制剂(Sirard 等， Theriogenology, 49 :483-497 (1998))。然而，药物虽然能够有效抑制卵母细胞GVBD发生，却往往对卵母细胞有一定的毒性。理论上低温下培养可以维持卵母细胞减数分裂停滞。然而较低温显著降低正常减数分裂纺锤体的形成OVu等，MolR印rod Dev, 54 388-395(1999))并且低温保存的卵母细胞经体外受精显著降低受精率。由此我们需要寻找一个适度的温度条件来保存卵母细胞，并且能够维持其减数分裂停滞状态。有报道在培养液中添加部分卵泡液(Leibfried和First，Bio r印rod，23 :699-704(1980))可以用来维持减数分裂停滞，但维持时间很短。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种体外保存/培养卵母细胞以抑制卵母细胞生发泡破裂的方法及其应用。本发明的另一个目的是提供卵泡液在卵母细胞体外保存/培养中的应用。本发明又一个目的是提供包含卵泡液的制剂及其应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种体外保存/培养卵母细胞的方法，所述方法采用卵泡液作为卵母细胞体外保存/培养的保存液或培养液，以抑制卵母细胞生发泡破裂即维持卵母细胞减数分裂。优选地，所述抑制卵母细胞生发泡破裂的保存/培养温度为20_30°C，优选为 27- °C。优选地，所述方法中每10 100 μ 1卵泡液保存/培养1 10个卵母细胞；优选为每10 μ 1卵泡液保存/培养1个卵母细胞。
优选地，所述方法还包括在用卵泡液保存/培养卵母细胞之前，用TCM-199培养液漂洗卵母细胞，并用卵泡液清洗卵母细胞的步骤。优选地，所述卵泡液选自猪或牛的卵泡液；优选地，所述卵泡液选自猪的卵泡液； 进一步优选地，所述猪卵泡液的制备方法包括以下步骤1)抽取猪卵泡液，自然沉降，取上清；2)离心，取上清；幻过滤除菌。优选地，在制备保存卵泡液时，可在步骤幻之后和步骤 3)之前将获得的上清液进行冻融、再次离心取上清。上清液优选在0°C _20°C冻融，进一步优选在_20°C冻融。优选地，进行冻融、再次离心取上清液的步骤可以根据实际情况重复， 并将重复获得的上清液过滤除菌。优选地，所述卵母细胞选自哺乳动物中猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞，优选为猪卵母细胞，进一步优选为生发泡期的猪卵母细胞。另一方面，本发明提供了上述的方法在卵母细胞的体外保存/培养或者在卵母细胞体外成熟的控制和优化中的应用。优选地，所述应用中的卵母细胞选自哺乳动物中猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞，优选为猪卵母细胞，进一步优选为生发泡期的猪卵母细胞。此外，本发明还提供了卵泡液在体外保存/培养卵母细胞中作为保存液或培养液，以抑制卵母细胞生发泡破裂中的应用；优选地，所述卵泡液选自猪或牛的卵泡液；进一步优选地，所述卵泡液选自猪的卵泡液。优选地，所述应用中的猪卵泡液的制备方法包括以下步骤1)抽取猪卵泡液， 自然沉降，取上清；幻离心，取上清液；幻过滤除菌。优选地，在制备保存卵泡液时，可在步骤幻之后和步骤幻之前将获得的上清液进行冻融、再次离心取上清。上清液优选在 0°C -20°c冻融，进一步优选在-20°c冻融。优选地，进行冻融、再次离心取上清液的步骤可以根据实际情况重复，并将重复获得的上清液过滤除菌。优选地，所述猪卵泡液通过以下方法制备1)选取直径为2_6mm的猪卵泡，抽取卵泡液，自然沉降15min，取上清；幻15000转/分钟离心15min，取上清，_20°C冻融后再15000 转/分钟离心15min，再反复冻融离心两次，每次取上清，弃沉淀；3)收集上清，过滤除菌。又一方面，本发明提供一种用于保存卵母细胞的制剂，所述制剂包含猪或牛的卵泡液；优选包含猪的卵泡液。