一种金线莲茎腐病菌LAMP检测引物及其检测方法与流程

本发明一种金线莲茎腐病菌LAMP检测引物及其检测用法，专用于金线莲茎腐病菌高特异性、灵敏度可视化快速检测，同时可用于田间金线莲茎腐病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术：

金线莲是多年生珍稀中草药，又名花叶开唇兰，也有人将其称为金丝草和金线入骨消等，具有很高的药用价值，如清热凉血、袪风利湿、强心利尿、固肾、平肝等功效。作为近年来备受推崇的保健药材，商家对此开发出了不少相关产品，受到消费者的广泛喜爱，但野生金线莲对生长环境的要求苛刻，加上人工的过度采挖，已面临灭绝的境地，目前，人工栽培是解决上述问题的最佳方法。金线莲的栽培技术也十分成熟，但金线莲的病害问题也日益凸显，金线莲种植大棚中出现了金线莲移栽后茎腐病严重发生，茎腐病的病原菌为尖孢镰刀菌，金线莲尖孢镰刀菌菌丝最适宜生长的温度为28℃，分生孢子产生及萌发的最适温度为28℃至32℃，相对湿度为85％。目前金线莲生产上茎腐病发病面积大，传染速度快，严重影响到金线莲的产量和品质。同时，由于目前缺乏有效的病害早期诊断技术，发病后盲目大量使用药剂防治也引起金线莲的农药残留，造成食品安全问题。因此，研发出金线莲茎腐病的早期快速诊断并进行及时监测，对保障金线莲健康生产及食品安全至关重要。

目前病害检测方法主要采用传统的病原分离检测方法和分子检测等技术。传统检测方法耗时、耗力，且检测结果可靠性低，免疫学检测技术的灵敏度较低，且抗体的制作过程耗时、复杂，检测成本高，PCR技术虽然快速、准确，但需昂贵的仪器设备，检测成本高，不适宜在基层部门推广应用。而最近科学家们研发出的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种高效率的核酸等温扩增方法，该方法短时间内实现产物的大量扩增，灵敏度比PCR高，且操作步骤简便，无需特殊设备，检测结果可由肉眼判断，极适合于在基层生产部门推广应用。本研究基于环介导等温扩增（LAMP）技术，建立金线莲茎腐病菌的可视化检测，根据LAMP技术原理，选取金线莲茎腐病菌的核糖体基因上的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)靶序列的6个区域，进而设计出4条特异性引物，通过对反应体系和反应条件的优化，以钙黄绿素（Calcein）的荧光显色指示剂作用，建立可视化LAMP检测技术。该体系对金线莲茎腐病菌检测具有高的特异性与灵敏性，检出限为5.5pg/μL，具有很高的灵敏度。并在此基础上研发出可视化快速检测试剂盒。该技术是一种操作简单、灵敏度和特异性高的快速检测手段；无需特殊仪器设备，同时开发的快速检测试剂盒适合田间金线莲生产中开展实地检测与监测，从而保障金线莲健康生产及食品安全。

目前，对植物病害的传统检测鉴定方法是首先进行病菌分离，通过对已经分离并纯化的病菌进行培养、观察，完成形态上的鉴定工作。同时，将病原菌回接到植株中，进行致病性的验证。最后，对照已有的分类资料确定引起病害的病原菌的分类和地位。该法作为最基本的病原菌鉴定方法在一直以来被广泛使用，有着很强实用性，是病原菌的鉴定及病害检测的方法之一，但是该方法受人为因素和环境的影响，对操作者的实验技能和实际经验有很高的要求，十分耗时，无法达到快速检验的要求。

