本发明涉及一种基于数字PCR绝对定量检测弓形虫的试剂盒及其检测方法,
属于生物检测技术领域，适用于在动物弓形虫病早期诊断和防疫中的应用。
背景技术：
弓形虫病(Toxoplasmosis)是由弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种人兽共患寄生虫病。该病呈全球性分布。犬、猫、猪、牛、羊、兔等家畜感染弓形虫非常普遍，其感染率高达10%～47.3%，不仅造成家畜流产，影响畜牧业生产，而且成为人类弓形虫病的主要传染源。人类弓形虫感染率一般为20%～50%，最高达94%，全球约有1/3的人感染弓形虫，我国人群弓形虫感染率为5%～20%。弓形虫在某些情况下可引起严重的疾病，如孕妇感染弓形虫可影响胎儿的发育，产畸形胎、木乃伊胎甚至死胎等，同时可使孕妇流产或早产；对于艾滋病等免疫抑制或免疫缺陷的病人，弓形虫更是一个主要的机会性致病因素。据报道，孕妇感染弓形虫后有30%～46%的机率从母亲传播给胎儿，引起胎儿先天性感染，造成流产、死胎或先天性弓形虫病；有6%～10%的艾滋病患者并发弓形虫病，而艾滋病病人所患脑炎中有50%是由弓形虫感染所引起的。据调查，孕产妇和肿瘤患者弓形虫抗体阳性率高达10%～60%。因此，弓形虫病已成为我国亟待解决的重要公共卫生问题之一。
由于弓形虫病临床上缺乏特异性表现，导致特异性检测方法的建立对于弓形虫病的防控起重要作用，弓形虫检测的一般方法可分为病原学检测方法、分子生物学检测方法和血清学检测方法。病原学检测方法应用简单，但费时、费力，检出率低，敏感和特异性不高，易漏诊。分子生物学技术具有灵敏度高、特异性好的特点，其中，聚合酶链反应（PCR）是一项高效、敏感、特异的快速诊断技术，已被应用于弓形虫病的检测，近年来还发展了巢式PCR、多重PCR等，但此类检测方法属于定性检测方法，且易因污染导致假阳性。血清学检测方法是诊断弓形虫感染普遍的方法，主要有染色试验（DT）、凝集试验（AT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique）等。其中，染色试验对于实验人员危险性很大，应用范围存在限制性；凝集试验测试方法简单，具有较高的特异性、灵敏度和重现性，尤其是间接免疫荧光抗体试验（IFAT）与改良凝集试验（MAT）效果最佳，但是检测费时且费用较高；胶体金快速诊断技术虽然具有简便、准确、高度特异性和敏感性，但目前只适用于弓形虫早期的检测和诊断，且价格较高；酶联免疫吸附试验（ELISA）具有特异性强、灵敏度高等的优点，目前已有多种试剂盒应用于弓形虫病的诊断，但因不同试剂盒采取的抗原不同且抗原纯度不高而导致检测的敏感性、特异性和重复性仍不够理想，价格也较高。
数字PCR(digital PCR, dPCR)是近年来引起重视并迅速发展起来的一种突破性的定量分析技术。1992年Sykes等利用样品的有限稀释获得单个模板分子,通过计算PCR后的扩增信号,以期准确地确定起始分子的数量,虽没有明确提出“数字PCR”概念,但已经建立了数字PCR的基本实验流程,这是数字PCR的雏形。Bio-Rad公司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20 ,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个test变成20 ,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化P CR( Droplet Digital PCR，ddPCR )。该技术先将核酸模板进行稀释,分配到大量独立的反应单元中,使每个反应单元中只有单个模板分子,然后进行PCR扩增反应,扩增结束后对每个反应室的荧光信号进行统计学分析,来定量DNA 拷贝数。数字PCR 采用先扩增后定量,因此不依赖扩增曲线的循环阈值(Ct),也无需采用内参基因和标准曲线,准确度高、重现性好,可以实现绝对定量分析。实时荧光定量PCR技术都因受到背景DNA或杂质的干扰，使得检测灵敏度及精确性都达不到精准定量的要求，而数字PCR检测系统通过微滴化处理，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，从而提高检测的灵敏度和精确性。由于其独特的技术优势,已经在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达分析、环境微生物检测和下一代测序等研究领域显示出巨大的优势和应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于数字PCR绝对定量检测弓形虫的试剂盒及其检测方法，其具有灵敏度高、特异性强、高准确度和精确度，可实现精确定量的数字PCR 检测方法和数字PCR 检测试剂盒，用于弓形虫的快速精确检测。
本发明的技术方案是这样实现的：一种基于数字PCR绝对定量检测弓形虫的试剂盒，由微滴数字PCR检测试剂和若干个微滴发生卡组装而成，其特征在于：微滴数字PCR检测试剂包括以下试剂 ：