优选地，所述猪卵泡液采用以上方法制备。本发明还提供所述制剂在保存卵母细胞中的应用。优选地，所述制剂用于保存猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞，进一步优选保存猪卵母细胞，更优选为保存生发泡期的猪卵母细胞。综上所述，本发明首次尝试了完全采用卵泡液制备的保存液结合不同的温度来保存和培养哺乳动物中猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞，得到了非常令人满意的结果，全卵泡液能够有效抑制猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞GVBD的发生。在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供一种维持猪卵母细胞减数分裂停滞的方法，该方法包括将猪卵母细胞在适宜的温度下保存和培养在保存培养液中。优选地，所述猪卵母细胞为处于生发泡期的猪卵母细胞。优选地，用于保存和培养猪卵母细胞的保存培养液通过以下步骤制备1)抽取猪卵泡液，自然沉降；幻离心，取上清液；幻过滤除菌。优选地，在制备保存培养液时，可在步骤2)之后和步骤幻之前将获得的上清液进行冻融、再次离心取上清。优选地，上清液在 0°C -20°C冻融，优选为-20°C冻融。优选地，进行冻融、再次离心取上清液的步骤可以根据实际情况重复，并将重复获得的上清液过滤除菌。优选地，在本发明提供的维持猪卵母细胞减数分裂停滞的方法中，将猪卵母细胞在20-30°C的温度下保存和培养。进一步优选地，猪卵母细胞在27-28°C的温度下保存和培养。另一方面，本发明提供上述方法在保存和培养卵母细胞或卵母细胞体外成熟研究、生产中的应用。优选地，所述卵母细胞为猪卵母细胞。进一步优选地，该猪卵母细胞为处于GV期的猪卵母细胞。又一方面，本发明提供包含以上方法所述的保存培养液的制剂。再一方面，本发明提供包含以上方法所述的保存培养液的制剂在保存和培养卵母细胞或卵母细胞体外成熟研究、生产中的应用。优选地，所述卵母细胞为猪卵母细胞。进一步优选地，所述猪卵母细胞为处于GV期的猪卵母细胞。与现有技术相比，本发明的方法将猪卵泡液制备的保存培养液来保存和培养生发泡期(GV)的猪卵母细胞，在将温度控制在20到30°C之间时，该方法能够有效抑制部分卵母细胞在GV期，温度控制在2748°C时抑制效果最好，保存三天超过60%的卵母细胞停滞在GV期，且成熟培养后排出第一极体，略低于新鲜卵母细胞的成熟率。该方法采用的保存培养液高效、廉价、方便、以及来源容易，取得很好的临床效果，实验结果可重复性强。采用本发明的步骤制备的保存培养液可以制成商品化的制剂，用于猪卵母细胞及其他动物类型卵母细胞的常温保存和提高体外成熟效果。具体而言，本发明至少具有以下优点1、本发明的方法可以大大提高卵巢卵母细胞在科研和畜牧业生产上的利用率，为利用屠宰场卵巢解除了时间上的限制，便于体外操作时间的安排；2、本发明的方法可以将GV期卵母细胞在常温下保存和培养，有助于提高卵母细胞体外成熟质量，促进核成熟和胞质成熟同步，是一种最佳的不依赖于抑制剂的生理学控制核成熟进程的方法，对于动物胚胎工程以及人类辅助生殖技术研究和应用都有重要意义；3、猪卵泡液易于获取，并且通过本发明的方法制备的保存培养液高效、廉价、方便、来源容易以及对细胞没有毒性，可以取得很好的临床效果；4、通过本发明的方法制备的保存培养液，可以制成商品化的制剂，并可用于猪卵母细胞以及其他动物类型卵母细胞的常温保存或者体外成熟的研究和生产应用。采用本发明技术制备的保存培养液进行猪卵母细胞常温保存，尤其是在27. 5°C保存能够有效抑制卵母细胞GVBD，且保留大部分的发育潜能。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述。