白单克隆 抗体C12D1的检测区3和一条包被羊抗鼠二抗的对照区4。
[0033] 实施例2抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备
[0034](1)E蛋白表达纯化
[0035] 采用常规方法从病鸭体内分离坦布苏病毒，通过构建大肠杆菌原核表达载体表达 坦布苏病毒E蛋白，并利用尿素法纯化E蛋白；
[0036] (2)动物免疫
[0037] 采用⑴中得到的纯化的E蛋白作为免疫抗原免疫6周龄雌性BALB/c小鼠， 100yg/只。第一次免疫采用弗氏完全佐剂与抗原比例1:1 (体积比）乳化，第二、三次免疫 采用弗氏不完全佐剂与抗原比例1:1 (体积比）乳化，三次免疫方式均为腹腔注射，免疫周 期间隔为14天；
[0038] (3)细胞融合和亚克隆化
[0039] 第三次免疫后7天，采用尾部静脉采血法检测抗体效价并建立单抗筛选E-ELISA 方法。通过测定效价，选择抗体效价在5X103以上的小鼠，细胞融合之前3天用0. 9%的 生理盐水稀释的E蛋白到200yg/ml，进行加强免疫，剂量为100yg/只；三天后，将小鼠眼 眶采血后致死小鼠，并将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞采用PEG融合法进行细胞融合；待 融合细胞长满96孔培养板底部面积1/3时，采用建立的筛选E-ELISA方法筛选阳性克隆细 胞，对筛选出的细胞采用有限稀释法进行亚克隆化，亚克隆化2- 3次检测后，达到阳性率 100%，即可得到阳性杂交瘤细胞，所获得的阳性杂交瘤细胞为两株，其生物保藏编号分别 为（CCTCCC201546)和（CCTCCC201547)，分别分泌抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3 和C12D1。
[0040] (4)单克隆抗体的制备与纯化
[0041] 采用腹水制备法大量制备单克隆抗体。给小鼠腹腔注射杂交瘤细胞前7天，腹腔 注射灭菌的液体石蜡，0. 5ml/只。对筛选出的杂交瘤细胞株进行大量培养后，对细胞进行计 数，调整到1X106个/0. 5ml，每只小鼠注射0. 5ml用0. 9%生理盐水稀释的细胞数量达到 1X106个，待小鼠腹部明显膨大后，抽取小鼠的腹水，并采用正辛酸-饱和硫酸铵法纯化小 鼠的腹水，即可得到所需单克隆抗体A12D3和C12D1。所获单克隆抗体置于-20°C保存。
[0042] 利用正辛酸一一饱和硫酸铵法纯化收获的单克隆抗体。取离心后的腹水1.5ml 与3ml的0. 06mol/LPH为4. 8的醋酸盐缓冲液混合，室温充分搅拌lOmin后，逐滴缓慢 加入正辛酸33y1/ml腹水，边加入边搅拌，室温搅拌30min，4°C静置2h，使其反应完全。 4°C12000r/min离心30min后，弃去沉淀。而后利用0.lmol/L的氢氧化钠调节溶液的PH 到7. 4。在磁力搅拌器的作用下缓缓向溶液中加入饱和的硫酸铵溶液（饱和硫酸铵的终体 积不超过总体积的45% )，待溶液出现白色浑浊时，停止滴加，室温搅拌30min，放置于4°C 静置5h。4°C12000r/min离心30min后，弃去上清。沉淀用2ml0? 01mol/LPH为7. 4的 Tris-Cl溶液重悬后加入到合适的透析袋中，用0.Olmol/LPH为7. 4的Tris-Cl溶液做透 析缓冲液进行室温透析36h，期间每12h更换一次透析缓冲液。透析结束后吸取透析袋中的 液体加入到2ml离心管中即为纯化好的单克隆抗体A12D3和C12D1。
[0043] 纯化后的单克隆抗体用紫外光分光光度计将样品用0.9%生理盐水稀释10倍后 在0D260nm和0D280nm的光吸收值下测量纯化蛋白的浓度，利用下述计算公式：蛋白质 浓度（mg/mL) = (1.450D280-0.740D260)X10,计算得到纯化好的单克隆抗体的浓度为 1. 4mg/mL。（0D280和0D260分别是蛋白质溶液在280nm和260nm波长下的光吸收值。
[0044] 实施例3抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体一一胶体金标记物制备