溶液A：ddPCR预混液一支，0.9mL,其中包含500μL的2×ddPCR Supermix for Probes，上/下游引物分别为90μL(浓度为10μM)，特异性探针为30μL(浓度为10μM)，ddH2O 190μL ；
溶液B：微滴发生油一支，7mL；
溶液C：质控液一支，3.5mL；
溶液D：阳性对照模板一支，40μL；
溶液F：ddH2O一支，1mL；
使用基因组DNA为阳性模板，使用0.01MpH8.0的Tris-EDTA缓冲液稀释后冷冻保存；阳性对照制剂按400μL定量分装；使用ddH2O为阴性对照；
所述上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示 ；特异探针的序列如 SEQ ID NO:3 所示。
在此基础上，本发明继续提供一种弓形虫微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒，采用所述的试剂盒进行微滴数字 PCR 定量检测；具体包括步骤 ：
(1)制备ddPCR反应液，总体积20μL，向扩增管中加入下列反应物：溶液A：18μL；模板：2μL；阴性对照：以ddH2O代替模板，同样条件下扩增；
(2)取微滴发生卡置于卡托中固定，用8道可调移液器将20μL反应液加入到微滴发生卡中间一排的8个孔内，不足8个样品时用20μL溶液C补足；
(3)在微滴发生卡最底下一排8个孔中各加入70μL溶液B，不能有空着的孔；盖上胶垫密封；
(4)将带有卡托的微滴发生卡轻且平稳的放置于微滴生成仪中，开始生成微滴；
(5)微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，缓慢吸取40μL，再打入96孔板相应位置孔内；
(6)在96孔PCR仪内进行PCR扩增反应，升降温速度为2.5℃/sec；
(7)将完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好，之后轻且平稳的放入微滴读取仪中；
(8)打开QuantaSoft软件进行检测和定量分析。
所述程序(2)中使用8道可调移液器加样时，枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头再打出剩余液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。所述程序(5)中使用8道可调移液器加样时，枪头接近微滴发生卡底部，缓慢吸出液体，转移至96孔板时，不贴壁，缓慢打入孔内，避免破坏生成的微滴。
上述检测方法，优选的，所述步骤 (6) 中的 PCR 反应条件为 ：
本发明的积极效果是具有更高的灵敏度、准确度、精确性、重复性，可直接定量，无需标准曲线；对感染弓形虫样品能有效检测,是一种快速、敏感、准确的检测用试剂盒和检测方法，便于在早期内确定感染情况，做好预防工作。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述：需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合；一种基于数字PCR绝对定量检测弓形虫的试剂盒，其特征在于：包括1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列分别为：
一种基于数字PCR绝对定量检测弓形虫的试剂盒在制备弓形虫检测试剂中的应用。
一种基于数字PCR绝对定量检测弓形虫的试剂盒，由微滴数字PCR检测试剂和若干个微滴发生卡组装而成，其特征在于：微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒，包含弓形虫检测试剂；包括：溶液A：ddPCR预混液一支，0.9mL,其中包含500μL的2×ddPCR Supermix for Probes，上/下游引物分别为90μL(浓度为10μM)，特异性探针为30μL(浓度为10μM)，ddH2O 190μL ；
溶液B：微滴发生油一支，7mL；
溶液C：质控液一支，3.5mL；
溶液D：阳性对照模板一支，40μL；
溶液F：ddH2O一支，1mL；
使用基因组DNA为阳性模板，使用0.01M pH8.0的Tris-EDTA缓冲液稀释后冷冻保存；阳性对照制剂按400μL定量分装；使用ddH2O为阴性对照；
所述试剂盒的检测方法程序为：
1）制备ddPCR反应液，总体积20μL，向扩增管中加入下列反应物：溶液A：18μL；模板：2μL；阴性对照：以ddH2O代替模板，同样条件下扩增；
2）取微滴发生卡置于卡托中固定，用8道可调移液器将20μL反应液加入到微滴发生卡中间一排的8个孔内，不足8个样品时用20μL溶液C补足；
3）在微滴发生卡最底下一排8个孔中各加入70μL溶液B，不能有空孔，盖上胶垫密封；
4）将带有卡托的微滴发生卡轻且平稳的放置于微滴生成仪中，开始生成微滴；
5）微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，缓慢吸取40μL，再打入96孔板相应位置孔内；
6）在96孔PCR仪内进行PCR扩增反应，升降温速度为2.5℃/sec；
7）将完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好，之后轻且平稳的放入微滴读取仪中；