应当理解给出的实施例仅为了对制备和使用本发明的特定方法和产品进行说明，而不是为了限制本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所使用的试剂均购自Sigma (St. Louis, MO)公司。实施例1 用于培养/保存猪卵母细胞的保存培养液的制备选择北京第五肉联厂刚刚屠宰的3-5个月龄的青年母猪，在宰杀后立即获取卵巢，并确定卵巢上不带有黄体。将卵巢盛于含有75 μ g/ml青霉素和50 μ g/ml链霉素的 25-30°C生理盐水中，在池内运到实验室。在JJ-CJ-IFD型洁净工作台(净化等级为100级，吴江市净化设备总厂生产) 上，采用固定有18号针头的20ml —次性注射器(上海米沙瓦伊科工业有限公司生产)从 2-6mm直径的猪卵泡中抽取猪卵泡液(porcine follicularf luid，pFF)；此步骤也可采用固定有18号针头的吸液泵在低真空条件下进行，猪卵泡液放入50ml锥形瓶O^lcon公司生产)中自然沉降15min，取上清立刻15000转/分钟离心15min，上清经_20°C冻融后 15000转/分钟离心15min，再反复冻融离心两次，每次取上清，弃沉淀。最后将上清收集， 用MillexO. 22 μ m孔径的滤器(Carrighwohill, Co. Cork, Ireland)过滤除菌，分装冷冻保存备用(三个月内使用保存于-20°C，更长时间保存于-70°C )。实施例2 =GV期猪卵母细胞的获取和保存在JJ-CJ-IFD型洁净工作台上，将实施例1中猪卵泡液自然沉降获得的沉淀用 TCM-199清洗两遍，在C-DS型显微镜(Nikon公司生产)下用口吸管选择卵丘细胞包裹紧密、卵母细胞胞质颗粒分布均勻的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，用TCM-199漂洗3遍，然后在猪卵泡液中洗三遍。A.采用pFF培养滴和TCM-199培养滴在不同温度下保存GV期的猪卵母细胞的对比实验以200 μ 1制备的保存培养液/滴的量制备pFF培养滴；配制TCM-199，以200 μ 1 制备的TCM-199/滴的量制备TCM-199对照培养滴，然后将两种培养滴放在SPX-50型20-30 度生化培养箱(宁波江南仪器厂生产)中提前预热2小时。将准备好的卵丘-卵母细胞复合体分别放入两种培养滴中，每个滴放入约20个 COCs。将含有卵丘-卵母细胞复合体的培养滴置于培养皿中，然后放置于Hera Cell 150 型细胞培养箱(Thermo公司生产)中，在表1所示的不同温度下保存3天。保存3天后检测卵丘-卵母细胞复合体减数分裂受到抑制的情况。将卵丘-卵母细胞复合体置于载玻片上并在新配制的固定液(醋酸甲醇=1 3)中，室温下固定 48-72小时，固定后的细胞在(w/v)地衣红(溶于45%醋酸)中染色5分钟，然后在 400X相差显微镜下观察。根据细胞核膜是否完整，将卵母细胞分为生发泡期(GV)和生发泡破裂期(GVBD)。结果见下表1。表1 不同温度下保存GV期猪卵母细胞3天
权利要求
1.一种体外保存/培养卵母细胞的方法，其中，所述方法采用卵泡液作为卵母细胞体外保存/培养的保存液或培养液，以抑制卵母细胞生发泡破裂。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述抑制卵母细胞生发泡破裂的保存/培养温度为 20-30°C，优选为 27-280C ；优选地，所述方法中每10 100 μ 1卵泡液保存/培养1 10个卵母细胞；优选为每 10 μ 1卵泡液保存/培养1个卵母细胞。
