灭菌的0. 22ym滤器过滤后方可使用。
[0065] 硝酸纤维素膜的处理
[0066] 将Millipore135型硝酸纤维素膜浸入甲醇中浸泡10min后，通风干燥后，置于 4°C保存。对用甲醇处理过的硝酸纤维素膜浸泡于封闭液②中于37°C浸泡lh，并用洗涤液 冲洗3次，放置于低温风干。
[0067] 用含有2%蔗糖溶液的PBST溶液将将腹水纯化制备的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆 抗体C12D1按1:1 (体积比）稀释，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上作为检测区 (T线），按照1yL/cm进行点膜，检测区靠近样品垫端；用PBST溶液将羊抗鼠二抗1:5 (体 积比）稀释，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上作为对照区（C线），按照1yL/cm进行点膜，对照区靠近吸水垫端。检测区和对照区的间隔为〇.5cm。制备好后放置于37°C 烘干，包装备用。
[0068] 上述的封闭液②配方如下：30mL的10%牛血清白蛋白（BSA)，150yLTween-20， 加入到250mL的0. 01mol/L的PBS中，然后用上述PBS定容到300mL。
[0069] 上述溶液配置好后均用一次性灭菌的0. 22ym滤器过滤后方可使用。
[0070] 将上述获得的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按照顺序依次粘附在PVC底 板上，均裁剪成〇. 5cm宽的小条，密闭封装即可，具体结构如下：
[0071] 包括PVC底板7,所述的底板7-端设置有样品垫1，样品垫1的一端通过金标垫 2与硝酸纤维素膜5相连接，硝酸纤维素膜5的另一端与吸水垫6相连接，所述的金标垫2 上包被有抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体一胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜5上设置 有一条包抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的检测区3和一条包被羊抗鼠二抗的对照区4。 [0072] 试验例1
[0073] 1、特异性试验
[0074] 将鸭坦布苏病毒、鸭副黏病毒、鸭流感病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒、I型鸭肝炎病 毒等病毒滴加到加样区进行检测。试验结果（表1)表明，鸭坦布苏病毒样品检测区和对照 区均出现红线，而鸭副黏病毒、鸭流感病毒、鸭瘟病毒、
[0075] 鸭圆环病毒、I型鸭肝炎病毒样品均在对照区出现红线，检测区不出现红线。
[0076] 这表明，鸭副黏病毒、鸭流感病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒、I型鸭肝炎病毒
[0077] 与本试纸条无交叉反应，显示出本试纸条具有良好的特异性。
[0078] 表1本发明试纸条特异性试验结果
[0079]
[0080] 注：" + "表示出现红色反应；表示无红色反应
[0081] 敏感性试验
[0082] 将坦布苏病毒阳性尿囊液分别按照1:10、1:50、1:100、1:1000稀释，用本发明的 试纸条分别检测观察试验结果。如图2所示可见1:100稀释的尿囊液检测区仍可显示红色， 而1:1000稀释病毒尿囊液检测区不显示红色。说明本发明的试纸条最低可检测的病毒浓 度为1:100,敏感性较高。
[0083] 重复性试验
[0084] 将鸭坦布苏病毒标准品分别稀释到20、40、80yg/mL三个不同浓度的样品溶液， 以及阴性样品用本发明的试纸条进行检测，每个浓度设定3个重复，利用三个批次配制成 的试纸条进行检测，检测结果完全一致，证明本发明的试纸条检测结果稳定可靠，具有良好 的重复性。
[0085] 稳定性试验
[0086] 将同一批次制备出的试纸条置于室温下，并与生产日期后的当天、1个月、3个月、 6个月、8个月对坦布苏病毒标准品进行检测。结果表明，置于室温下6个月之内，检测区和 对照区均可显示红色，说明本发明的试纸条可以在室温下保存6个月，具有较长的保存时 间。
[0087] 试验例2
[0088] 通过收集2013-2014年度，发病疑似为鸭坦布苏病病毒的病料50份，经山东农业 大学实验室RT-PCR检测为鸭坦布苏病毒感染阳性。
[0089] 发明人采集病死鸭的大脑、卵泡等组织，利用本发明制备的胶体金试纸条进行相 关检测，检测结果阳性的为50份，与经实验室检测的RT-PCR方法检测完全一致，证明本 发明所提供的试纸条不需要任何的设备，就可以进行临床样本的检测，且特异性强，操作简 便、快速，结果显示直观、准确，能广泛应用于基层对于鸭坦布苏病毒病的检测。
