毒TSV作模板以及对虾肝胰腺细小病毒HPV(序列如SEQ ID NO: 10所示）、斑节对 虾杆状病毒MBV(序列如SEQ ID如：11所示）、传染性皮下及造血组织坏死病毒1冊附(序列 如SEQ ID N0:12所示）、纯水为阴性对照进行实验验证，实验结果表明，本发明试剂盒及检 测方法特异性较好，未出现假阳性或假阴性，实验结果见图5-图7。
[0107] HPV
[0108] CAATTAGAACGCATAGAAAACGCTAAGAAATACATAGAAGAAGTTATAGAAGAAACTAATCAAGAGTTAGAAAATCA AGAGAGACAAGAGGTAAGTGCGGCGGAGGCAGATACGATGAACACTGAAGCACCTGTCCCGATGGAAACTTCTGAAT CAGGGACTACCGCCGCACCGCAGCAGCGAGCTGCAGCGGGCGGTGGCGGTAGTGGAGGTGGAGGCGAATCAGCAGGG TACGGGAGAAACTCTAGCGATTCATTCCAGCGCCACCGCAACAAACCTATCGATCT SEQ ID NO:10
[0109] MBV
[0110] ACCATAAGCTAGCATACGTCCTTTTGAATTTTTATACTGTTCTATGCATTTTGCAAGACCCTCTACCGATATGGTAT CAATGTCTGGAGTTATATTATTTTTTATATAATTGAGTGTTTTTTGCTGACCTTTTGAAATTGCATTTTTATAGATA AATAAAGAATCATCGAGATCCTTCATTTATAATTGTCTTTATCTTTTTGTATAGCGTGTTAACGCTATAAAGATTTT CAAGATCTGCACTCCTT SEQ ID NO:11
[0111] IHHNV
[0112] TCACATTTACAGACACCCCATATTTAGAAATATTTAAGGATACTACTGGACTACATAATCAACTATCAACTAAGGAA GCCGACGTAACATTGGCAAAATGGATACAAAATCCCCAACTTGTGACCGTACAATCAACAGCAGCAAACTATGAAGA CCCAATCCAACAATTTGGATTCATGGAACAAATGCGAACCGGTGACAGAAAAGCCTATACAATCCATGGTGACACTA GAAATTGGTATGGCGGAGAAATACCAACAACCGGACCCACCTTCATCCCAAAATGGGGTGGTCAATTAAAATGGGAC AAACCATCCCTTGGAAACCTAGTCTACCCAGCAGACCACCATACAAACGACTGGCAACAGATCTTCATGAGAATGTC ACCAATCAAAGGACCAAATGGAGACGAACTTAAACTTGGCTGC SEQ ID NO:12
[0113] 图5为多重PCR体系中对虾传染性肌肉坏死病毒检测的特异性实验结果图，其中M 为Marker，1为頂NV阳性标准品，2为YHV模板，3为TSV模板，4为HPV模板(按照 所示序列人工合成DNA即可），5为MBV模板(按照所示序列人工合成DNA即可），6为IHHNV模板 (按照所示序列人工合成DNA即可），7为纯水。采用的引物是IMNV引物aMNV-F和頂NV-R)，从 图中看出，对虾传染性肌肉坏死病毒为阳性，黄头病毒、桃拉病毒、对虾肝胰腺细小病毒、斑 节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、纯水均为阴性。说明特异性好。
[0114] 图6为多重PCR体系中黄头病毒检测的特异性实验结果图，其中Μ为7^/^i^DNA Marker，1为YHV阳性标准品，2为頂NV模板，3为TSV模板，4为HPV模板，5为MBV模板，6为IHHNV 模板，7为纯水。采用的引物是YHV引物(YHV-F和YHV-R)，从图中看出，黄头病毒为阳性，对虾 传染性肌肉坏死病毒、桃拉病毒、对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及 造血组织坏死病毒、纯水均为阴性。说明特异性好。
[0115] 图7为多重PCR体系中桃拉病毒检测的特异性实验结果图，其中Μ为DNA Marker，1为TSV阳性标准品，2为頂NV模板，3为YHV模板，4为HPV模板，5为MBV模板，6为IHHNV 模板，7为纯水。采用的引物是TSV引物(TSV-F和TSV-R)，从图中看出，桃拉病毒为阳性，对虾 传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及 造血组织坏死病毒、纯水均为阴性。说明特异性好。
[0116] 综上所述，可以得出采用本发明的引物及试剂盒具有较好的特异性。
[0117] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨 的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1. 一种同时检测对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒的多重PCR引物对，其 特征在于，所述引物对分别为MNV-F和頂NV-R、YHV-F和YHV-R、TSV-F和TSV-R，序列依次如 SEQIDN0:1和2，SEQIDN0:3和4，SEQIDN0:5和6所示。2. -种同时检测对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒的多重PCR检测试剂 盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对。3. -种用权利要求1所述多重PCR引物或权利要求2所述多重PCR检测试剂盒中的引物 检测对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒的用途。4. 一种用权利要求1所述多重PCR引物或权利要求2所述多重PCR检测试剂盒中的引物 检测对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒的方法。5. 权利要求4所述检测对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒的方法，其特征 在于，步骤为， 提取总RNA; 合成cDNA; PCR检测，采用权利要求1所述多重PCR引物或权利要求2所述多重PCR检测试剂盒中的 引物；阳性对照为SEQ ID N0:7，SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9的核酸序列混合作为模板，阴 性对照为:不含有对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒任一病毒的任意cDNA核酸 序列。 结果判定： 当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为120-130bp时，结果为对虾传染性肌肉 坏死病毒阳性;如果没有120-130bp条带，则为对虾传染性肌肉坏死病毒阴性； 当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为220-230bp时，结果为黄头病毒阳性； 如果没有220-230bp条带，则为黄头病毒阴性； 当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为325-335bp时，结果为桃拉病毒阳性； 如果没有325-335bp条带，则为桃拉病毒阴性； 当阴性对照出现条带时，表明操作过程中有试剂污染，检测结果无效； 当阳性对照无条带时，表明引物或者试剂盒中试剂降解，引物或试剂盒失效。6. 权利要求5所述检测对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒的方法，其特征 在于，所述PCR检测的PCR反应体系为：25yL反应体系中包含有10倍浓度的含镁离子的Taq DNA聚合酶缓冲液2.5yL，Taq DNA聚合酶0.5yL，各引物终浓度为0.4μΜ，合成好待检测的 cDNA 模板 100ng。7. 权利要求5所述检测对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒的方法，其特征 在于，所述PCR检测的PCR反应条件为:95°C3分钟，1个循环;95°C30秒，56°C30秒，72°C30秒， 35个循环;72°C 10分钟，1个循环;4°C保存。
【专利摘要】本发明公开了一种同时检测对虾IMNV、YHV和TSV的多重PCR检测引物及试剂盒。所述引物分别为IMNV-F和IMNV-R、YHV-F和YHV-R、TSV-F和TSV-R，序列如SEQ？ID？NO:1和2，SEQ？ID？NO:3和4，SEQ？ID？NO:5和6所示。本发明的引物彼此间无交叉，且不与其它病毒产生交叉，假阳性率低，能够特异性的检测出分布于世界各地不同地区的3种病毒的病毒株，具有广泛适用性，具有非常高的特异性和敏感性，检测限低。同时对检测的病毒基因片段无需再进行克隆、测序和序列比对。一次实验即可检测出待测样品中是否含有这三种病毒中的一种、两种或三种。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105567875
【申请号】CN201610119826
【发明人】刘国胜, 陈明谅, 陈建明, 王蔚, 杨丽容
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年3月3日