免疫学检测技术（Immunological technology）具有操作简单、特异性强，以及检测时间短的优点，适合开发检测试剂盒。但其不能对检测对象进行扩增，所以灵敏度不及核酸检测技术高。另外，抗体的制作过程耗时、复杂，提高了检测的成本。这两点缺点限制了免疫学检测技术的推广使用。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种利用DNA聚合酶在体外大量扩增靶序列的技术，该技术是病原检测最常规的方法之一，广泛应用于病原鉴定、变异检测等分子生物学研究。PCR检测技术灵敏度高、特异性强，已成为病原菌检测重要的技术之一，主要包括常规PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和实时荧光定量PCR等，主要的缺点是需要依靠PCR等仪器设备，不利于基层生产上推广应用。

环介导等温扩增（Loop-mediated Isthermal Amplification，LAMP）技术是由日本科学家开发的一种最新的简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增方法（Notomi et al.，2000 ）。LAMP技术是一种新型的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下，可在短时间内使产物得到大量扩增，在短短的30min-60min内就能实现10⁹-10¹⁰倍的扩增。同时具有很高的灵敏度和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断，反应结束后用肉眼观察是否产生焦磷酸镁沉淀，即可判断靶序列是否存在。亦可在反应液中加入荧光指示剂，使反应结果的肉眼观察更加的方便、直观和可靠。

LAMP技术操作简单、快速高效，而且检测特异性非常强，其最大的优势就是在恒温条件即可进行扩增反应，无需特殊实验设备，相较于普通PCR技术，其有很多优点（表1）。

表1.LAMP技术与常规PCR技术比较

综上，目前植物病害的检测主要有传统检测和分子生物学检测。其中，传统检测法耗时、耗力，检测结果可靠性往往比较低；分子生物学检测法主要有常规PCR、Nest-PCR和qPCR等，PCR方法能快速、准确地检测病原，但需特定仪器设备，且检测成本比较高，不适合基层检验检疫部门的推广应用，使田间病情难以得到及时、准确的检测，严重阻碍了金线莲产业发展。基于目前金线莲茎腐病在我国严重发生，因此，建立一套简便、快速、准确、有效、经济的金线莲茎腐病菌的检测技术非常重要。此技术可应用于金线莲茎腐病菌引起病害显症之前的早期监测，对于确定病害防治最佳时期具有重要的作用，为防治策略的制定提供技术支持。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，金线莲茎腐病菌的检测国内外均未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中金线莲茎腐病菌的传统检测方法所需周期长、检测方法特异性差，PCR检测需要依靠扩增仪等设备，且灵敏度低的问题，提供一种金线莲茎腐病菌的LAMP检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的金线莲茎腐病菌的可视化检测方法。

实现本发明的目的包括下列步骤：

1．LAMP引物的设计

根据金线莲茎腐病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种间高度变异和种内稳定性，采用PrimerExplorer V4软件设计了对金线莲茎腐病菌具有特异扩增作用的LAMP检测引物，包括2条外引物(F3 和 B3) 和 2条内引物 (FIP 和 BIP)，引物序列分别为：

F3: CGGATCTCTTGGTTCTGGC；

B3: TGGAAGCTCGACGTGACC；

FIP: GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTGAAGAACGCAGCAAAATGC；

BIP: TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACGCGAATTAACGCGAGTCC。

2．金线莲茎腐病菌快速检测体系的建立

LAMP检测：25μl反应体系中含20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，甜菜碱0.8 mol/L，Bst 聚合酶为8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，F3和B3为0.2 mmol/L，FIP和BIP各1.6 mmol/L，钙黄绿素50 μmol/L，氯化锰500 μmol/L，TWeen-20 0.1%，模板DNA 50~100 ng，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10min。

所述的检测方法为荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法。所述荧光染料目测观察法：在LAMP反应后，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。所述琼脂糖凝胶电泳法：取2μl PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

该方法可用于带菌的植株的高灵敏度快速检测。建立金线莲茎腐病菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于金线莲茎腐病菌显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。

本发明的关键性技术是金线莲茎腐病菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证金线莲茎腐病菌检测的特异性，本发明以采集分离的8株金线莲茎腐病菌和31个其它近缘真菌为供试材料，对检测的特异性进行LAMP验证。

