实施例1、鉴定猪的脊椎数多少
[0039]一、猪TGFB3基因g.105182819A〉G多态性位点的确定
[0040] (一）W两头大民杂交猪为实验材料，分别提取其耳缘组织的基因组DNA。
[0041] (二）引物的设计与合成
[0042] 根据猪TGFB3基因的国际猪基因组10. 2版本参考序列化ttp://asia. ensembl. org/Sus_sc;rofa/Inf(Vlndex)，设计并合成如下引物：
[0043]U(上游引物）：5, -ACTGAGCCCTTCTTTAATGGAA-3'（序列 1);
[0044] D(下游引物）：5 ' -GAAATCCCAATGCCGATTTAGC-3 '（序列 2)。
[0045] (S)PCR扩增
[0046] 分别W步骤（一）得到的大民杂交猪的基因组DNA为模板，WU和D为引物进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物，分别命名为产物1和产物2。
[0047]PCR扩增体系：基因组DNA 200ng，10 X PCR扩增缓冲液5 y 1，dNTPs终浓度为 IOmM,上、下游引物各50ng，！"aq DNA聚合酶0. 75U，Mg2+2.5mmol/L，用d地2〇补足体系至 50 Ji 10
[0048] ?0?扩增程序：95°(：预变性5111111;95°(：变性2〇3,58.5°(：退火3〇3,72°(：延伸3〇3，共 35个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0049](四）测序及序列分析
[0050] 将产物1和产物2进行测序，得到产物1的序列（如序列表中序列3所示）和产 物2的序列（如序列表中序列4所示）。序列3和序列4只存在一个碱基的差异，均为序 列3和序列4中自5'末端起第118位，该处的碱基为在序列3中为A，在序列4中为G，如 图1中箭头所示，该位点为国际猪基因组10. 2版本参考序列7号染色体上的自5'末端起 第105182819位，因此将该位点命名为g. 105182819A〉G。
[0051] 将在国际猪基因组10. 2版本参考序列7号染色体上的自5'末端起第105182819 位的碱基（即步骤（S)得到的PCR扩增产物自5'末端起第118位的碱基）为A的纯合 型个体的基因型命名为AA ;将在国际猪基因组10. 2版本参考序列7号染色体上的自5'末 端起第105182819位的碱基（即步骤（S)得到的PCR扩增产物自5'末端起第118位的 碱基）为G纯合型个体的基因型命名为GG ;将在国际猪基因组10. 2版本参考序列7号染 色体上的自5'末端起第105182819位的碱基（即步骤（S)得到的PCR扩增产物自5'末 端起第118位的碱基）为A和G的杂合型个体的基因型命名为AG。 阳05引二、猪TGFB3基因g. 105182819A〉G多态性位点与猪的脊椎数的关联性分析 阳化引为确定g. 105182819A〉G多态性位点与猪的脊椎数是否相关，W592头大民杂交猪 为实验材料，进行如下试验：
[0054](一）提取每头猪的耳缘组织的基因组DNA，分别按照步骤一中（S)的方法进行 PCR扩增，得到各PCR扩增产物，按照步骤一中（四）的方法确定每头猪的基因型是AA、AG还是GG。 阳化5](二）用屠宰后胸腰椎数计数法检测每头猪的脊椎数。即所述脊椎数是指胸椎数 和腰椎数的总和。
[0056](=)对猪的基因型与脊椎数开展关联分析，具体方法可参见文献"ZhangLWang L,LiY,LiW,YanH,LiuX,ZhaoK,WangL.Asubstitutionwithinerythropoietin receptorgeneDldomainassociatedwithlittersizeinBeijingBlackpig,Sus scrofa.AnimSciJ. 2011, 82 (5) :627-632^^
[0057] 所用模型如下：
[0058]Y=S+G+e
[0059] 其中，Y为性状测定值，S为性别效应，G为基因型效应，e为残差效应。 W60] 结果如表1所示。
[0061] 表1猪的基因型与猪的脊椎数的关联性分析
[0062]
[0063] 注：同列上t不不同字母表不差异显者（P〈〇. 001)。 W64] 从表1可见，在猪的脊椎数性状中，GG基因型的猪的脊椎数显著大于AG基因型的 猪的脊椎数，AG基因型的猪的脊椎数显著大于AA基因型猪的脊椎数，GG基因型猪的脊椎数 比AA基因型猪的脊椎数多约0. 66节（P<0. 001)。 阳0化]结果表明，用TGFB3基因内的国际猪基因组10. 2版本参考序列自5'末端起第 105182819位单核巧酸多态性可用于鉴定猪的脊椎数相关性状。在实际的猪育种中，为获得 更多脊椎数的猪，最好选择GG基因型的猪进行育种；为获得更少脊椎数的猪，最好选择AA 基因型的猪进行育种。
【主权项】
1. 猪基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性在鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相 关性状中的应用； 所述SNP位点为：以猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序 列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5'末端起第 118位核苷酸；所述SNP位点处的核苷酸为A或G。2. 用于检测猪基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定待 测猪的脊椎数相关性状中的应用； 所述SNP位点为：以猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序 列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5'末端起第 118位核苷酸；所述SNP位点处的核苷酸为A或G。3. 