烟草赤星病菌的LAMP快速检测方法与流程

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种烟草赤星病菌的LAMP快速检测方法，可用于烟草赤星病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于番烟草赤星病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术：

烟草是我国一种重要的叶用经济作物，是国家收入、就业机会和税收的重要来源之一。随着烟草种植年份的延长，烟草上病害的种类也开始增多，这些病害严重影响了我国烟草的品质，其中由交链孢菌（Alternaria alternata）侵染引起的烟草赤星病（Tobacco Brown Spot Disease）是我国烟叶生产上的主要真菌性病害之一，在我国各烟区普遍发生。据报道，在我国湖南、安徽、贵州、云南、陕西、辽宁、浙江、广东、福建、黑龙江、吉林等烟区均有赤星病发生，成为为害最大的一种叶斑病，一般年份发病率为20%～30%，严重的发病率达90%，减少产值达50%以上，对产量、质量影响较大。烟草赤星病具潜育期短、暴发快的特点，在温湿度适宜的条件下，短时间内即可大面积流行，给烟叶生产造成巨大损失，是严重制约我国烟叶生产的一类真菌病害，也是烟草产业可持续发展中亟待解决的问题之一。因此建立烟草赤星病菌快速检测体系，在发病早期对植株是否携带病菌进行快速准确的检测，这对于病害的准确预测预报、制定适时有效的防治措施、控制病害的传播和流行（蔓延）以及减少病害造成的经济损失都具有重要的理论和实际意义。

目前检测植物病原菌的方法很多，主要以传统方法和分子生物学方法为主，即分离培养、致病性测定、症状观察等及先进的分子生物学技术包括DNA 探针、PCR 技术及血清免疫学检测等，传统检测方法所需时间长，一般情况下需要5～7 天，有时达到10～15天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，PCR技术虽能提高检测效率，但是需要专用PCR仪等贵重设备和专业操作人员和电泳观测结果，在基层的农业部门难以大规模推广应用；快速的ELISA方法检测，作为筛选方法具有快速、灵敏的特点，是受到广泛欢迎的筛选方法，但是所使用的试剂价格较高，而且需要配备其专门的昂贵仪器。

环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是日本荣研化学株式会社在2000 年开发的一种继PCR技术发展起来的基于检测遗传物质DNA的一种新的扩增技术。该技术针对待测靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列；其特点是无需特殊的、昂贵的检测仪器，只需简单的恒温设备或者是加热块，扩增结果可直接观察焦磷酸镁沉淀或者加入显色剂进行判断，可以满足现场检测的需要，近年来已广泛用于各种病原检测。目前尚未见应用LAMP技术用于检测烟草赤星病菌的相关技术报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种烟草赤星病菌的LAMP快速检测方法，针对现有技术中对烟草赤星病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了烟草赤星病菌新的分子检测方法，对烟草赤星病菌进行LAMP检测，检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。

实现本发明的目的包括下列步骤（技术方案）：

1. 烟草赤星病菌LAMP检测特异性引物的设计：通过测定烟草赤星病菌（Alternaria alternata）和其它病原菌的核糖体转录间隔区（ITS）基因，对链格属不同种间ITS基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)设计烟草赤星病菌特异性LAMP引物组，由F3、B3、FIP和BIP组成，引物序列如下：F3：5’-TCTCTTGGTTCTGGCATCGA-3’，B3：5’-GCG AGTCTCCAGCAAAGC-3’，FIP：5’-GGCGCAATGTGCGTTCAAAGAT-GAACG CAGCGAAATGCGATA-3’，BIP：5’-TGGTATTCCAAAGGGCATGCCT-GACAA GACGCCCAACACC- 3’。

2. 烟草赤星病菌LAMP检测方法的建立，包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组DNA。

用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB 法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min^-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。

用于检测植物组织中存在烟草赤星病菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增；

用于检测土壤样品中存在烟草赤星病菌时，采用土壤DNA提取试剂盒，提取DNA。

（2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；

（3）LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；

（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在烟草赤星病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，不存在烟草赤星病菌。

本发明的有益效果：本发明建立了烟草赤星病菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的LAMP检测技术体系，可用于烟草赤星病菌的检测，或用于烟草赤星病的发病前期、初期检测，对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强：4个特异性引物共识别序列的6个不同区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性极高；

2、灵敏度高：本发明对烟草赤星病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg/ μL，具有很高的灵敏性；