8）打开QuantaSoft软件进行检测和定量分析。
所述检测程序2）中使用8道可调移液器加样时，枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。
所述检测所述程序5）中微滴发生卡最底下一排8个孔中用8道可调移液器加样时，枪头接近微滴发生卡底部，缓慢吸出液体，转移至96孔板时，不贴壁，缓慢打入孔内，避免破坏生成的微滴。
所述程序6）中的PCR反应条件为：
(1) 预变性：温度94℃，10min；
(2) 变性：温度94℃，15s，退火：温度60℃，1min，共40个循环；
(3)结束反应：温度98℃，10min。
实施例 1 引物及探针的设计与筛选
1、本发明引物、探针设计 ：根据Genbank已发表的弓形虫基因序列 (GenBank: AF179871.1 ) 为靶基因，进行适用于ddPCR的特异性引物和的设计。
本实施例给出了筛选最佳引物的过程，选择用软件设计出的其中几对备选引物进行筛选，备选引物如下，见表 1。
2、引物的筛选
(1)引物随机配为四对：F1R1、F1R2、F2R1、F2R2；
(2)然后用染料法做荧光定量PCR，PCR体系配方：2×SYBR Green Supermix 10μL，上游引物，下游引物分别为1μL，ddH2O 3μL，阳性模板5μL。PCR的扩增程序为94℃预变性10min；94℃变性15sec，58℃退火1min，共40个循环；65℃—95℃每5秒升高0.5℃溶解曲线，结束反应。
(3)结果分析，选择没有非特异性扩增的引物对F1R1。
3、探针的筛选
(1)引物探针的组合为：1、F1R1+P1，2、F1R1+P2
(2)然后在ddPCR平台上，ddPCR体系配方：2×ddPCR Supermix for probes 10μL，上游引物，下游引物分别为1μL，探针0 .5μL，ddH2O 3.5μL，阳性模板4μL，总体积20μL(引物和探针的浓度均为10μM)。然后生成微滴。
(3)上PCR仪扩增，PCR的扩增程序为94℃预变性10min；94℃变性30sec，58℃退火1min，共35个循环；98℃10min结束反应。上微滴数字PCR检测仪检测。
(4)分析结果：根据实验结果选择F1R1+P1引物探针组合。
实施例2在ddPCR平台上检测弓形虫的PCR方法退火温度的优化。
1、选择引物探针的组合为：F1R1+P1。
2、然后在ddPCR平台上，ddPCR体系配方：2×ddPCR Supermix for probes 10μL，上游引物，下游引物分别为1μL，探针0 .5μL，ddH2O 3.5μL，阳性模板4μL，总体积20μL(引物和探针的浓度均为10μM)。做8个复孔，然后生成微滴。
3、上PCR仪扩增，PCR的扩增程序为94℃预变性10min；94℃变性15sec，55～62℃(仪器设置8个温度梯度)退火1min，共40个循环；98℃10min结束反应。上微滴数字PCR检测仪检测。
4、分析结果：根据实验结果选择57～60℃的退火温度。
实施例3引物、探针浓度的优化实验
1、设计引物探针浓度均为10μM ,组合为F1R1+P1,体系配置方法见表2。
2、在ddPCR平台上生成微滴，转移到96孔板内，封铝膜。
3、上PCR仪扩增，PCR的扩增程序为94℃预变性10min；94℃变性15sec，60℃退火1min，共40个循环；98℃10min结束反应。上微滴数字PCR检测仪检测。
4、分析结果：根据实验结果选择F1R1+P1引物探针配方：引物分别为1.8μL，探针为0.6μL。
实施例4 PCR扩增升降温速度的优化实验
1、然后在ddPCR平台上，引物探针组合F1R1+P1 (浓度为10μM),用ddPCR体系配方：2×ddPCR Supermix for probes 10μL，上游、下游引物分别为1.8μL，探针为0.6μL，ddH2O 3.8μL，阳性模板2μL，总体积20μL。每台仪器做4个复孔，生成微滴，转移到PCR管内。
2、在两台同样的PCR仪平台上扩增，PCR的扩增程序为94℃预变性10min；94℃变性15sec，60℃退火1min，共40个循环；98℃10min结束反应,一台设置升降温速度设置为5℃/sec，另一台上设置升降温速度设置为2.5℃/sec，扩增结束后，把PCR管内的扩增产物转移到同一块96孔板内，封铝膜，上微滴数字PCR检测仪检测。
3、分析结果：根据实验结果分析发现，升降温速度慢的最后检测的微滴数比升降温速度快的多，扩增效率高，升降温速度慢的阴性微滴和阳性微粒之间的距离分的很开，很容易区分，升降温速度快的阴性微滴和阳性微粒之间的距离分的不开，不容易区分，故选择2.5℃/sec升降温速度。
实施例5总DNA提取
1、取200mg研磨后的样品于1 .5mL离心管中。
2、加入350μL的组织裂解液，10μL蛋白酶K混合均匀，56℃水浴1h-3h。
3、加入700μL饱和酚强烈振荡,12000r/min离心10min，取上清。
4、重复步骤3，加入等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25: 24: 1)混匀后12000r/min离心10min ，取上清液，加等体积酚:氯仿:异戊醇(25: 24: 1)再抽提一次。
