血清外泌体miRNAs标志物在地方性砷中毒早期诊断中的应用的制作方法

本发明属于因工程与临床医学
技术领域：
，具体涉及人类地方性砷中毒早期发生相关的血清外泌体微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)标志物及其应用。
背景技术：
：地方性砷中毒简称地砷病，是一种生物地球化学性疾病，是居住在特定地理环境条件下的居民，长期通过饮水、空气或食物摄入过量的无机砷而引起的以皮肤色素脱失或/和过度沉着、掌跖角化及癌变为主的全身性的慢性中毒。地砷病是一种严重危害人体健康的地方病。除致皮肤改变外，无机砷是国际癌症研究中心确认的人类致癌物，可致皮肤癌、肺癌，并伴有其他内脏癌高发。在重病区，当切断砷源后或离开病区，经过多年仍有地砷病的发生，表明由砷引起的毒害可持续存在很长时间，并逐渐显示出远期危害—皮肤改变，恶性肿瘤及其他疾病等。临床上，地砷病多为慢性砷中毒表现。在不同病区，由于携砷介质不同及摄入量的差异，临床表现不尽相同。在轻病区病人往往只有轻的皮肤病变而无明显的临床症状。在重病区病人体征明显，常伴有不同程度的临床症状，同时心血管病、肝病、肿瘤等并发也较多见。地方性砷中毒在全球许多国家流行，目前正威胁着至少22个国家和地区的5000多万人口，已成为世界性严重危害人类健康的公共卫生问题之一，包括由长期饮用高砷水引起的饮水型地方性砷中毒和燃用高砷煤导致室内空气或食物污染引起的燃煤污染型地方性砷中毒，其中后者是我国特有的地方性砷中毒类型，仅流行于贵州(1976年确认)和陕西(2005年确认)两省。我国政府高度重视地方性砷中毒防控问题，“十五”以来持续将其列为国家重点防治疾病和“健康中国2020行动计划”，目前在环境干预、人群行为干预等方面取得瞩目成就。但由于燃煤型砷中毒影响因素复杂，低砷污染状况仍有存在，健康危害具有累积性和难可逆性，停止接触后病情仍可持续发展，特别是机制不明和无特效治疗药物或方案致病人病情未得到明显控制。因此，本发明主要目标就是在燃煤型砷中毒的早期诊断中探索重要生物学标志物，为早期诊断提供可靠依据，使砷中毒在早期得以有效的控制。表观遗传学是指DNA序列不发生改变，但基因表达却发生了可遗传改变的现象，包括DNA甲基化(DNAmethylation)、组蛋白修饰(histonemodification)、非编码RNA(noncodingRNA，ncRNA)及染色质重塑等，其具有可遗传和可逆转等特征；还有报道认为表观遗传学改变可能早于遗传信息改变，且较遗传学改变更为普遍。近年来环境化学物引起表观遗传模式改变与疾病发生关系备受关注，深入研究表观遗传调控机制在地方性砷中毒所致机体损伤和肿瘤中的作用及其过程将成为本发明研究的重点。微小核糖核酸(microRNAs，即miRNAs)是近年刚刚兴起的研究热点，它是一类长约19-23个核苷酸的单链RNA分子，多位于基因组非编码区，进化上高度保守，其通过与靶基因mRNAs的3’UTR区结合后，对靶基因mRNA剪切或抑制翻译而下调蛋白表达水平。miRNAs能调控多种生物学过程，包括细胞周期、凋亡、分化、发育和新陈代谢等生理和病理过程，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。自参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNAs已逐渐成为调控mRNA稳定性和蛋白翻译的研究热点，分别在2002年和2003年两度入选Science杂志年度十大科技突破。现在预测miRNAs至少能调控数千个人类基因，占所有基因的30％以上。随着研究的深入，越来越多的miRNAs被发现。目前，miRNAs与肿瘤的关系已成为研究的重点，已发现若干miRNAs通过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。然而，但目前血清miRNAs与地方性砷中毒等的相互关系报道甚少。外泌体是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，1983年首次于绵羊网织红细胞中被发现，并1987年被Johnstone命名为“exosome”。其内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，最后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。越来越多的证据表明，宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移。发表于《自然》(Nature)杂志上的一篇论文中也证实了肿瘤释放了数百万携带着它们的蛋白质和遗传内容物的囊泡。这些囊泡像“通信船”或“侦察舰”一样，它们确保了受纳器官做好准备招待肿瘤细胞。具体说来，外泌体触发了受纳器官中必要的分子反应——炎症、血管形成等来欢迎肿瘤细胞，使得当肿瘤细胞到达时可以进行增殖。