一种可评估溶栓前脑出血风险的血清标记物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫检测分析领域，具体涉及一种试剂盒及其应用，尤其涉及一种可评估溶栓前脑出血风险的血清标记物及其应用。
【背景技术】
[0002]急性缺血性脑卒中是中老年人的常见病和多发病，其致残、致死率高，应用组织型纤溶酶原激活物(tPA)早期溶栓是目前唯一经美国FDA批准的缺血性卒中疗法。但溶栓后脑出血风险一直为临床医生所顾忌，一旦发生严重脑出血，病人死亡率高达80%。因此，如何减少脑出血发生、增加tPA溶栓治疗的安全性是长期以来困扰临床的重要课题。
[0003]目前tPA溶栓后脑出血风险既无法预判，也无有效手段控制。临床上目前可通过核磁共振(MRI)扫描来观察血脑屏障(BBB)是否有损伤。其检测原理是通过测定Gd-DTPA通透BBB的系数Ki (或称血-脑转运系数)来定量测定BBB损伤程度，但问题是，该检测需要耗时I小时甚至更长，这与“时间就是大脑”脑卒中急救共识不相符。研究表明，脑卒中发生后不可逆脑损伤进展很快，每分钟损失的神经元细胞数目可达190万。因此，利用MRI定量测定BBB损伤来评估tPA溶栓发生脑出血风险不被患者和临床医生所接受，而目前国内能在I小时内利用MRI定量测定BBB损伤的医院寥寥无几。
[0004]其次，目前已发现多种血清学指标与BBB损伤及溶栓后脑出血相关，包括MMP-9、c-FN、PA1-UTAFI和S100B。但这些指标的特异性和灵敏度无法满足临床预测脑出血风险的要求。此外，脑卒中发生后，上述指标升高往往出现在溶栓治疗时间窗以外，因此，其变化难以作为早期指标指导临床是否可以安全实施血管内溶栓。
[0005]与上述分子不同，Occludin蛋白是BBB的重要结构分子，其降解直接影响BBB的屏障功能。我们最近的研究发现，脑缺血2小时即可在受累的BBB检测到Occludin蛋白的降解，同时在外周血中检测该蛋白降解片段的升高。同时还发现，Occludin在外周血中的基础水平很低，BBB损伤严重时，外周血中Occludin降解片段水平显著升高，提示了溶栓治疗前外周血中Occludin蛋白水平变化反映BBB受损程度，并因此可预测溶栓后脑出血的风险。但目前尚没有将Occludin蛋白用于溶栓(给药)前外周血的检测，据此来判断溶栓后可能发生脑出血的风险，用于溶栓后脑出血风险的评估。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种可评估溶栓前脑出血风险的血清标记物及其应用，特别是一种检测可用于评估脑出血风险的新型血清标记物的试剂盒及其应用，以实现快速高效、准确、可靠的定量检测人血清中Occludin蛋白的浓度，用于有效评估溶栓后的脑出血风险。
[0007]为达到此发明目的，本发明采用了以下技术方案:
[0008]本发明的试剂盒包括两种:一种是采用包含试纸条形式的试剂盒时，其具有快速、简便、准确、成本低廉、特异性好和灵敏度高的特点，可在5-15min内读结果，快速评估tPA溶栓后脑出血风险；另一种是采用包含96孔过滤板形式的试纸盒，其同样具有快速评估tPA溶栓后脑出血风险的特点，可有效缩短反应时间、操作简单、灵敏度高、特异性好。上述这两种试剂盒均用于检测人血清中的Occludin蛋白。
[0009]由于脑卒中可分为缺血性和出血性两种，其中主要是缺血性中风，占到80%左右。目前来说，缺血性脑中风的治疗药物只有一种:tPA静脉溶栓。但溶栓治疗有可能导致严重脑出血，死亡率高达80%，由于目前医生无法在打针(静脉给予tPA)前准确评估打针后(溶栓后)脑出血的风险，所以有一部分脑中风病人因为接受了 tPA治疗发生严重脑出血而死亡。因此，如果医生在打针(静脉给予tPA)之前就可准确知道脑出血的风险，医生就可以选择溶栓或者不溶栓。
[0010]而本发明正是基于这种考虑，通过采用Occludin蛋白作为检测指标，即通过检测溶栓(给药)前外周血中Occludin蛋白的水平，据此来判断溶栓后可能发生脑出血的风险，从而有效避免了溶栓(给药)后发生脑出血的风险。
[0011]本发明通过采用试剂盒的形式来检测溶栓(给药)前外周血中Occludin蛋白的水平具有准确、快速、简便、成本低廉、特异性好和灵敏度高的特点，通常5-15min以内即可读取结果，从而有效指导医生用药。第一方面，本发明提供了一种检测血清标记物的试剂盒，其包括表面已偶联有抗-Occludin蛋白抗体的聚苯乙烯微球，用于定量检测人血清中Occludin蛋白浓度。
