一种无乳链球菌的恒温热隔绝式PCR检测方法与流程

本发明涉及一种无乳链球菌的恒温热隔绝式PCR检测方法，属于微生物检测技术领域。

背景技术：

无乳链球菌(S.agalactiae)属兰氏分群中的B群链球菌，革兰氏阳性。近年来，由无乳链球菌感染而引起的细菌病给农牧业造成了巨大的损失，传统的鉴定无乳链球菌的方法主要是通过细菌分离、血清型鉴定、生化鉴定等经典方法，但由于操作繁琐、耗时长、检出率低，对该菌准确检测和及时治疗十分不利。针对无乳链球菌的其他检测技术如ELISA、免疫组化及免疫荧光等技术也有报道，但也都不同程度地存在某些缺点。至上个世纪八十年代末聚合酶链式反应技术诞生，极大地推动了分子生物学技术的发展，成为核酸检测最重要的手段之一，但常规PCR方法仍存在其缺点，如需昂贵的仪器设备，训练精良的操作人员，且实验操作复杂时间长等。

恒温热隔绝式PCR，是以Rayleigh-Benard对流系统为原理的一种快速、低耗的核酸扩增平台，Pockit即为利用此原理设计的一款便携式核酸分析仪。恒温热隔绝式PCR可以在一个简单的加热装置中30分钟内迅速扩增出大量扩增片段，该系统将热对流的速率控制在每一圈15–20秒，其扩增效率远高于传统PCR，可大幅缩减反应所需要时间。此外，恒温热隔绝式PCR的无乳链球菌核酸检测方法与普通PCR方法相比拥有相同的敏感性，且仪器设备轻巧便携，尤其适用临床或基层实验室使用。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种无乳链球菌的恒温热隔绝式PCR检测方法，该检测方法新颖、快速准确、操作便捷。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种无乳链球菌的恒温热隔绝式PCR检测方法，包括以下步骤：

1)设计引物对：根据无乳链球菌的sip序列基因序列设计引物对；

2)提取样品：提取样品DNA；

3)PCR扩增：采用步骤1)中得到的引物对，以步骤2)中提取的样品DNA为模板，进行恒温热隔绝式PCR扩增；

4)检测：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

作为优选，步骤1)中，所述引物对的序列为：

上游引物sip-F的序列：

TCAGTCAGTCAGTCAACAACAGTATCACCAG；

下游引物sip-R的序列：

CACTCTAGGGGCTGCTACAGTTCTTACCG。

作为优选，步骤3)中，恒温热隔绝式PCR 50μL反应体系为：Prime Star DNA Polymerase 25μL，引物对，双蒸水补足至50μL；

恒温热隔绝式PCR的反应条件为：反应在Pockit核酸分析仪上进行，反应程序为：光学波长520nm，时间20-30min。

再优选地，反应体系中，所述引物对为20nmol/L的上下游引物各0.5μL。

作为优选，步骤4)中，琼脂糖凝胶电泳的浓度为1.5％。

作为优选，步骤4)中，检测琼脂糖凝胶中是否存在单一、大小为150bp的扩增条带，如果存在，则说明样品中含有无乳链球菌。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明解决了现有技术检测无乳链球菌周期长、检测成本高，不能应用于基层及现场使用等问题，本发明中的PCR反应时间缩短，最短时间10min时也可检测到条带，简单迅速；

2、本发明基于检测无乳链球菌的保守基因——表面免疫蛋白sip基因序列，sip蛋白是该菌重要的吸附和定植因子，具有高度的保守性，广泛存在并具有很强的免疫原性，检测准确性高；

3、检测成本低，所用便携式Pockit核酸分析仪成本为普通PCR仪的十分之一，仪器设备轻巧便携，灵敏度高，检测下限10²个拷贝数，尤其适用临床或基层实验室使用。

附图说明

图1为实施例2特异性评估试验的电泳图；

图2为实施例3恒温热隔绝式PCR扩增的电泳图；

图3为实施例3普通PCR扩增的电泳图；

图4实施例4速度评估试验的电泳图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

一种无乳链球菌的恒温热隔绝式PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)设计引物对：根据无乳链球菌的sip序列基因序列设计引物对；所述引物对为：

上游引物sip-F的序列：

TCAGTCAGTCAGTCAACAACAGTATCACCAG；

下游引物sip-R的序列：

CACTCTAGGGGCTGCTACAGTTCTTACCG。

2)提取样品：提取样品DNA；

3)PCR扩增：采用步骤1)中得到的引物对，以步骤2)中提取的样品DNA为模板，进行恒温热隔绝式PCR扩增；

恒温热隔绝式PCR 50μL反应体系为：Prime Star DNA Polym erase 25μL，浓度为20nmol/L的上下游引物各0.5μL，双蒸水补足至50μL；