LAMP检测：25μl反应体系中含20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，甜菜碱0.8 mol/L，Bst 聚合酶为8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，F3和B3为0.2 mmol/L，FIP和BIP各1.6 mmol/L，钙黄绿素50 μmol/L，氯化锰500 μmol/L，TWeen-20 0.1%，模板DNA 50~100 ng，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10min。

除了8株金线莲茎腐病菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳检测出现LAMP特征性的梯形带外，检测了14种31个其它近缘真菌的显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。这说明该引物可被用于生产实践中金线莲茎腐病快速可靠的检测和鉴定。

当在用于金线莲组织中存在茎腐病菌的检测时，采用NaOH快速裂解法提取金线莲茎腐病菌的DNA，具体过程如下：(1)将金线莲病叶或病茎洗净、晾干，剪取发病部位；(2)按1mg病叶加入10μl（0.5mol/L NaOH，0.5%PVP）计量，将组织充分磨碎成糊，在12,000g离心机中离心5min；(3)取上清20μl与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl（pH8.0）混合；(4)稀释10倍、100倍、1000倍液，分别取1μl原液、 10倍、100倍、1000倍液作为PCR模板进行扩增。

按如下LAMP反应体系和反应条件用所设计的引物进行检测：

①LAMP反应体系25μl：25μl反应体系中含20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，甜菜碱0.8 mol/L，Bst 聚合酶为8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，F3和B3为0.2 mmol/L，FIP和BIP各1.6 mmol/L，钙黄绿素50 μmol/L，氯化锰500 μmol/L，TWeen-20 0.1%，模板DNA 50~100 ng，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10min。

②在LAMP反应后，显色结果观察到绿色荧光，或取2μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果出现LAMP特征性的梯形带，即可判断所述的金线莲组织中存在金线莲茎腐病菌；否则所述的金线莲组织中未存在金线莲茎腐病菌。

本发明有益效果：本发明方法适用于植株中金线莲茎腐病菌的LAMP可视化快速稳定的检测和鉴定，对于药用植物种植中金线莲茎腐病菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、结果可靠：本发明所设计出的LAMP检测引物，已经采集分离不同地点的8株金线莲茎腐病菌及发病植物组织进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证；

2、特异性强：本发明所采用的LAMP引物是针对金线莲茎腐病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性强。

3、灵敏度高： LAMP对金线莲茎腐病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到5.5pg，具有很高的灵敏度。

4、实用性好：本发明所设计出的LAMP引物，可用于金线莲茎腐病菌的高灵敏度快速检测，因此本方法的实用性强，可满足金线莲茎腐病菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要；

5、操作简便快速：应用本发明方法，对金线莲茎腐病菌进行检测可在1小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需一个恒温设备即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。

附图说明

图1为本发明金线莲茎腐病菌的LAMP检测结果图。图1（上）表示琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中：泳道M为DL 2000 DNA marker，泳道1为阳性对照（金线莲茎腐病菌DNA），泳道2为阴性对照（d.d.H₂O）；图1（下）表示显色结果，其中：第1管为阳性对照（显示绿色荧光），第2管为阴性对照（见实施例1）。

图2为本发明金线莲茎腐病菌的LAMP特异性检测结果图。图2（上）表示琼脂糖凝胶电泳检测结果，图2（下）表示可视化显色结果，其中：泳道M为DL 2000 DNA marker，泳道1为金线莲茎腐病菌DNA（显示绿色荧光），泳道2-9为其他真菌菌株DNA（见实施例2）。

图3为本发明金线莲茎腐病菌的LAMP灵敏性检测结果图。图3（上）表示PCR检测扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图3（下）表示LAMP扩增后的显色结果，其中：泳道M为DNA marker，泳道1–12模板DNA 浓度分别为 5.5µg/μL，550ng/μL，55.0ng/μL，5.50ng/μL，550pg/μL，55pg/μL，5.5pg/μL，550fg/μL，55fg/μL，5.5fg/μL，550ag/μLDNA/μL。（见实施例3），1-7道绿色荧光显示逐渐减弱，8-12显示橙色。