[0012]本发明中，所述表面已偶联有抗-Occludin蛋白抗体的聚苯乙稀微球上的抗-Occludin蛋白抗体为单克隆抗体。
[0013]本发明中，所述试剂盒还包括:96孔过滤板、标准品、样品稀释液、微球储存液、酶结合物、底物A、底物B和20 X洗涤液。
[0014]其中，所述96孔过滤板是底部有渗透性的滤膜并能通过抽真空进行洗涤的微孔板。
[0015]优选地，所述标准品为浓度为20_50ng/mL的Occludin蛋白冻干粉，例如可以是20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mLo
[0016]优选地，所述样品稀释液为每升含2-10g牛血清白蛋白、0.5-lmL Proclin 300、0.1-0.2mL Tween 20 的 0.0lM ρΗ7.4PBS0
[0017]优选地，所述微球储存液为每升含0.05-0.1 % BSA,0.01-0.02 % Tween,0.05-0.2% Proclin 300 的 0.0lM pH7.4PBS。
[0018]优选地，所述酶结合物为辣根过氧化酶标记的抗Occludin的多克隆抗体。
[0019]优选地，所述底物A为l-5mmol/L鲁米诺与l_3mmol/L对碘苯酸的混合液。
[0020]优选地，所述底物液B为l-3mmol/L的双氧化脲溶液。
[0021]优选地，所述20X洗涤液为每升含100_150g氯化钠、60_72.64g十二水合磷酸氢二钠、l-3g磷酸二氢钾、l-4g氯化钾、5-10mL Tween 20的水溶液。
[0022]本发明中所述的试剂盒，其优选由I块96孔过滤板、2瓶标准品、I瓶样品稀释液、表面己偶联有抗-Occludin蛋白抗体的聚苯乙烯微球、I瓶微球储存液、I瓶酶结合物、I瓶底物A I瓶、底物B I瓶、20X洗涤液、20片不干胶封片和I份使用说明书构成。
[0023]本发明中所述的试剂盒用于定量检测人血清中Occludin蛋白浓度的检测步骤如下:
[0024](I)标准品的稀释:每瓶标准品临用前以样品稀释液稀释至lmL，静置1min后，反复颠倒混勾，浓度为100ng/ml，做系列稀释，分别为:100ng/ml、50ng/ml、12.5ng/ml、
3.12ng/ml、0.78ng/ml、0.05ng/ml，样品稀释液作为 Ong/ml ；
[0025](2)加样:微球使用前中速振荡混匀，每孔加入10 μ I微球储存液，其中含50000±400个表面己偶联有抗-Occludin抗体的聚苯乙稀微球，用100 μ I洗涤液真空抽滤洗涤2-3次后，每孔分别加标准品或待检测样本50 μ 1，另设一空为空白，混匀，37°C振荡30min ；
[0026](3)洗板:使用真空栗抽滤，洗涤液洗涤3-4次；
[0027](4)加酶结合物:加入50 μ I酶结合物，混匀，37°C振荡30min ；
[0028](5)洗板:同(3)洗涤3-4次；
[0029](6)加底物:每孔先后加入底物液A、底物液B各50 μ 1，避光显色1min ；
[0030](7)测定:避光显色1min后在化学发光仪上读出各孔相对发光度(RLU);
[0031](8)标准曲线的制作:以标准品的浓度为横坐标，RLU值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的相对发光度(RLU)由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释数；或计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的相对发光度(RLU)代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
[0032]本发明所述的试剂盒的应用原理是:将抗Occludin蛋白抗体交联在聚苯乙稀微球上，在液相环境中与被测样本反应以后，再与辣根过氧化物酶(horse radishperoxidase，HRP)标记的抗Occludin蛋白二抗反应，形成抗体_抗原_抗体复合物(双抗体夹心复合物)，然后再同发光底物反用，通过化学发光检测仪检测其相对发光强度(RLU)，根据标准曲线确定被检测样本中Occludin蛋白的浓度，即可快速测知待检测的患者血清中的Occludin蛋白的浓度。
[0033]第二方面，本发明还提供了另外一种检测血清标记物的试剂盒，其包括试纸条，所述试纸条包括结合物垫，所述结合垫上喷涂有焚光染料标记的可与Occludin蛋白特异性结合的单克隆抗体，同样用于定量检测人血