然而，血清外泌体miRNAs与地方性砷中毒等的相互关系尚未见报道。许多证据表明miRNAs可以稳定存在于体液中，包括唾液、尿液、母乳和血液。细胞外的miRNAs可以被装入外泌体或微囊泡中，还能被装载在高密度脂蛋白HDL上，这些都能保护它们不被降解，使它们稳定存在。随着囊泡的运输功能被日益挖掘，外泌体中的miRNAs的作用也受到越来越多的关注。它们通过循环囊泡传递信息，这被认为是细胞间信号交流的第三种途径，与细胞接触依赖的信号传导和通过可溶性分子介导的传导这两条途径一样重要。最新的研究成果发现血清中存在外泌体且携带miRNAs，使得miRNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测，存在显著的疾病特异性，在肺癌、结肠癌中已经证实血清外泌体miRNAs的表达谱可作为早期诊断的潜在生物标志物。这一发现令人振奋，血清外泌体miRNAs作为一类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物，开拓了生物标志物的新境界。然而血清中外泌体miRNAs在地方性砷中毒早期诊断监测中的应用还未得到相应的关注，若能发现稳定的与地方性砷中毒早期发病相关的特异血清外泌体miRNAs作为生物标志物，并研发相应疾病的诊断、监测试剂盒，不仅在该领域处于国际领先地位，可创造令人瞩目的经济效益，对我国地方性砷中毒的防治也将是一次强有力的推动。技术实现要素：针对上述技术问题，本发明提出一种与地方性砷中毒早期诊断相关的血清外泌体miRNA标志物及其应用。本发明的第二个目的是提供上述miRNAs标志物的特异性引物。本发明还有一个目的是提供上述血清外泌体microRNA标志物及其特异性引物在制备地方性砷中毒早期诊断试剂盒中的应用。本发明再有一个目的是提供人类地方性砷中毒早期诊断或监测的试剂盒。本发明的目的是通过下列技术方案实现的：一种与地方性砷中毒早期诊断相关的血清外泌体miRNA标志物，该标志物为has-miR-155、has-miR-191的组合。hsa-miR-155的序列为UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU(SEQIDNo.1)，hsa-miR-191的序列为CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG(SEQIDNo.2)。所述的miRNA标志物的特异性扩增引物，其特征在于，该引物为：has-miR-155的上游引物序列为SEQIDNo.3，下游引物序列为SEQIDNo.4；has-miR-191的上游引物序列为SEQIDNo.5，下游引物序列为SEQIDNo.6。所述的miRNA标志物在制备地方性砷中毒早期诊断试剂盒中的应用。所述的miRNA标志物的特异性扩增引物在制备地方性砷中毒早期诊断试剂盒中的应用。一种地方性砷中毒早期诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血清外泌体miRNAs中has-miR-155和has-miR-191。所述的诊断试剂盒，该试剂盒中含有所述的miRNA标志物的特异性扩增引物。所述的诊断试剂盒，该试剂盒中还包括PCR技术常用的试剂。所述试剂是能够测定这些血清外泌体microRNA标志物在血清外泌体中表达量的试剂。本发明的另外一个目的是提供本发明的目的是提供提取血清外泌体的方法及鉴定。本发明详细描述如下：本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了RT-PCR方法、TaqManmiRNAArray、Real-timePCR(染料法)方法的一种或几种进行检测。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：一、研究对象选择和分组依据：A组：健康对照组(n＝80，20人芯片筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)，无其他全身性重大疾病。B组：重度子痫早期组(n＝80，20人芯片筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)，无其他全身性重大疾病。二、血液血清分离及前处理：(1)新鲜肝素抗凝血5ml于离心机3000rpm离心5min，取上清每250μl分装至洁净1.5mlEP管中。(2)250ul血清加入63ulExoQuick试剂(4:1)，4度孵育30min-1h，孵育后，1500g-10000g离心30min-1h。(3)吸去上清，1500g离心5min，小心吸尽液体用原样本体积的1/10的去离子水溶解沉淀，即为外泌体。(4)一部分用于透射电镜检测，先用戊二醛固定。(5)一部分所提取的外泌体沉淀中加入1mlTrizol，混匀(反复吹打或涡旋)，4℃放置10min。