【主权项】
1. 一种快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条，包括PVC底板（7)，所述的底板（7) -端 设置有样品垫（1)，样品垫（1)的一端通过金标垫（2)与硝酸纤维素膜（5)相连接，硝酸纤 维素膜（5)的另一端与吸水垫（6)相连接，所述的金标垫（2)上包被有抗坦布苏病毒E蛋 白单克隆抗体一胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜（5)上设置有一条包抗坦布苏病毒E 蛋白单克隆抗体的检测区（3)和一条包被羊抗鼠二抗的对照区（4)，其特征在于： 所述金标垫（2)上包被的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体一胶体金标记物中的抗坦布 苏病毒E蛋白单克隆抗体为A12D3 ; 所述检测区（3)上的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体为C12D1。2. 根据权利要求1所述的快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条，其特征在于：所述的 抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3是通过生物保藏编号：CCTCCC201546的杂交瘤细 胞分泌获得的； 所述的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体C12D1是通过生物保藏编号：CCTCCC201547的 杂交瘤细胞分泌获得的。3. 制备权利要求1所述快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条的方法，其特征在于：具 体步骤如下： 1) 在硝酸纤维素膜层的不用位置上分别包被抗坦布苏病毒E蛋白的单克隆抗体和羊 抗鼠IgG的二抗，分别形成检测区和质控线；具体步骤为：将抗坦布苏病毒E蛋白的单克隆 抗体C12D1溶液按1:1 (体积比）稀释后按照lul/cm的速度喷于检测层上作为检测区，将 羊抗鼠IgG二抗按1:5 (体积比）稀释后按照lul/cm的速度喷于检测区下方的检测层上作 为质控线，置于37°C下烘干干燥，从而制备得到检测区和质控线； 2) 金标垫的制备，具体步骤为：以柠檬酸钠还原法制备金溶液，即在100mL沸腾的 0.01% (体积比）氯金酸水溶液中加入2ml的10% (质量比）柠檬酸三钠溶液，可获得直 径在20nm左右的胶体金； 通过预混的方式以0. 2mol/L的K2CO3溶液调节上述获得的胶体金pH至8. 5,以将待标 记的抗坦布苏病毒E蛋白的单克隆抗体A12D3按照1 :15 (体积比）加入到上述调整pH之 后的胶体金中，标记20min后，再向上述标记后的胶体金溶液中加入10 %的BSA水溶液；至 BSA的终浓度为1 %，后继续搅拌30min，加入10 %PEG20000,至PEG20000终浓度为0. 2 %。 继续搅拌IOmin后，4°C、2000rpm离心30min，除去未结合的胶体金颗粒，4°C、15000rpm离心 lh，弃上清液，获得初步纯化的金标抗体；将上述纯化后的金标抗体液用铺金法均匀的包被 于金标垫上置于37°C作用lh，4°C通风冻干，真空包装，置于4°C保存； 3) 按前述顺序采用现有工艺和设备组装既得目标试纸条。
【专利摘要】本发明提供了一种快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条，包括PVC底板，所述的底板一端设置有样品垫，样品垫的一端通过金标垫与硝酸纤维素膜相连接，硝酸纤维素膜的另一端与吸水垫相连接，所述的金标垫上包被有抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上设置有一条包抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的检测区和一条包被羊抗鼠二抗的对照区，采用这种结构的试纸条具有特异性强，操作简便、快速，结果显示直观、准确，减少投资和检测成本，应用范围广等优点，能广泛应用于基层对于坦布苏病毒的检测。CCTCC NO： C20154620150712
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/569
【公开号】CN105203757
【申请号】CN201510604319
【发明人】刁有祥, 陈浩, 冯强, 杨国平, 唐熠, 张英
【申请人】山东农业大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月21日