ng/mL。
[0083](2)加样:微球使用前中速振荡混匀，每孔加入10 μ L约含50000个包被Occludin蛋白单抗的微球，用100 μ L洗涤液真空抽滤洗涤2次后，每孔分别加标准品或待检测样本50 μ L，另设一孔为空白，混匀，37°C振荡30min。
[0084](3)洗板:使用真空栗抽滤，洗涤液洗涤3次。
[0085](4)加酶结合物:加入50 μ L酶结合物，混匀，37°C振荡30min。
[0086](5)洗板:同(3)洗涤3次。
[0087](6)加底物:每孔先后加入底物液A、底物液B各50 μ L，避光显色1min。
[0088](7)测定:避光显色1min后在化学发光仪上读出各孔相对发光度(RLU)。
[0089](8)标准曲线的制作:以标准品的浓度为横坐标，RLU值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的RLU由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的RLU代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，SP为样品的实际浓度。
[0090]实施例4
[0091]对实施例2的定量检测人血清中Occludin蛋白浓度的检测试剂盒的评价:
[0092](I)线性范围:用样品稀释液将Occludin蛋白抗原以2倍梯度稀释以下系列浓度:100ng/mL、50ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.13ng/mL、l.56ng/mL、0.39ng/mL、0.1Ong/mL、0.025ng/mL、0.013ng/mL、Ong/mL进行检测，每个浓度样本重复检测3次，以样本浓度为横坐标，相对发光强度为纵坐标作图，经过统计学分析，线性范围在0.025ng/mL?10ng/
mLo
[0093](2)最低检出限:将去除Occludin蛋白的零值血清分成20份进行检测，测定其浓度，计算平均值及标准差，计算平均值与标准差的2倍之和，在标准曲线上查出本发明的最低检出限为10pg/mL。
[0094](3)回收率:取3份临床样本分别加入2ng/mL、I Ong/mL、20ng/mL浓度的血清样本测定样品的回收率，回收率计算公式为:回收率(％ )=(回收样本血清浓度(ng/mL)-基础样本浓度(ng/mL))/加入的样本血清浓度(ng/mL) X 100%。
[0095]结果显示回收率分别为94.9%、102.7%,96.1%，平均回收率为97.9%。
[0096](4)特异性:取10份阴性质控血清检测无假阳性。
[0097]实施例5
[0098]制备检测人血清中的Occludin蛋白的试剂盒的方法如下:
[0099](I)反应膜的制备:用磷酸盐缓冲液将Occludin蛋白抗原稀释到包被浓度1.0mg/ml，将羊抗人多抗体稀释至包被浓度为1.5mg/mL，用划膜喷金标机将两种溶液分别划到硝酸纤维膜上，将膜干燥后保存，干燥温度为37°C，干燥时间为120min ；
[0100](2)金结合垫的制备:将胶体金进行标记，以转速为12000r/min离心30min，弃上清，加入胶体金结合物稀释液至原体积的1/10，然后用混合液浸润裁切好的聚酯膜，制备成金结合垫；
[0101](3)组装切条:在反应膜所在的PVC底板上揭去2.0cm不干胶，粘贴上吸水纸，使纸下部压住反应膜，揭去底板上的1.7cm不干胶，分别粘贴上金结合垫和样品垫，金结合垫的上部压住反应膜1mm，样品垫上部压住金结合垫下部1mm，组装好后，用切条机将试纸切成3.6±0.1mm试纸条，卡盒装试纸条进行塑封后盒装；
[0102](4)加样缓冲液的制备:称取表面活性剂TWEEN-200.5g，加20mM PB缓冲液搅拌使其充分溶解，再定容至100mL，2-8°C保存。
[0103]实施例6
[0104]将实施例5的试剂盒用于血清样品中Occludin蛋白的检测:
[0105](I)从包装盒取出试剂，在I小时内应尽快地使用，特别是在室温高于30°C或在高度潮湿的环境中。
[0106](2)将试纸条平放在操作台面上，作好标识，取2 μ L血清标本或全血加在试剂条的加样处，轻轻接触膜面，使样本扩散到膜面上。
[0107](3)尽快在试纸条的后段缓慢加入缓冲液2-3滴，见有液体流到膜面计时开始。
[0108](4)等待红色条带的出现，测试结果在5-15分钟内读取。