用于鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状的试剂，是用于检测猪基因组中如下 SNP位点的单核苷酸多态性的物质； 所述SNP位点为：以猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序 列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5'末端起第 118位核苷酸；所述SNP位点处的核苷酸为A或G。4. 根据权利要求1或2所述的应用或权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述"用于 检测猪基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质"为如下（a)或（b)所示的引物对： (a) 由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物 对； (b) 由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添 加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与（a)中所述引物对功能相同的引物对。5. 用于鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状的试剂盒，含有权利要求3或4所述 的试剂。6. 权利要求3或4所述试剂或权利要求5所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测猪的脊 椎数相关性状中的应用。7. -种鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状的方法，包括如下步骤：检测待测猪 的基因组中如下SNP位点处的核苷酸为A还是G还是A和G，以确定所述待测猪的基因型 是AA还是GG还是AG，根据所述待测猪的基因型按照如下确定待测猪的脊椎数相关性状： GG基因型的待测猪的脊椎数多于或候选多于AG基因型的待测猪；AG基因型的待测猪的脊 椎数多于或候选多于AA基因型的待测猪； 所述SNP位点为：以猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序 列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5'末端起第 118位核苷酸；所述SNP位点处的核苷酸为A或G; 所述GG基因型为以猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序 列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得的扩增产物的自5'末端起 第118位核苷酸为G的纯合型； 所述AA基因型为以猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序 列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5'末端起第 118位核苷酸为A的纯合型； 所述AG基因型为以猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序 列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的自5'末端起第 118位核苷酸为A和G的杂合型。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述"检测待测猪的基因组中如下SNP位 点处的核苷酸为A还是G还是A和G"的方法为测序分析；所述测序分析包括PCR扩增和 对所述PCR扩增所得产物进行测序两个步骤；所述PCR扩增的模板为所述待测猪的基因组 DNA，所用的引物对满足如下条件：以待测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增所得扩增产 物含有所述SNP位点处的核苷酸； 具体的，所述引物对为权利要求4中所述的引物对。9. 权利要求3或4所述试剂或权利要求5所述的试剂盒或权利要求7或8所述方法在 猪育种中的应用。10. 如下（A)或⑶的方法： (A) 培育多脊椎数的猪的方法，包括选择GG基因型的猪进行育种的步骤；所述GG基因 型为以猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所 示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增得到的扩增产物的自5'末端起第118位核苷酸 为G的纯合型； (B) 培育少脊椎数的猪的方法，包括选择AA基因型的猪进行育种的步骤；所述GG基因 型为以猪基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所 示的单链DNA组成的引物对进行PCR扩增得到的扩增产物的自5'末端起第118位核苷酸 为A的纯合型。
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定猪脊椎数相关性状的方法及专用引物。本发明提供了猪基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性在鉴定或辅助鉴定待测猪的脊椎数相关性状中的应用；所述SNP位点为：以猪基因组DNA为模板，采用由序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增所得产物的自5’末端起第118位核苷酸；所述SNP位点处的核苷酸为A或G。实验证明，GG基因型的猪的脊椎数显著大于AG基因型的猪的脊椎数显著大于AA基因型猪的脊椎数。利用本发明可对猪进行早期筛选，有效解决实际生产中的选取优良种猪时间长的问题，降低育种花费，且准确度高，检测费用低，并可实现自动化检测，在猪育种方面具有很高的实践应用价值。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105219873
【申请号】CN201510741090
【发明人】王立贤, 张龙超, 王立刚, 刘欣, 岳静伟
【申请人】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月4日