专利名称：一种海洋细菌新型酯酶及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种海洋细菌新型酯酶及其制备方法与应用。具体的说，涉及海洋细菌Pelagibacterium halotolerans B2T中酯酶基因pe8及利用该酯酶手型催化3_ (4_氟苯基)戊二酸二甲酯生产药物中间体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的方法。
背景技术：
光学纯的(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯是一系列重要医药中间体的前体。其中最具代表性的是左旋帕罗西汀盐酸盐。它可以使突触间隙中的5-羟色胺(5-HT)浓度增高，发挥抗抑郁作用，对其它递质作用较弱，对植物神经系统和心血管系统的影响较小，作为选择性中枢神经5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂(SSRI)。临床上被广泛应用于治疗抑郁症，强迫症，惊恐障碍或社交焦虑障碍等疾病。近年来，抗抑郁药物帕罗西汀在国内外的市场需求与日俱增，其合成方法也在全球备受关注。因此，探索其简便，高效经济的制备方法成为科学界十分活跃的课题。合成的方法有化学法和酶法，而酶法由于它的高效、绿色和环保等优点成为研究的首选。Yu 等(TetRahedRon Lett.41 (2000)，5647-5651.)用猪肝脏酯酶选择性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，得到(S)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯，虽然ee值与产率高达95%和86%，但是S构型的产物并不是合成左旋帕罗西汀正确构型前体。Lopez-GaRcia 等(TetRahedRon AsymmetRy.14 (2003), 603-609.)在有机溶剂中对3- (4-氟苯基)戊二酸二甲酯进行氨解反应，虽然取得了较高的ee值但产率却不尽如人意。最近，Liu等(PRocess Biochem.47 (2012)，1037-1041.)利用来自于 CandidaantaRctica的固定化脂肪酶(Novozym435)催化该反应,得到(R) _3_(4_氟苯基)戍二酸单甲酯，虽然产率和ee值都很高，但是由于商品化酶昂贵的价格，不适用于大规模工业化生产。由于海洋微生物酯酶通常具有与其生存环境相关的特性，譬如良好的耐盐性、耐热性和良好的手性选择性等，为此我们克隆了海洋细菌PelagibacteRium halotoleRansB2T中酯酶基因pe8并将其在大肠杆菌Rosetta中高度可溶性表达。本发明利用该酶催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯进而生产药物中间体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯。通过对其反应条件的优化，使其转化率和手性选择性大大提高。由于该酶能在表达菌株中高度可溶性表达，并且表现出良好的耐盐、耐碱性及手性选择性，因此可以作为工业化生产抗抑郁药物中间体的潜在用酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种海洋细菌新型酯酶、其编码基因及其制备方法，以及利用该酯酶生产(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的方法。本发明通过PCR方法，从新型海洋细菌Pelagibacterium halotolerans B21'中意外克隆到一种新型酯酶PE8。海洋细菌Pelagibacterium halotolerans B2T系发明人之一许学伟等从东海海水样品中分离得到(相关论文发表于International Journalof Systematic and Evolutionary Microbiology ;2011 ;61:1817 - 1822),该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心并可提供给公众使用，保藏编号为CGMCC1.7692τ，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所(100101)，保藏日期为2008年6月。本发明将目前发表的所有酯酶按照不同的家族进行氨基酸多序列比对，找到核心保守序列，然后利用相关软件(例如C0DEH0P)寻找可能的兼并引物。依据引物的基本原则和要求:简并度尽可能小、Tm值尽可能高、上下游引物之距离尽可能大、上下游引物的TM值尽可能相近等，选择适宜的兼并引物。经过比对，本发明设计了一对扩增酯酶全基因的引物。上游引物为pe8F(5’ -AGGACATATGACCGAACCCGTAAAG-3’，Nde I)，下游引物为 pe8R (5，-CGATAAGCTTCTAGAGGATCTCGCG-3’，HindIII) ο 以论文(International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology ；2011 ；61:1817 - 1822)中报道的菌株 Pelagibacterium halotolerans B2T(CGMCC1.7692T)为模板进行PCR扩增，意外获得一种全新的酯酶pe8基因的全长序列，其特征在于全长660bp (核苷酸序列如Seq ID.NO:1所述)。该基因编码的酯酶PE8含219个氨基酸(氨基酸序列如Seq ID.NO:2所述)，与已公布的来自于菌株Parvibaculumlavamentivorans DS-1 的酯酶(YP_001412908)的同源性低至 46%。酯酶ΡΕ8的系统进化树分析如附图
6所示，表明ΡΕ8和其相似的酯酶属于familyVI脂类水解酶。在不影响酯酶PE8蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有酯酶PE8活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的酯酶PE8突变体具有至少与SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列90%以上的同源性，更优选具有至少95%以上的同源性，最优选具有至少99%以上的同源性。同理，本发明还保护对SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留酯酶PE8蛋白生物学活性的DNA分子。优选的酯酶PE8突变体基因具有至少与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列90%以上的同源性，更优选具有至少95%以上的同源性，最优选具有至少99%以上的同源性。利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶pe8基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组酯酶PE8。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等，优选采用原核表达系统E.coli。 