具体实施方式

本发明的技术内容包括金线莲茎腐病菌的LAMP检测引物，LAMP引物及其序列分别为：

F3: CGGATCTCTTGGTTCTGGC；

B3: TGGAAGCTCGACGTGACC；

FIP: GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTGAAGAACGCAGCAAAATGC；

BIP: TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACGCGAATTAACGCGAGTCC；

利用LAMP引物检测金线莲茎腐病菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带。

主要试剂：BstDNA 聚合酶大片段购自英国NEB公司；DNA marker 购自宝生物工程大连有限公司；其余试剂均购自生工生物（上海）技术有限公司。引物由生工生物（上海）技术有限公司合成。

实施例1：LAMP引物对金线莲茎腐病菌的可视化检测

1．金线莲茎腐病菌的LAMP可视化检测

①LAMP反应体系：25μl反应体系中含20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，甜菜碱0.8 mol/L，Bst 聚合酶为8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，F3和B3为0.2 mmol/L，FIP和BIP各1.6 mmol/L，钙黄绿素50 μmol/L，氯化锰500 μmol/L，TWeen-20 0.1%，模板DNA 50~100 ng，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10min。

②在LAMP反应后，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

2．检测结果

可视化检测：阳性对照（金线莲茎腐病菌DNA）显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳检测出现LAMP特征性的梯形带外，阴性对照（d.d.H₂O）显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。（部分结果见图2），说明此引物具有很强的特异性。

实施例2：LAMP引物对金线莲茎腐病菌的特异性扩增

1．金线莲茎腐病菌的LAMP特异检测

①LAMP反应体系：25μl反应体系中含20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，甜菜碱0.8 mol/L，Bst 聚合酶为8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，F3和B3为0.2 mmol/L，FIP和BIP各1.6 mmol/L，钙黄绿素50 μmol/L，氯化锰500 μmol/L，TWeen-20 0.1%，模板DNA 50~100 ng，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10min。

②在LAMP反应后，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

2．检测结果

检测的特异性：除了8株金线莲茎腐病菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳检测出现LAMP特征性的梯形带外，检测了其它31个真菌菌株的显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。（部分结果见图2），说明此引物具有很强的特异性。

实施例3：LAMP引物对金线莲茎腐病菌的灵敏性检测

1．金线莲茎腐病菌的LAMP灵敏性检测

采用10倍浓度系列稀释法将提取的金线莲茎腐病菌DNA稀释成5.5µg/μL，550ng/μL，55.0ng/μL，5.50ng/μL，550pg/μL，55pg/μL，5.5pg/μL，550fg/μL，55fg/μL，5.5fg/μL，550ag/μLDNA，共11个不同浓度梯度。

①LAMP反应体系：25μl反应体系中含20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，甜菜碱0.8 mol/L，Bst 聚合酶为8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，F3和B3为0.2 mmol/L，FIP和BIP各1.6 mmol/L，钙黄绿素50 μmol/L，氯化锰500 μmol/L，TWeen-20 0.1%，模板DNA 50~100 ng，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63-65℃温育45-60 min，85℃灭活5-10min。

②在LAMP反应后，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

2．检测结果：金线莲茎腐病菌LAMP灵敏性检测，显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，检测灵敏度可达5.5pg/μL，具有很高的灵敏度（见图3）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种金线莲茎腐病菌LAMP检测引物及其检测方法

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<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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tggaagctcg acgtgacc 18

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<212> DNA

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<400> 3

ggcgcaatgt gcgttcaaag attgaagaac gcagcaaaat gc 42

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tgcctgttcg agcgtcattt cacgcgaatt aacgcgagtc c 41