(6)按比例(1mlTrizol：200ul氯仿)加入氯仿200ul，剧烈振荡，4℃放置15min。(7)4℃12000×g离心15min。吸取上层水相至新EP管(350ml)。(8)按比例(1mlTrizol：500ul异丙醇)加入异丙醇500ul，混匀，4℃放置10min。(9)4℃12000×g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。(10)按比例(1mlTrizol：1ml75％乙醇)加入75％乙醇1ml，温和振荡。(11)4℃12000g离心5min，尽量弃上清(重复75％乙醇洗涤一次)。(12)室温晾干，加适量DEPC水溶解沉淀RNA。(13)-70℃保存处理后的样本。本发明实验中使用的外泌体提取试剂均来自ExoQuickTMExosomePrecipitationSolution(货号EXOQ20A-1)这个试剂盒，下同。三、血清外泌体鉴定。血清提取的外泌体用适量浓度的戊二醛固定后进行透射电镜检测。四、Real-timePCR方法测量血清外泌体miRNAs表达量。1.取经前处理的血清外泌体RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品。按下表所示配制反转录体系：2.将PCR管反复颠倒混匀3次后做简短离心，冰上放置5分钟。3.将PCR管放入PCR仪进行反转录，反应条件如下所示：反转录产物保存于4℃冰箱以用于下一步的预扩增。4.逆转录后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增：预扩增的反应条件如下表所示：降至4℃后，将预扩增产物保存于4℃冰箱以用于下一步的Real-timePCR反应。5.简短离心后，加入0.1TE(Ph8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的Real-timePCR。预扩增产物进行Real-timePCR按下表所示配制反应体系：*考虑到吸液损失而放量12.5％。6.检测并比较健康对照、地方性砷中毒早期组血清外泌体样本中miRNAs表达量的差异。检测到的存在差异表达的健康对照和地方性砷中毒早期患者血清外泌体miRNAs包括hsa-miR-155、hsa-miR-191。这些miRNAs在地方性砷中毒早期患者中的拷贝数明显低于健康对照组，并且这些miRNAs在血清外泌体中表达具有稳定性。五、Real-timePCR方法验证血清外泌体miRNAs表达量1.设计2条目标miRNAs的引物：运用Stem-loopPCR方法设计引物。2.加入荧光染料进行Real-timePCR反应。3.选择独立人群(对照和病例各30人)进行Real-timePCR检测，结果一致的有3条miRNAs，具体的为：hsa-miR-155、hsa-miR-191。因此，最终确认为存在差异表达的健康对照和地方性砷中毒早期血清外泌体miRNAs包括hsa-miR-155、hsa-miR-191。它们在地方性砷中毒早期血清外泌体中的拷贝数都显著低于健康对照组，并且这些miRNAs在血清中表达具有稳定性。五、诊断试剂盒制备方法：根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于地方性砷中毒早期动态监测的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定受试者血清外泌体中稳定存在且可检测的成熟hsa-miR-155、hsa-miR-191的引物和工具。诊断试剂盒包括一批血清外泌体miRNAs引物，还可以包括Taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸等试剂的混合物。有益效果：本发明采用血清外泌体miRNAs作为地方性砷中毒早期评价的标志物的优越性在于：(1)血清外泌体易于提取，需要血清量少，减少检测者血清抽取量。(2)血清外泌体miRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高地方性砷中毒早期诊断的敏感性和特异性，相比于传统的生物标志物(例如mRNA和蛋白质)，外泌体miRNAs更加稳定并易于筛选及精确地定量分析，从而成为理想的新一代早期诊断和预后评估的生物标志物。(3)本发明提供的血清外泌体miRNA标志物可用作地方性砷中毒早期诊断标志物，可避免侵入性诊断，并可在早期进行辅助诊断，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。(4)本发明采用符合地方性砷中毒早期和健康对照人群的样本进行验证，证明这几种标志物表达量存在显著性差异并具有稳定性，以说明该标志物具有特异性，可作为标志物使用。