合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体。一个优选的例子是将本发明克隆到的酯酶基因连接到大肠杆菌表达载体pET28b(+)上，并转化到大肠杆菌Rosetta中，经诱导表达出高活性的重组酯酶PE8。所述的酯酶基因pe8的表达质粒和重组菌株的构建，表达质粒为pET28b (+)，转化方法为CaCl2转化法，转化菌株为大肠杆菌DH5 α。所述的利用大肠杆菌Rosetta可溶性表达ΡΕ8，表达菌株为大肠杆菌Rosetta (DE3),以20 μ g/ml卡那霉素和34 μ g/ml氯霉素为选择压力。所述的利用大肠杆菌Rosetta可溶性表达PE8，表达条件为37°C振荡培养至0D_达到0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达并转入25°C以振荡培养过夜培养。对上述得到的酯酶PE8的底物特异性的研究，研究方法为:600 μ I的反应体系中包括ImM各种碳链长度的对硝基苯酯，IOOmM Tris盐酸缓冲液(ρΗ7.5)和2.7 μ g纯酶蛋白，反应体系于30°C水浴中反 应3-15min，加等体积的乙醇终止反应，后迅速冷却，进行吸光值A4tl5的测定并将失活的酶液作为对照用于调零。研究表明，PE8对短链的底物具有很强的催化活性，催化对硝基苯酚乙酸酯(C2)的活性最高，对对硝基苯酚十二酸酯(C12)的活性极其微弱，且不能催化对硝基苯酚十四酸酯(C14)和对硝基苯酚十六酸酯(C16)，因此PE8属于脂类水解酶中的酯酶，对于短链酯类物质具有催化活性。此外，还研究了二价阳离子对酯酶活性的影响，研究方法为:反应体系分别加入IOmM Co2+，Cu2+，Ca2+，Mg2+，Zn2+，Sr2+，Mn2+，Ni2+，Ba2+ 和乙二胺四乙酸，然后测定酶的活性；测活体系为:在600 μ I的反应体系中包括IOOmM TRis-盐酸缓冲液(pH7.5)，ImM对硝基苯酚乙酸酯，2.7μ g酶液，于30°C水浴中反应3min，加等体积的乙醇终止反应，后迅速冷却，进行吸光值A4tl5的测定并将失活的酶液作为对照用于调零。测定结果表明PE8的活性会被Zn2+，Cu2+和Ni2+抑制，但是其他多种二价阳离子的存在下仍能保持较强的活性。本发明的另一目的是提供一种利用所述的酯酶PE8生产(R)-3_(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的方法。本发明所述的利用酯酶PE8生产(R)-3_(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的方法，包括以下步骤:(I)、利用酯酶PE8选择性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯制备(R)_3_(4_氟苯
基)戊二酸单甲酯，其反应方程式为:
权利要求
1.一种酯酶PE8蛋白，是具有如下(I)或(2)特征的蛋白质: (1)、其氨基酸序列与SeqID N0.2所示序列一致； (2)、将SeqID N0.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有酯酶PE8酶活性的由(I)衍生的突变体。
2.编码权利要求1所述的酯酶PE8蛋白的pe8基因，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示；或为对SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留酯酶PE8蛋白生物学活性的pe8突变基因。
3.携带有权利要求2所述基因的载体。
4.一种宿主，其由权利要求3所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。
5.一种利用权利要求1所述的酯酶PE8生产(R) - 3 - (4 -氟苯基)戊二酸单甲酯的方法，包括以下步骤: (1)、利用酯酶PE8选择性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯制备(R)- 3 - (4 -氟苯基)戊二酸单甲酯，其反应方程式为:
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述的酯酶PE8在反应体系中的浓度范围为 1- 100mg/ml。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述的反应体系中3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯的浓度为10 - lOOmM。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述的反应体系中所使用的有机溶剂为正己烷，异丙醚，甲苯，甲基叔丁基醚，异丙醇，丙酮，乙腈，甲醇，N, N - 二甲基甲酰胺，1，4 -二氧六环或二甲基亚砜其中的一种或其混合物。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述方法步骤(2)中的分离纯化方法包括萃取、减压干燥或其组合以分离出目标产物。
10.一种利用权利要求1所述的酯酶PE8生产(R) - 3 - (4 -氟苯基)戊二酸单甲酯的方法，包括以下步骤: (1)、利用酯酶PE8选择性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，反应体系中含有10 - 100mM3 - (4 -氟苯基)戊二酸二甲酯，1- 100mg/mlPE8粗酶粉，O - 30%(v/v)的有机溶剂；控制温度在20 - 40°C，反应时间为10 - 36h ； (2)、终止反应后，经萃取，减压干燥分离出目标产物(R)- 3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯。
全文摘要
本发明公开了一种海洋细菌新型酯酶以及利用该酯酶手性催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯生产药物中间体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的方法。将该酯酶基因克隆到表达质粒，转化大肠杆菌Rosetta。由于该酶能在表达菌株中高度可溶性表达，并且表现出良好的耐盐，耐碱，及手性选择性，因此可以作为工业化生产抗抑郁药物中间体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的潜在用酶。通过对其反应条件的优化，可以利用该酶催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯进而生产药物中间体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯，使其转化率和手性选择性大大提高。
文档编号C12N1/19GK103215238SQ20131012932
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月12日 优先权日2013年4月12日
发明者吴月红, 江夏薇, 许学伟, 魏笑莲, 王春生, 吴敏 申请人:国家海洋局第二海洋研究所