3、快速：应用本发明检测方法，可在1～1.5h 得到检测结果，而以往的PCR或巢式PCR检测需4～6h才可得到检测结果，本发明所述方法大大缩短了操作时间，方便快速；

4、应用性好：本发明LMAP扩增反应在一个温度下扩增，不需要昂贵的PCR扩增仪，便于基层推广使用；

5、检测结果直观，肉眼可判断：本发明扩增产物可通过加显色剂进行染色，绿色为阳性，即待测样品中含烟草赤星病菌，橙色为阴性，说明待测样品中不含烟草赤星病菌，肉眼可判断检测结果，无需电泳检测及凝胶成像。

附图说明

图1 为本发明烟草赤星病菌的LAMP特异性检测。图中1-4为烟草赤星病菌，5-7分别为番茄早疫病菌、瓜链格孢菌、胡萝卜链格孢菌，8为阴性对照，其中1-4显示绿色荧光。

图2 为本发明烟草赤星病菌LAMP检测灵敏性。图中1-9模板DNA浓度分别为1ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、100ag、10 ag，10为阴性对照，其中1-6显示绿色荧光。

图3 为本发明检测方法对发病叶片中烟草赤星病菌的检测。图中1为阳性对照，2为阴性对照，3、5为烟草赤星病发病叶片，4为健康烟草叶片，其中1、3、5显示绿色荧光。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例 1：烟草赤星病菌环介导等温扩增（LAMP）检测特异性引物的设计及引物特异性验证

1.供试菌株基因组DNA的提取

采用CTAB 法提取供试菌株（表1）基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min^-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。

表1 供试菌株

2. 烟草赤星病菌环介导等温扩增（LAMP）特异引物的设计

通过测定烟草赤星病菌（Alternaria alternata）和其它病原菌的核糖体转录间隔区（ITS）基因，对链格属不同种间ITS基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/ index.html; Eiken Chemical Co., Japan)设计烟草赤星病菌特异性LAMP引物组，由F3、B3、FIP和BIP组成，引物序列如下：F3：5’-TCTCTTGGTTCT GGCATCGA-3’，B3：5’-GCG AGTCTCCAGCAAAGC-3’，FIP：5’-GGCGCAAT GTGCGTTCAAAGAT-GAACGCAGCGAAATGCGATA-3’，BIP：5’-TGGTATTC CAAAGGGCATGCCT-GACAA GACGCCCAACACC- 3’。

3.烟草赤星病菌LAMP检测方法的建立及引物特异性验证

以表1供试菌株的DNA为模板，利用F3、B3、FIP和BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定。待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在烟草赤星病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，不存在烟草赤星病菌。

4.引物特异性验证结果

LAMP扩增结果表明，供试的菌株中只有烟草赤星病菌显色结果可观察到绿色荧光，其余供试菌株显色结果为橙色（附图1），说明所设计的烟草赤星病菌引物F3/B3和引物FIP/BIP可以将烟草赤星病菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于烟草赤星病菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：烟草赤星病菌环介导等温扩增（LAMP）检测灵敏度测定

1.不同浓度基因组DNA的制备

用无菌超纯水对烟草赤星病菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用；

2. LAMP检测方法灵敏度测定及结果观察

以不同浓度的烟草赤星病菌基因组DNA为模板，利用引物F3/B3和引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，不同浓度DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性。

3. LAMP扩增灵敏度检测结果

LAMP扩增灵敏度检测结果表明，1ng、100pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg/μL浓度的烟草赤星病菌基因组DNA显色结果可观察到绿色荧光，其余浓度及阴性对照显色结果为橙色，说明所设计的烟草赤星病菌引物F3、B3、FIP和BIP通过LAMP扩增，对烟草赤星病菌的检测灵敏度可达10 fg/μL（附图2）。

实施例3：发病叶片中烟草赤星病菌的LAMP检测

样品采集：从福建南平、三明、龙岩采集烟草赤星病发病症状典型的叶片及健康叶片带回实验室备用；

植物组织DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。

LAMP扩增检测及观察：以上述提取的DNA为模板，利用引物F3、B3、FIP和BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄， 1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】 12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性。

检测结果：检测结果（附图3）表明，烟草赤星病发病的叶片通过LAMP扩增，显色结果可观察到绿色荧光，说明存在烟草赤星病菌，而健康叶片及阴性对照显色结果为橙色，说明不存在烟草赤星病菌，该套技术能用于植物组织中烟草赤星病菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 烟草赤星病菌的LAMP快速检测方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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<212> DNA

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