(5)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选多种血miRNAs，应用Real-timePCR等方法进行二次验证和独立人群验证，保证了该血清外泌体miRNA生物标志物的可靠性。附图说明图1为本发明实施例2的实验效果图。图2为本发明实施例5的实验效果图。具体实施方式下面通过实施例对本发明作进一步地说明。实施例1：对研究对象选择和分组依据于2013年12月从合作单位贵阳医学院搜集到符合要求的地方性砷中毒早期患者及健康对照组血液样品，通过对样品资料的整理，从中选择了符合要求的80例健康对照、80例地方性砷中毒早期患者作为Real-timePCR检测miRNAs表达的实验对象。具体的样品归类标准如下：A组：健康对照组(n＝80，20人芯片筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)，无其他全身性重大疾病。B组：地方性砷中毒早期组(n＝80，20人芯片筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)，经临床诊断为地方性砷中毒早期，无其他全身性重大疾病。实施例2：血清外泌体的提取鉴定制备血清外泌体样品：a)取250ul血清；b)加入63ulExoQuick试剂(4:1)，轻轻混匀，4度孵育30分钟-1小时，孵育后，1500g-10000g离心30分钟-1小时，弃上层废液；c)吸去上清后，再用1500g离心5分钟，小心吸尽上层液体，并用原样本体积的1/10的去离子水溶解沉淀；d)加入适量2.5％戊二醛4度冰箱固定2-3小时后，送去样本检测室进行透射电镜检测前处理，最终鉴定外泌体，如图1所示。实施例3：外泌体RNA的提取制备外泌体RNA：a)提取的外泌体沉淀中加入1mlTrizol，混匀(反复吹打或涡旋)，4℃放置10min；b)按比例(1mlTrizol：200ul氯仿)加入氯仿200ul，剧烈振荡，4℃放置15min；c)4℃12000g离心15min，吸取上层水相至新EP管(350ml)；d)按比例(1mlTrizol：500ul异丙醇)加入异丙醇500ul，混匀，4℃放置10min；e)4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；f)按比例(1mlTrizol：1ml75％乙醇)加入75％乙醇1ml，温和振荡；g)4℃12000g离心5min，尽量弃上清(重复75％乙醇洗涤一次)；h)室温晾干，加适量DEPC水溶解沉淀RNA；i)-70℃保存处理后的样本。实施例4：TaqManmiRNAarray筛选制备cDNA样品：通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括0.5μlmiRNA特定引物RT缓冲液、2μl5逆转录混合液(Vazyme公司)及无核酸酶水。反应步骤为50℃孵育15min，85℃孵育2min。(若针对不同miRNA则采用对应的miRNART引物按上述步骤进行)逆转录之后的按下表反应体系配制进行预扩增：预扩增的反应条件如下表所示：将预扩增产物简短离心后，加入0.1×TE(pH8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的实时荧光定量PCR(qPCR)。预扩增产物进行qPCR按下表所示配制反应体系：*考虑到吸液损失而放量12.5％。检测并比较健康对照、地方性砷中毒早期血清外泌体中miRNAs表达谱的差异，筛选出有3倍差异以上的miRNAs。经生物信息学分析和动物实验结果，选定其中2条作为候选并进行进一步验证，具体为：hsa-miR-155、hsa-miR-191。实施例5：Real-timePCR方法测量血清外泌体miRNAs的表达量设计引物，分别对60例健康对照、60例地方性砷中毒患者的血清外泌体进行各miRNAs的定量Real-timePCR检测。(1)制备cDNA样品：提取的外泌体RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括0.5μlmiRNA特定引物缓冲液RT(20μM)、2μl5×逆转录混合液(Vazyme公司)及无核酸酶水。反应步骤为50℃孵育15min，85℃孵育2min。(2)Real-timePCR：染料法：取1μlcDNA模板，加入5μlSYBRGreen染料混合物Vazyme公司，0.2μlROX混合液，0.5μl20μM上述单一miRNA对应的正向引物，0.5μl20μM上述单一miRNA对应的反向引物，2.8μl无核酸酶水，10μl体系进行荧光定量PCR。使用的仪器是ABIPrism7300荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是：95℃、20秒进行1个循环→95℃、10秒，60℃、20秒，70℃、30秒进行40个循环。