[0045] (1)胶体金的制备
[0046] 用新制的超纯水将1 %的氯金酸稀释成0. 01 % (质量百分含量），加入到已经硅化 处理过的l〇〇ml的锥形瓶中，用微波炉加热煮沸。而后准确吸取2. 0ml1 %的柠檬酸三钠缓 慢加入到锥形瓶中，振荡均匀后，继续加热直到溶液由黑色变为灰色后变为红色，取出。冷 却到室温之后用新制的超纯水恢复到原体积后，加入适量的〇. 02%的~&队后，可经一次性 灭菌滤器过滤后，放置于4°C保存。新制的合格的胶体金溶液应该是外观纯净、稳定、透亮、 无沉淀物和漂浮物的溶液。制备好后，置于电镜下观察，选择适宜直径的胶体金颗粒。
[0047] (2)抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体一一胶体金标记物的制备
[0048] 在磁力搅拌器的搅拌下，用0.2mol/L的碳酸钾调整胶体金溶液的PH到8. 5,按照 每毫升胶体金的溶液加入1:15稀释的抗体的标准加入抗坦布苏病毒E蛋白的单克隆抗体 (A12D3)，加入时应缓慢逐滴加入，速度不宜过快，防止标记不均勾。避光搅拌20min后，加 入10%牛血清白蛋白（BSA)，使其溶液终浓度达到1%。继续搅拌30min后，加入一定量的 10%PEG20000使其终浓度达到0. 2%，继续搅拌lOmin后，取出放置于4°C保存。
[0049] 静置一段时间后，将上述溶液于1500r/min低速离心lh，弃去沉淀；再将上清液以 15000r/min4°C离心lh，弃去上清；将剩余的沉淀以初始体积大小的含有1%BSA，0. 05% PEG20000和2%蔗糖的0. 01MpH8. 0的PBS溶液溶解，然后继续上述步骤，反复重复冲洗 3次，最后的沉淀溶解于1/10初始体积的1%854,0.05%?￡620000和2%蔗糖的0.0说 pH8. 0的PBS溶液中，放置于4°C保存，并利用电镜观察标记效果。
[0050] 上述的有关溶液配方如下：
[0051] 10%牛血清白蛋白（BSA) :10g的牛血清白蛋白（BSA)加入到100mL的超纯水中。
[0052] 10%PEG20000 :10g的PEG20000 加入到 100mL的超纯水中。
[0053] 10%蔗糖溶液：1(^的蔗糖固体溶解于10〇!^的超纯水中。
[0054] 1%85厶，0.05%卩￡620000和2%蔗糖的0.01]??118.0?85溶液：3111110%85八溶 液，15yL10%PEG20000溶液，6mL的10%蔗糖溶液加入到21mL0. 01MpH8. 0PBS溶液中。
[0055] 上述溶液配置好后均用一次性灭菌的0. 22ym滤器过滤后方可使用。
[0056] 实施例4试纸条的制备
[0057] 金标垫的制备
[0058] 将GL0194型玻璃纤维素膜浸入到封闭液①中于37°C浸泡lh，用洗涤液清洗3次， 然后通风干燥后，剪成0. 5cm宽的长条，用铺金法将实施例3中制备好的抗坦布苏病毒E蛋 白单克隆抗体一一胶体金标记物均匀的包被于该玻璃纤维素膜上置于37°C作用lh，4°C通 风冻干，真空包装，置于4°C保存。
[0059] 上述的封闭液①配方如下：30mL的10%牛血清白蛋白（BSA)，150yL10% PEG20000溶液，60mL的10%蔗糖溶液加入到200mL的0. 01mol/L的PBS中，然后用上述PBS 定容到300mL。
[0060] 洗涤液配方如下：150yLTween-20加入到300mL的0? 01mol/L的PBS中。上述 溶液配置好后均用一次性灭菌的〇. 22ym滤器过滤后方可使用；
[0061] 样品垫的制备
[0062] 将GL-b01型样品垫浸泡于封闭液②中于37°C浸泡lh，用洗涤液清洗3次，然后通 风干燥后，裁剪成〇. 5cm宽的长条，真空包装，置于4°C保存。
[0063] 上述的封闭液②配方如下：30mL的10%牛血清白蛋白（BSA)，150yLTween-20， 加入到250mL的0. 01mol/L的PBS中，然后用上述PBS定容到300mL。洗涤液配方如下： 150yLTween-20 加入到 300mL的 0? 01mol/L的PBS中。
[0064] 上述溶液配置好后均用一次性