基于巢式PCR的桑椹缩小性菌核病病原菌早期快速检测方法与流程

本发明属于植物病害防治领域，涉及一种检测方法，具体涉及一种基于巢式PCR的桑椹缩小性菌核病病原菌早期快速检测方法。

背景技术：

在包括中国、印度在内的东亚、中亚及南亚地区，桑树作为一种重要的用于养蚕的经济植物被广泛栽种，人们主要利用其桑叶喂养家蚕，而在包括土耳其和希腊在内的大多数欧洲国家，人们栽种桑树主要是用来生产桑椹。桑椹作为功能性食品的潜在来源，因具有众多的生物活性及药理作用而备受关注。研究表明其具有很好的抗氧化、消炎、保护神经、抗癌、降血糖及降血脂等众多活性。随着蚕桑产业的转型及人们对桑椹众多保健、药理活性的认识，国内逐渐新兴大量果桑及果叶两用桑园。发展果桑不仅是土地增收的一个新兴产业，也是蚕桑转型和升级改造的一大途径。果桑栽培面积逐年大幅度增加，仅重庆市的果叶两用桑种植面积累计达数十万亩。但其极易感染致命的菌核病(俗称桑白果病，是肥大型菌核病、缩小性菌核病、小粒性菌核病的统称)，严重时发病率高达90％以上，毁产绝收，如防治不及时，连年重复感染，使桑农蒙受严重经济损失。该病成为了阻碍果桑产业化发展的瓶颈。

桑椹菌核病是果桑产业目前所面临的最致命病害，其在我国长江中下游地区及韩国报道较多，其菌核可在土壤中存活数年，循环侵染桑椹，发病严重时甚至颗粒无收。

目前桑椹菌核病的检测和诊断采用的是传统方法，即根据桑椹发病症状进行经验性粗略判断，或者采集样本进行病原菌的分离纯化，然后根据柯赫氏法则进行确诊。该方法具有以下缺点：

1、需等到表现出相关症状后才能发现染病。但此时已是“癌症晚期”，几乎无可救药，即便喷药防治，也纯属“亡羊补牢”，见效甚微。因为该病从病原菌浸染到桑果大量发病，历程很短，病势凶猛，一旦显示症状，桑园中大部分病果已至感染后期，全是菌包不可食用，损失惨重。

2、耗时长、经验性强。要确诊，需要分离纯化出病原菌，然后进行形态学观察、常规分子鉴定、反接感染等手段进行确诊，耗时长达数十天，甚至比桑果期都长。

因此，在前人研究的基础之上开发出新型快速、精准的桑椹菌核病病原菌检测方法具有重要的现实意义，其不仅能实行早期预测预报，有更充分的时间采取防治措施，同时还能对新桑园及引进种苗等进行检疫。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于巢式PCR的桑椹缩小性菌核病病原菌早期快速检测方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

基于巢式PCR的桑椹缩小性菌核病病原菌早期快速检测方法，包括以下步骤：

(1)以CTAB法提取的组织样品DNA作为模板，采用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增；

(2)以第一轮产物为模板进行第二轮PCR扩增，巢式引物采用核地杖菌的特异性引物，序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

(3)根据步骤(2)的扩增条带诊断桑椹缩小性菌核病。

优选的，步骤(1)中的样品为桑椹。

优选的，步骤(1)中，第一轮PCR扩增的条件如下：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸50s，32个循环，72℃延伸10min，4℃，∞。

优选的，步骤(1)中，通用引物ITS1/ITS4的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

优选的，步骤(2)中，第二轮扩增条件类似第一轮，将退火温度设置成56、58、60、62或64℃等不同梯度，以此找到每种引物最适条件。

进一步优选的，第二轮扩增的退火温度为56、58、60或62℃。

一对核地杖菌引物，序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

上述的一对核地杖菌引物的筛选方法，是以桑实杯盘菌、肉阜状杯盘菌、核盘菌及桑茎点霉为对照，将NCBI中的相应病菌ITS序列，以ClustalX 2进行多序列比对，ESPript 3.0进行差异分析，Primer 5.0进行引物的设计及评估而得。

