犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用引物及检测方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用引物及检测方法。

背景技术：

犬圆环病毒（Dog circovirus，DogCV）于2012年美国首次报道，随后被认为是犬坏死性血管炎和肉芽肿性淋巴结炎的病原体。临床多表现为犬呕吐、出血性腹泻等症状。DogCV为无囊膜单股环状DNA 病毒，分类地位上属于圆环病毒科圆环病毒属成员。序列分析显示，DogCV基因组大小为2kb左右，具有两个主要的阅读框（ORF）：分别编码复制酶Rep蛋白和衣壳Cap蛋白。近年来，美国、意大利、德国相继报道了该病毒，给犬群健康造成严重的威胁。由于犬圆环病毒是新发现的哺乳动物圆环病毒，目前尚缺乏针对性的检测技术和方法，无法开展相关病原学和流行病学研究，以科学评估该病对犬群的危害及其程度，并制订出针对性的防控措施。因此，迫切需要发展快速、准确的犬圆环病毒检测方法。

荧光定量PCR方法作为一种新技术，在动物传染病中已被成功地应用猪圆环2型、乙脑、禽流感等检测及流行病学调查。荧光定量PCR方法又分为探针法和SYBR GreenⅠ染料法。相比较探针法SYBR GreenⅠ染料法，不需要合成探针，且价格低廉，只需要设计出序列特异的引物。影响结果的引物二聚体和非特异性扩增可以通过融解曲线分析克服。与传统的PCR相比，荧光定量PCR能有效地减少试验过程中产生污染的危险，并以其高灵敏度、高特异性、速度快等优点在病原体的定性和定量检测方面得到了广泛应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对当前犬圆环病毒特异性检测技术手段的缺乏，提供一种犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用引物及检测方法。该实时荧光PCR检测方法的检测灵敏度可达4.67×10¹个拷贝的病毒分子，对于单个样本检测时间为2个小时，可同时进行大批量的样本检测，具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，可以实现对犬圆环病毒快速准确检测并鉴定的目的。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的一方面，提供一种犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用特异性引物，该特异性引物是针对犬圆环病毒ORF2基因设计出的能够检测犬圆环病毒的特异性引物，特异性引物对序列为：

上游引物：5’-AAGTTCCATAGCAACGGGGTCTC-3’；

下游引物：5’-CCCACTGAACCGTTACAGGAGAA-3’。

本发明的另一方面，提供一种利用上述特异性引物检测犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法，该实时荧光 PCR 检测方法还采用SYBR Green I染料进行检测，该实时荧光 PCR 检测方法是将用于检测犬圆环病毒的特异性引物和SYBR Green I染料置于同一反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。

在本发明的另一方面，提供检测犬圆环病毒的实时荧光PCR检测的反应程序，具体为：预变性95℃ 5min；然后95℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec循环40次。

采用本发明犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用引物及检测方法进行犬圆环病毒的特异性检测，具有以下优点：

（1）特异性好，本发明提供的检测用引物对狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型基因组，均无特异性扩增，说明引物对目的基因具有良好的特异性。

（2）灵敏度高，荧光检测技术是极灵敏的检测技术，采用本发明提供的检测用引物进行检测，检测灵敏度可达4.67×10¹个拷贝的病毒分子。

（3）可对产物进行定量，由于荧光信号的强度和每次扩增产物量成意义对应的线性关系，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量。

（4）操作简便，自动化程度高，扩增和检测一步完成。

（5）养殖户通过本发明的犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用引物及检测方法，能够尽快知道是否犬群患有犬圆环病毒，及早采取措施，减少损失。

附图说明

图1为本发明实施例1犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法的有效性试验结果；如图1所示，图中1、2、3、4其中4份犬圆环病毒样品的Ct值均小于等于33，且出现特异性的扩增曲线；图中5为其他样品及阴性对照（超纯水）扩增结果，无Ct值并且无特异性的扩增曲线。

图2为本发明实施例2犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法的特异性试验结果。犬圆环病毒的特异性扩增曲线，Ct值均小于33；其他样品狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型和阴性对照（超纯水）扩增结果，无Ct值并且无特异性的扩增曲线。

图3为本发明实施例3犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法的灵敏性试验结果。阳性模板在4.67×10¹个拷贝数仍有扩增曲线。由图3表明该方法检测灵敏度可达4.67×10¹个拷贝。