反应条件为：反应在Pockit核酸分析仪上进行，反应程序为：光学波长520nm，时间20-30min；

Prime Star DNA Polymerase购于宝生物工程(大连)有限公司)，

上下游引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成；

本发明所使用的POCKITTM核酸分析仪(The POCKITTM Nu cleic Acid Analyzer；POCKIT)是设计用来执行恒温热隔绝式聚合酶连锁检验(insulated isothermal polymerase chain reaction；iiPCR)。该机器以iiPCR为基础的分析方式，且配备有二种光学波长(520nm,550nm)多目标之侦测器。使用机器一次，可在一个小时内，进行8个核酸样本检测并得到结果；

4)检测：浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；检测琼脂糖凝胶中是否存在单一、大小为150bp的扩增条带，如果存在，则说明样品中含有无乳链球菌。

实施例1

pMD-18T-sip重组载体的构建

根据无乳链球菌sip基因的序列设计引物对：

以基因组DNA为模板，扩增sip全长序列，目的片段连接pMD-18T载体，阳性克隆送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，测序结果经Blast比对，与sip基因序列的相似性高达99％，说明成功获得了sip基因，应用于后续试验。

实施例2

特异性评估试验

对临床分离并由本实验室保存的无乳链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、乳房链球菌及停乳链球菌进行了恒温热隔绝式PCR扩增反应，设置实施例1中的重组载体的质粒和无菌dd H₂O分别为阳性和阴性对照。

特异性评估试验检测结果见图1，图中泳道1-8分别为：无乳链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌、阳性对照和阴性对照，泳道M：DL2000marker。从图1中可以看出，除了无乳链球菌样品及阳性对照外，其余样品的扩增结果均未见单一的目的条带，表明该方法特异性良好。

实施例3

敏感性评估试验

提取实施例1中所构建重组载体的质粒，用双蒸水做10倍梯度稀释，取拷贝数为10⁶CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL、10³CFU/mL、10²CFU/mL、10¹CFU/mL的6个浓度梯度分别为模板。

恒温热隔绝式反应体系同具体实施方式；

普通PCR采取50μL反应体系：2×PCR Mix 25μL，终浓度为50nmol/mL的上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，最后用无菌dd H₂O补足至50μL；

琼脂糖凝胶电泳分别检测恒温热隔绝式PCR和普通PCR扩增的产物。

敏感性评估试验结果见图2和图3，图2为恒温热隔绝式PCR的结果，图3为普通PCR结果。泳道1-6分别为：拷贝数为10⁶CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL、10³CFU/mL、10²CFU/mL、10¹CFU/mL的重组载体的质粒，泳道7为以无菌ddH₂O作的阴性对照，泳道M：DL2000marker。从图2和图3比较看出，恒温热隔绝式PCR比普通PCR具有更高的敏感性，高达10²个拷贝数，说明该PCR方法具有较好的灵敏性。

实施例4

速度评估试验

采用具体实施方式中的PCR 50μL反应体系进行恒温热隔绝式PCR扩增，反应条件中的反应时间分别设置为10min、15min、20min、30min，得到扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

检测速度评估试验结果见图4，泳道1-4分别为：PCR反应时间10min，15min，20min，30min，泳道5：以无菌ddH₂O作阴性对照，泳道M：DL2000marker。从图4中可以看出，当反应时间为10min，琼脂糖凝胶电泳检测，可见清晰单一的目的条带，说明恒温热隔绝式PCR反应10min即可获得检测结果，表明该方法检测速度大大优于普通PCR所需的2-3小时。

实施例5

无菌采集100份奶牛乳样，分别提取样品DNA，采用引物对：

上游引物sip-F的序列：

TCAGTCAGTCAGTCAACAACAGTATCACCAG；

下游引物sip-R的序列：

CACTCTAGGGGCTGCTACAGTTCTTACCG；

以样品DNA为模板，进行恒温热隔绝式PCR扩增：

恒温热隔绝式PCR 50μL反应体系为：Prime Star DNA Polym erase 25μL，浓度为20nmol/L的上下游引物各0.5μL，双蒸水补足至50μL；

反应条件为：反应在Pockit核酸分析仪上进行，反应程序为：光学波长520nm，时间20min；

检测：浓度为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，检测到其中14个样品的琼脂糖凝胶中存在在单一、大小为150bp的条带，说明样品中含有无乳链球菌。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。