4、用2倍体积的无水乙醇，0.1倍体积的 3 mol/L NaAC于-20℃沉淀30 min，12000 r/min离心10 min，弃上清。
5、沉淀用无水乙醇洗一次，自然干。
6、用50-200μL TE（pH值8.0）溶解DNA沉淀，-20℃保存。
实施例6检测弓形虫的ddPCR方法的建立
1、微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒的组装
将试剂盒分为微滴数字PCR检测试剂，方便保存和运输。用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签(标示名称、批号、生产日期、有效期等)。
溶液A（ddPCR预混液），一支，0.9mL；溶液B（微滴发生油），一支，7mL；溶液C（质控液），一支，3.5mL；溶液D（阳性对照模板），一支，35μL；溶液F（ddH2O），一支，1mL。
使用基因组DNA为阳性模板，使用0.01MpH8.0的Tris-EDTA缓冲液稀释后冷冻保存；阳性对照制剂按400μL定量分装；使用ddH2O为阴性对照。
上述溶液A其900μL的配方包含500μL的2×ddPCR Supermix for Probes，上/下游引物分别为90μL(浓度为10μM)，特异性探针为30μL(浓度为10μM)，ddH2O 190μL 。
使用时，在18μL的ddPCR探针法预混液中加入2μL的DNA模板，得到20μL的ddPCR反应液，用于制备微滴。
2、ddPCR方法的建立
(1)制备ddPCR反应液，总体积20μL。向扩增管中加入下列反应物：
空白对照：以ddH2O代替模板，同样条件下扩增。
(2)取微滴发生卡置于卡托中固定，将20μL反应液加入到微滴发生卡中间一排的8个孔内，不足8个样品时用20μL 1×溶液C补足，建议使用8道可调移液器加样时，枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头再打出剩余液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。
(3)在微滴发生卡最底下一排8个孔中各加入70μL微滴生成油，同样不能有空孔。
(4)盖上胶垫，注意两边的小孔都要钩牢。
(5)将以上卡托轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2分钟之内完成。
(6)微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，建议使用8道可调移液器小心缓慢吸取，调整吸取体积为40μL，将卡托放平，枪头以与孔壁呈30～45°角放入，轻触孔底，约5秒吸取40ul，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内(约5秒)，枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的微滴发生卡和胶垫。
(7)封好膜之后应该在30min内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4h之内进行PCR，可在任意一台96孔PCR仪上完成，升降温速度为2.5℃/sec。反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性15sec，60℃退火1min，共40个循环；98℃10min结束反应。
(8)将之前完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好，注意板斜角方位，组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中。
(9)打开QuantaSoft软件，建议每次实验之前做一次系统清洗，若一周以上未使用建议先做一次填充油路再做系统清洗。之后对96孔板中样品信息进行设置，主要是提供实验名称、实验类型以及探针信息等，完成后即可运行仪器，结束后结果会被自动分析，人工核实后保存结果。
4、结果分析和判定
本发明试剂盒检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：20±5个拷贝；(2)阴性对照：<1个拷贝；待测样本结果判定：(1)阳性：标本检测结果≥ 1个拷贝。(2)阴性：标本检测结果<1拷贝。
实施例7特异性检验
用制备的试剂盒分别检测犬新孢子虫、旋毛虫、球虫、贾第虫和隐孢子虫样本各10份，结果全为阴性；检测弓形虫样本各10份，结果全为阳性。
以上检测结果证明了本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、可直接定量，检测方便快捷、结果准确可靠。
本发明根据弓形虫B1基因序列设计特异性引物，成功建立了弓形虫的数字PCR检测方法，填补了弓形虫数字PCR检测方法的空白。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。