3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在用卵泡液保存/培养卵母细胞之前，用TCM-199培养液漂洗卵母细胞，并用卵泡液清洗卵母细胞的步骤。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述卵泡液选自猪或牛的卵泡液；优选地，所述卵泡液选自猪的卵泡液；更优选地，所述猪卵泡液的制备方法包括以下步骤1)抽取猪卵泡液，自然沉降，取上清；2)离心，取上清；幻过滤除菌；优选地，步骤幻之后和步骤幻之前还包括将获得的上清液进行冻融、再次离心取上清；上清液优选在0°C -20°C冻融，进一步优选在-20°C冻融； 进一步优选地，进行冻融、再次离心取上清液的步骤可以根据实际情况重复，并将重复获得的上清液过滤除菌；进一步优选地，所述猪卵泡液通过以下方法制备1)选取直径为2-6mm的猪卵泡，抽取卵泡液，自然沉降15min，取上清；幻15000转/分钟离心15min，取上清，_20°C冻融后再 15000转/分钟离心15min，再反复冻融离心两次，每次取上清，弃沉淀；3)收集上清，过滤除菌。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述卵母细胞选自哺乳动物中猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞，优选为猪卵母细胞，更优选为生发泡期的猪卵母细胞。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法在卵母细胞的体外保存/培养或者在卵母细胞体外成熟的控制和优化中的应用；优选地，所述卵母细胞选自哺乳动物中猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞，优选为猪卵母细胞，更优选为生发泡期的猪卵母细胞。
7.卵泡液在体外保存/培养卵母细胞中作为保存液或培养液，以抑制卵母细胞生发泡破裂中的应用；优选地，所述卵泡液选自猪或牛的卵泡液；更优选地，所述卵泡液选自猪的卵泡液。
8.如权利要求7所述的应用，其中，所述猪卵泡液的制备方法包括以下步骤1)抽取猪卵泡液，自然沉降，取上清；2)离心，取上清；3)过滤除菌；优选地，在制备保存卵泡液时，在步骤幻之后和步骤幻之前还包括将获得的上清液进行冻融、再次离心取上清；上清液优选在0°C -20°C冻融，进一步优选在-20°C冻融；优选地，进行冻融、再次离心取上清液的步骤可以根据实际情况重复，并将重复获得的上清液过滤除菌；更优选地，所述猪卵泡液通过以下方法制备1)选取直径为2-6mm的猪卵泡，抽取卵泡液，自然沉降15min，取上清；幻15000转/分钟离心15min，取上清，_20°C冻融后再15000 转/分钟离心15min，再反复冻融离心两次，每次取上清，弃沉淀；3)收集上清，过滤除菌。
9.一种用于保存/培养卵母细胞的制剂，所述制剂包含猪或牛的卵泡液；优选为猪的卵泡液；优选地，所述猪卵泡液采用权利要求8所述的方法制备。
10.如权利要求9所述的制剂在保存卵母细胞中的应用；优选地，所述卵母细胞选自猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞，更优选为猪卵母细胞，进一步优选为发泡期的猪卵母细胞。
全文摘要
本发明提供了一种体外保存/培养卵母细胞以抑制卵母细胞生发泡破裂的方法。本发明提供的方法采用卵泡液作为卵母细胞体外保存/培养的保存液或培养液，在20至30℃之间在体外保存/培养卵母细胞，以抑制卵母细胞生发泡破裂。这种方法可以大大的提高卵巢卵母细胞在科研和畜牧业生产上的利用率，为科研上利用屠宰场卵巢解除了时间上的限制，便于体外操作时间的安排；生发泡期卵母细胞常温保存/培养有助于提高卵母细胞体外成熟质量，促进核成熟和胞质成熟同步，是一种最佳的不依赖于抑制剂的生理学控制核成熟进程的方法。猪卵泡液易于制取，能够制成商品化制剂。这种方法对于动物胚胎工程以及人类辅助生殖技术研究和应用都有重要意义。
文档编号C12N5/075GK102258004SQ20101019303
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者侯毅, 孙青原, 戚树涛, 杨彩荣, 梁兴伟, 欧湘红, 苗德强, 郭磊 申请人:中国科学院动物研究所