[0109]其中，两条红色条带出现时，一条位于检测区(T)，另一条位于质控区(C)，表明含有Occludin蛋白；仅质控区出现一条红色条带，在检测区(T)内无红色条带出现时，表明不含有Occludin蛋白；当质控区(C)未出现红色条带时，表明检测无效。
[0110]本实施例的试剂盒的阳性参考品和阴性参考品符合率为100%。一份阳性参考品血清测定，均显阳性，且显色度均一。
[0111]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1.一种检测血清标记物的试剂盒，其特征在于，其包括表面已偶联有抗-Occludin蛋白抗体的聚苯乙稀微球，用于定量检测人血清中Occludin蛋白浓度。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述表面已偶联有抗-Occludin蛋白抗体的聚苯乙稀微球上的抗-Occludin蛋白抗体为单克隆抗体。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括:96孔过滤板、标准品、样品稀释液、微球储存液、酶结合物、底物A、底物B和20X洗涤液。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述96孔过滤板是底部有渗透性的滤膜并能通过抽真空进行洗涤的微孔板； 优选地，所述标准品为浓度为20-50ng/mL的Occludin蛋白冻干粉； 优选地，所述样品稀释液为每升含2-10g牛血清白蛋白、0.5-lmL Proclin300、0.l-0.2mL Tween 20 的 0.0lM ρΗ7.4PBS ； 优选地，所述微球储存液为每升含0.05-0.1% BSA,0.01-0.02% Tween,0.05-0.2 %Proclin 300 的 0.0lM pH7.4PBS ； 优选地，所述酶结合物为辣根过氧化酶标记的抗Occludin的多克隆抗体； 优选地，所述底物A为l-5mmol/L鲁米诺与l_3mmol/L对碘苯酸的混合液； 优选地，所述底物液B为l-3mmol/L的双氧化脲溶液； 优选地，所述20X洗涤液为每升含100_150g氯化钠、60-72.64g十二水合磷酸氢二钠、l_3g磷酸二氢钾、l_4g氯化钾、5-10mL Tween 20的水溶液。5.一种检测血清标记物的试剂盒，其特征在于，其包括试纸条，所述试纸条包括结合物垫，所述结合垫上喷涂焚光染料标记的可与Occludin蛋白特异性结合的单克隆抗体，用于定量检测人血清中Occludin蛋白浓度。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述结合垫上喷涂的可与Occludin蛋白特异性结合的单克隆抗体为鼠抗单克隆抗体。7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括加样缓冲液； 优选地，所述加样缓冲液为含有0.2-0.5g/mL表面活性剂TWEEN-20的PB溶液； 优选地，所述试纸条还包括:底衬以及设在底衬上并顺次搭接粘贴的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上设有至少一条检测线和一条质控线。8.如权利要求1-7任一项所述的试剂盒用于在tPA溶栓前检测评估脑出血风险的血清标记物中的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测在tPA溶栓前检测评估脑出血风险的Occludin蛋白中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种可评估溶栓前脑出血风险的血清标记物及其应用。本发明提供了一种试剂盒，用于检测人血清中的Occludin蛋白，主要采用以下两种形式，其中，当本发明采用包含试纸条的试剂盒时，其具有快速、简便、准确、成本低廉、特异性好和灵敏度高的特点，测试溶栓前外周血中Occludin蛋白水平的结果可在5-15min内读取；当本发明采用包含96孔过滤板形式的试纸盒时，其同样具有快速诊断溶栓前外周血中Occludin蛋白水平的特点。本发明通过采用试剂盒的形式来检测溶栓(给药)前外周血中Occludin蛋白的水平能够有效判断溶栓后可能发生脑出血的风险，从而指导医生用药，具有重要的临床意义。
【IPC分类】G01N33/535
【公开号】CN105203749
【申请号】CN201510609071
【发明人】刘文兰, 徐迹, 李维平
【申请人】深圳市第二人民医院
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月22日