基于巢式PCR的桑椹缩小性菌核病病原菌早期快速检测方法与流程

文档序号:12249985阅读:来源:国知局

技术特征:

1.基于巢式PCR的桑椹缩小性菌核病病原菌早期快速检测方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)以CTAB法提取的组织样品DNA作为模板,采用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增;

(2)以第一轮产物为模板进行第二轮PCR扩增,巢式引物采用核地杖菌的特异性引物,序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;

(3)根据步骤(2)的扩增条带诊断桑椹缩小性菌核病。

2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤(1)中,第一轮PCR扩增的条件如下:95℃预变性3min;94℃变性30s,55℃退火50s,72℃延伸50s,32个循环,72℃延伸10min,4℃,∞。

3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤(1)中,通用引物ITS1/ITS4的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤(2)中,第二轮扩增条件类似第一轮,将退火温度设置成56、58、60、62或64℃不同梯度,以此找到每种引物最适条件。

5.一对核地杖菌引物,其特征在于,序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

6.权利要求5所述的一对核地杖菌引物的筛选方法,其特征在于,是以桑实杯盘菌、肉阜状杯盘菌、核盘菌及桑茎点霉为对照,将NCBI中的传统桑椹缩小性菌核病病原菌ITS序列,以ClustalX 2进行多序列比对,ESPript 3.0进行差异分析,Primer 5.0进行引物的设计及评估而得。

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