具体实施方式

下面结合附图和实施例和附图对本发明做进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件。

实施例1

犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法的有效性试验

1、设计引物

针对犬圆环病毒ORF2基因设计能够检测犬圆环病毒的特异性引物序列：

上游引物：5’-AAGTTCCATAGCAACGGGGTCTC-3’，

下游引物：5’-CCCACTGAACCGTTACAGGAGAA-3’。

上下游引物均由上海生工公司合成，其中SYBR Green I染料购自普洛麦格有限公司。

2、实验所用的病毒和样品

32份犬血液样本采集于广西壮族自治区玉林市，由广西动物疫病预防控制中心兽医实验室提供。

3、提取犬圆环病毒DNA

将32份来自玉林的犬血清按照天根基因组试剂盒（天根生物技术有限公司）说明书提取病毒基因组。

4、实时荧光PCR检测

反应体系为20µL，上游引物、下游引物各1µL，SYBR Green I染料10µL，DNA模板2µL，补超纯水至20µL。在ABI 7500荧光PCR扩增仪上进行扩增反应，设定程序条件为：预变性95℃ 5min；然后95℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec循环40次。

5、试验结果

荧光PCR仪收集荧光信号，自动生成样品扩增曲线。如图1所示1、2、3、4其中4份犬圆环病毒样品的Ct值均小于等于33，且出现特异性的扩增曲线；5为其他样品及阴性对照无Ct值并且无特异性的扩增曲线。扩增产物经测序鉴定为犬圆环病毒，表明设计的引物能特异性检测犬圆环病毒。

实施例2

犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法的特异性试验

1、实验所用的病毒和样品

32份犬圆环病毒组织样品采集于广西壮族自治区玉林市，由广西动物疫病预防控制中心兽医实验室提供。

其他犬源病毒：狂犬病毒（Rabies virus，RV）、犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV ）、犬瘟热病毒（Canine Distemper，CD）、犬副流感病毒（Canine Parainfluenza Virus，CPIV）、犬腺病毒2型（Canine adenovirus type 2，CAV-2）均由军事兽医研究所病毒学与免疫学实验室保存。

2、病毒核酸提取

将将犬圆环病毒样品及其他其他犬源病毒按照天根基因组试剂盒（天根生物技术有限公司）说明书提取病毒基因组。

3、实时荧光PCR检测方法的特异性试验

采用实施例1中所提供的荧光PCR检测方法分别对提取的核酸样品进行检测，以确定方法的特异性，并以构建的犬圆环病毒标准品为对照。

4、试验结果

荧光PCR仪收集荧光信号，生成样品扩增曲线。如图2所示犬圆环病毒标准品的Ct值均小于等于33，且出现特异性的扩增曲线；狂犬病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型以及纯水对照的Ct值均大于33，且无特异性的扩增曲线。表明该荧光PCR检测方法具有良好的特异性。

实施例3

犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法的灵敏性试验

1、实验所需样品

将犬圆环病毒基因克隆测序正确后作为标准质粒，测定质粒浓度和纯度并稀释至4.67×10⁰，4.67×10¹，4.67×10²，4.67×10³，4.67×10⁴，4.67×10⁵，4.67×10⁶，4.67×10⁷，4.67×10⁸拷贝/µL。

2、实时荧光PCR检测方法的灵敏性试验

以稀释好的梯度质粒作为样品，采用实施例1中所提供的荧光PCR检测方法进行检测，以确定方法的灵敏性。

3、试验结果

荧光PCR仪收集荧光信号，自动生成样品扩增曲线。如图3所示，犬圆环病毒基因质粒拷贝数为4.67×10¹和4.67×10⁸时的扩增曲线Ct大于33，拷贝数为4.67×10¹，4.67×10²，4.67×10³，4.67×10⁴，4.67×10⁵，4.67×10⁶，4.67×10⁷，4.67×10⁸的质粒扩增曲线Ct小于33，表明该方法检测灵敏度可达4.67×10¹个拷贝。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心

<120> 犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用引物及检测方法

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagttccata gcaacggggt ctc 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccactgaac cgttacagga gaa 23

<210> 3

<211> 677

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggagtaagtc cccttttaaa gcctgccgcc atattaaaag attttgatga tgatctgtct 60

tgtagagggt cgtatatgaa tggagcctta ttggggtctt ttggttgctc cattgttcct 120

ggtactgtcc ctgggtccag gtgtgatctt gtagcattcc ctcttccctg atcttctccg 180

tcaagatcta gtgctgttct tccaagtacg ttctccatca gtgttctggg ccagttgatc 240

catttagccc ttacgaagat ctttttgaat ttataatatc taaaaggtgg gagatgctgg 300

aaatctcctg tgccgtgaga ggcttgtaag aagtcagtca gtttgaatga cagatggtcg 360

aagttccata gcaacggggt ttctgtctgc ggatcattgg ttggtttgac tggtgctgtc 420

ggccaatcag ctgtcagtgt tctgcgcagt cgcagatgaa acagtttgaa attgttttgg 480

cgccttctcc tgtaacggat caatgggcgt gtcctgtatc tccggcgact tgcccgggca 540

tgtcttcgta cgcgcatgcg ccgtctgaat gttctccttc tgagcctgcg cagagaatga 600

ggatgtggtt agtgacgtca gcgtatcgag gtgcctggca tagtattacc cggcacctcg 660

tcacagacac agcacag 677