本发明的有益效果在于：

真菌基因组编码核糖体的基因中，由18S、5.8S及28S rDNA组成一个转录单元，其中的间隔区为内转录间隔区域(Internal Transcribed Spacer，ITS)。ITS区域包括ITS1及ITS2两个区域，其中ITS1位于18S和5.8S之间，ITS2位于5.8S和28S之间。由于ITS1和ITS2进化相对迅速，具有一定的种间特异性和种内保守性，已经成为真菌(尤其是丝状真菌)分类鉴定的研究重点。本发明采用了巢式PCR，其具有快速、高特异性等特点，以ITS作为第一轮扩增引物，特异性巢式引物作为第二轮扩增引物进行桑椹菌核病病原快速检测，方法可行，且具有较广的退火温度，能实行早期预测预报，有更充分的时间采取防治措施，同时还能对新桑园及引进种苗等进行检疫。经验证，本发明的检测方法具有极佳的准确性及特异性，并大大提高了检测灵敏度。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为不同病原菌ITS序列比对结果；

图2a和图2b为不同退火温度的巢式PCR结果，其中的6个泳道分别为M-marker，1-56℃，2-58℃，3-60℃，4-62℃，5-64℃；图2a为sample1的结果，图2b为sample2的结果；

图3a和图3b为快速检测方法的应用结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

材料与试剂

材料：采于重庆市北碚区西里蚕种场桑园及重庆市蚕业科学技术研究院桑园的病桑果，见表1。

表1.所用两份材料

试剂：主要试剂如表2所示。

表2.主要试剂

相关试剂的配置：

1M Tris-HCl的配置：精确称量121.1g Tris置于1L烧杯中。加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。加入约42mL浓盐酸调节pH到8.0。将溶液定容到1L。高温高压灭菌后，室温保存。

0.5M EDTA(pH 8.0)的配置：在400mL水中加入90.05g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2·2H2O)，搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0(约10g NaOH颗粒)，定容至500mL，高压灭菌。

4×CTAB：CTAB 4g，NaCl 16.364g，1M Tris-HCl 20mL(PH8.0)，0.5M EDTA 8mL。先用70mL ddH₂O溶解，定容至100mL并高压灭菌。使用前加1mLβ-巯基乙醇。

仪器与设备：

试验所用主要仪器设备如表3所示

表3.主要仪器设备

实施例1：

巢式引物的设计：

从NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)上下载传统三种(肥大性(桑实杯盘菌)、小粒性(肉阜状杯盘菌)、缩小性(核地杖菌))桑椹菌核病病原菌ITS序列(核盘菌及桑茎点霉为对照)，以ClustalX 2进行多序列比对，ESPript 3.0进行差异分析，Primer 5.0进行引物的设计及评估，得到每种桑椹菌核病病原菌的特异性引物，其比对结果如图1所示。

所下载相关序列如表4所示。

表4.桑椹菌核病病原菌的ITS序列登录号

引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

桑椹菌核病快速检测方法的建立：

以巢式PCR作为快速检测桑椹菌核病病原菌的方法，以CTAB法(刘丽，张永军，许长征，罗锋，一种改良的CTAB法提取产多糖真菌DNA，中国生物工程杂志，2014，34(5)：75-79)提取的组织样品DNA作为模板，采用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增，引物序列(本文所列引物序列均默认为5′—3′方向)为：ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG，如SEQ ID NO.3所示)与ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC，如SEQ ID NO.4所示)(购自华大基因)，以第一轮产物为模板进行第二轮PCR扩增，巢式引物采用前述的相应特异性引物，扩增体系均采用25μL体系，具体用量如表5所示。