检测比较健康对照、地方性砷中毒早期患者血清外泌体样本中miRNAs表达量的变化，各组样品血清外泌体miRNAs的表达量比值可用方程2-(ΔΔCt)表示，其中ΔCt＝Ct(group1)-Ct(group2)。为了保证每次实验间的可比性，我们在每板上都设置了U6，以其表达量作为内参调整计算表达量。从结果分析得出，hsa-miR-155、hsa-miR-191这2条miRNAs在各组间均有显著差别，如图2所示，非参数的趋势性检验也显示了相同的差异。实施例6用于地方性砷中毒早期诊断和监测的miRNA诊断试剂盒的制作：首先通过测序的方法和Real-timePCR方法确定正常人和地方性砷中毒早期患者血清外泌体中有一个以上拷贝的miRNA。然后通过定量PCR等技术筛选与地方性砷中毒早期相关的一类人血清外泌体miRNA，作为预测是否患有地方性砷中毒早期以及诊断的指标。最后筛选出对应的血清miRNA的数量控制在几条，这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。此试剂盒包括一批血清miRNA引物，其中miRNA的引物包括hsa-miR-155、hsa-miR-191、U6的正反向引物(见表1)。还可以有相关PCR技术常用的试剂，如Taq酶、PCR缓冲液、MgCl2、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、染料等试剂，这些试剂也可采用相应的市售产品，也可以购买所需试剂的混合液。此类试剂盒的价值在于只需要一次抽出少量(1～2ml)血液，即可检测血清外泌体miRNA标志物的变化趋势，再通过该变化趋势预测地方性砷中毒早期发生可能性或诊断地方性砷中毒早期病，并易于进行动态监测和观察治疗效果。具体试剂盒组成如下：以下两对引物：SEQIDNO.3和SEQIDNO.4，SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，各20μM0.5μl。试剂盒中还可以含有5逆转录混合液(Vazyme公司)及无核酸酶水。试剂盒中还可以含有内参U6的正反向引物一对(表1)。或者试剂盒中除正向引物外还含有0.5μl20μM通用反向引物，10μlTaqMan通用PCR混合液，6.6μlH2O。试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于miRNA含量检测的相应试剂。在上述一系列研究结果的基础上，本发明人证明了采用hsa-miR-155、hsa-miR-191能够很好地将地方性砷中毒早期患者和健康对照分开。表1引物名称对应miRNA引物序列hsa-miR-155-FACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGAThsa-miR-155-RCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCCCTAThsa-miR-191-FACACTCCAGCTGGGCAACGGAATCCCAAAAGhsa-miR-191-RCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGCTGCTURPTGGTGTCGTGGAGTCGU6-FCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACU6-RGCTTCACGAATTTGCGTGTCATCCTTGCF:上游引物，R:下游引物。序列表<110>南京医科大学<120>血清外泌体miRNAs标志物在地方性砷中毒早期诊断中的应用<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>23<212>RNA<213>hsa-miR-155<400>1uuaaugcuaaucgugauaggggu23<210>2<211>23<212>RNA<213>hsa-miR-191<400>2caacggaaucccaaaagcagcug23<210>3<211>31<212>RNA<213>hsa-miR-155上游引物<400>3acactccagctgggttaatgctaatcgtgat31<210>4<211>44<212>RNA<213>hsa-miR-155下游引物<400>4ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagacccctat44<210>5<211>31<212>RNA<213>hsa-miR-191上游引物<400>5acactccagctgggcaacggaatcccaaaag31<210>6<211>44<212>RNA<213>hsa-miR-191下游引物<400>6ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagcagctgct44当前第1页1 2 3