表5.PCR扩增体系具体用量

第一轮PCR扩增条件如表6所示。

表6.第一轮PCR扩增参数

第二轮扩增条件类似第一轮，将退火温度设置成56、58、60、62或64℃等不同梯度，以此找到每种引物最适条件。

实施例2：

快速检测方法的验证

引物特异性的理论检验：

将实施例1中设计的引物带入常见桑树真菌病害ITS序列中进行比对，对其特异性进行初步检验。

引物特异性的实践检验：

以两份材料(详见表1)对实施例1中建立的方法进行检验，对表1中的材料进行扩增。

将巢式PCR扩增后的产物通过胶回收试剂盒回收后链接至pMD 19-T载体，连接体系如表7所示。

表7.连接体系

充分混匀后，16℃连接4h。

连接产物转化感受态大肠杆菌后于Amp(ampicillin，氨苄青霉素)抗性平板上进行筛选，挑斑扩增后，进行菌液PCR检测，并将阳性克隆菌液送至华大基因测序。

快速检测方法的初步应用：

2016年春季于重庆市北碚区不同地区桑园桑椹菌核病高发田块采集未表现病症且未成熟的桑椹，共计被分作14份，具体情况见表8，采用上述方法进行检测。

表8.所采集的未成熟桑椹

实施例3：

实施例2的实验结果与分析：

不同菌核病病原菌ITS序列比对结果：

利用ClustalX 2进行比对后发现，同一病原菌不同菌株ITS序列无差别，故最终选取桑实杯盘菌、肉阜状杯盘菌、核地杖菌、核盘菌和桑茎点霉五组进行比对分析，其结果如图1所示，利用Primer 5.0结合图1所设计的引物如表9所示。

表9.所设计出的巢式引物序列

菌核病快速检测方法的建立：

利用表9中的引物对表1中的两种材料进行梯度PCR测定，引物SW-SX2F/2R(核地杖菌)的预期片段大小为325bp，测定结果如图2a和图2b所示，从图2a和图2b中可以看出温度对三对引物影响不大，除了64℃时扩增效果不太好以外，56～62℃均可。但图2a和图2b中依稀可见700bp附近有一微弱杂带，其可能为桑树ITS序列；500bp左右有一微弱杂带，可能是所用模板(第一轮扩增产物)浓度过高引起的。且扩增产物浓度略高，存在一些拖尾现象。总体而言，该方法具有一定可行性，且具有较广的退火温度。

桑椹菌核病快速检测方法的验证结果见表10。

表10.引物特异性的理论验证

特异性引物的理论验证如表10所示，从表10中可看出，所设计的引物只能在特定病原菌内检测到，其他桑树真菌病害无相同片段，理论上具有一定的特异性。

通过测序表明，扩增产物同预期片段完全吻合(如SEQ ID NO.5所示)，表明该方法具有准确性及特异性。

SW-SX2F/SW-SX2R 325bp

TTGCGCCTCCGGGTGCTTCAGGGCTTGCTCGCCCGCCGAAGGATATTTAAACTCTGTTTATTATTGTCGTCTGAGTACTATATAATAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTTTGCTTGGTATTGGGCCTCGCCAGTAAAATGGCGGGCCTTAAAATCAGTGTGCGGTGCCGTTG，如SEQ ID NO.5所示。

快速检测方法的应用结果：

利用本发明建立的快速检测方法对14份未表现症状且未成熟桑椹进行检测，结果如图3a和图3b所示，第一轮ITS1/ITS4引物扩增后，仅a1-a4这4份样本扩增出了病原真菌ITS序列(大小500bp左右)，还有c1、c2等8份样品中扩增出了一条700bp左右的条带，其可能为桑树ITS序列。虽然第一轮的ITS1/ITS4引物在14份样本中仅扩增出4份，但第二轮巢式引物扩增后，绝大部分样本均能扩增出相应条带，表明此方法能大大提高检测的灵敏度，能检出常规单次PCR所不能检出的更低限度，同时说明北碚地区主要桑园感染桑椹菌核病情况较为严重。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120> 基于巢式PCR的桑椹缩小性菌核病病原菌早期快速检测方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核地杖菌SW-SX2F

<400> 1

ttgcgcctcc gggtgcttca 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核地杖菌SW-SX2R

<400> 2

caacggcacc gcacactgat t 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITS1

<400> 3

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITS4

<400> 4

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 5

<211> 325

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SW-SX2F/ SW-SX2R

<400> 5

ttgcgcctcc gggtgcttca gggcttgctc gcccgccgaa ggatatttaa actctgttta 60

ttattgtcgt ctgagtacta tataatagtt aaaactttca acaacggatc tcttggttct 120

ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa 180

tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc cttggtattc cggggggcat gcctgttcga 240

gcgtcatttc aaccctcaag ctttgcttgg tattgggcct cgccagtaaa atggcgggcc 300

ttaaaatcag tgtgcggtgc cgttg 325