与igf1r结合的抗原结合蛋白的制作方法_6

胞，并以1 倍细胞裂解液（Cell Signaling公司）裂解。根据调整后适用于半面积ELISA板的厂商说 明，以PathScan磷酸-IGF-I受体β (Tyrl 131)夹心ELISA法来检测IGFlR磷酸化。
[0177] 实验结果：如图5所示，以50ng/ml IGFl处理的MCF7细胞表现出强力的IGFlR自 磷酸化（第二栏" + "与第一栏相比）。以抗IGFlR抗体预处理过的细胞表现出对IGFlR 激活的不同程度阻断。克隆A6、C2、B9、B10、B10VAR和C8表现出对IGFlR自磷酸化的最强 力拮抗作用，表明这些克隆是对抗癌症中的IGFlR的治疗干涉剂潜力候选者。数据表示为 三联样本的450nm吸光度（ABS 450nm)+/_标准误差，且直接与IGFlR磷酸化/激活成正比。
[0178] 实施例3
[0179] 本实施例展示了 IGFl在MCF7胸腺癌细胞中刺激的IGFlR自磷酸化的体外数据。 具体而言，本实施例展示了所述抗体阻断该自磷酸化的IC 5(I(达到最大抑制值的一半时的 浓度）。本实施例暗示了抗IGFlR抗体阻断IGFlR功能的体外效力。本例中的实验步骤如 下：取40000MCF7乳腺癌细胞，加入96孔细胞培养板含100 μ 1补充10% FBS的无酚红DMEM 培养基的孔中，24小时后，移除培养基，并以PBS洗涤细胞1次，然后在100 μ 1饥饿培养基 (无酚红DMEM+0 % FBS)中饥饿24小时。移除饥饿培养基后，以50 μ 1无血清培养基将抗体 稀释至2倍期望终浓度，然后添加至细胞中。培养10分钟后，向细胞中添加50 μ I IOOng/ ml IGF1，终浓度为50ng/ml。然后，培养细胞5分钟，以PBS+0. 1%钒酸钠洗涤细胞，并以1 倍细胞裂解液（Cell Signaling公司）裂解。根据调整后适用于半面积ELISA板的厂商说 明，以PathScan磷酸-IGF-I受体β (Tyrll31)夹心ELISA法来检测IGFlR磷酸化。
[0180] 实验结果：如图6所示，以抗IGFlR抗体预处理过的细胞表现出对IGFlR激活的不 同程度阻断。克隆B9表现出对IGFlR自磷酸化的最强力拮抗作用，其IC 5tl为94pM。数据 表示为三联样本的450nm吸光度（ABS450nm) +/-标准误差，且直接与IGFlR磷酸化/激活 成正比。数据以Graph Pad Prizm用非线性回归拟合进行分析和作图，以确定IC5tl值。
[0181] 实施例4
[0182] 本实施例展示了抗IGFlR抗体对IGFl刺激的细胞增殖的抑制作用的体外数据。 不受控制的细胞增殖是癌症的标志之一，且抗IGFlR抗体抑制IGFlR阳性癌细胞增殖的能 力则是治疗性化合物的必备条件之一。在本实施例中，将5000MCF7成胶质细胞瘤细胞移入 含补充了 10% FBS的100 μ 1无酚红DMEM培养基的96孔细胞培养板中，一式三份。24小 时后，移除培养基，以PBS洗涤细胞一次，然后向细胞中加入含20、2或0. 2 μ g/ml (2倍终浓 度）抗IGFlR抗体的50 μ 1无血清培养基。培养0. 5小时后，加入50 μ 1浓度为100ng/ml 的IGFl (IGFl终浓度为50ng/ml)。然后，培养细胞72小时，随后使用Promega细胞滴定96 非放射性细胞增殖实验试剂盒来评估增殖。增殖指数计算为IGFl处理样本（以抗体处理 或未以抗体处理）的0D570/仅细胞的0D570。
[0183] 实验结果：如图7所示，抗IGFlR抗体C2、B10和C8剂量依赖性地抑制了 IGFl刺 激的MCF7增殖。数据表示为平均增殖指数，计算为三联样本的IGFl处理样本（以抗体处 理或未以抗体处理）的0D570/仅细胞的0D570+/-标准误差。
[0184] 实施例8
[0185] 本实施例展示了 IGF2在MCF7胸腺癌细胞中刺激的IGFlR自磷酸化的体外数据。 本实施例展示了所述抗体阻断IGFlR在癌细胞中激活及功能的能力。本例中，将MCF7乳腺 癌细胞加入96孔细胞培养板含补充10% FBS的无酚红DMEM培养基的孔中。24小时后，移 除培养基，并以PBS洗涤细胞1次，然后在饥饿培养基（无酚红DMEM+0 % FBS)中饥饿18小 时。移除饥饿培养基后，以无血清培养基将抗体稀释至20 μ g/ml (2倍终浓度），然后添加至 细胞中。培养〇. 5小时后，向细胞中添加200ng/ml IGF2 (2倍终浓度），终浓度为100ng/ml。 然后，培养细胞5分钟，以PBS洗涤细胞，并以1倍细胞裂解液（CelI Signaling公司）裂解。 根据调整后适用于半面积ELISA板的厂商说明，以PathScan磷酸-IGF-I受体β (Tyrll31) 夹心ELISA法来检测IGFlR磷酸化。
[0186] 实验结果：如图8所示，以100ng/ml IGF2处理的MCF7细胞表现出强力的IGFlR 自磷酸化激活（第二栏"仅IGF2"与第一栏"未处理"相比）。以抗IGFlR抗体预处理过的 细胞表现出对IGFlR激活的不同程度阻断。克隆BlO表现出对IGFlR自磷酸化的最强力拮 抗作用，数据表示为三联样本的450nm吸光度（ABS450nm)+/-标准误差，且直接与IGFlR磷 酸化/激活成正比。


【主权项】
1. 一种与IGFlR表位结合且结合亲和性至少为10 _6M的IgG类全人抗体，该抗体的重 链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95%相同：SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 17,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 25,SEQ ID NO. 27,SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 31，及其组合；所述抗体的轻链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至 少 95%相同：SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 32,及其组合。2. 根据权利要求1所述的全人抗体，其特征在于，所述抗体的重链/轻链可变域序列选 自下列序列：SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 (本文称为GFAl)、SEQ ID NO. 3/SEQ ID NO. 4 (本文 称为 GFA3)、SEQ ID NO. 5/SEQ ID N0.6(本文称为 GFA5)、SEQ ID NO. 7/SEQ ID N0.8(本文称 为GFA6)、SEQ ID N0.9/SEQ ID NO. 10(本文称为GFA12)、SEQ ID NO. 11/SEQ ID NO. 12(本文 称为 GFC2)、SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14(本文称为 A2)、SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16(本 文称为八11)、5￡〇10勵.17/5￡〇10从).18(本文称为89)、5￡〇10勵.19/5￡〇10从).20(本 文称为B10)、SEQ ID N0.21/SEQ ID N0.22(本文称为A6)、SEQ ID N0.23/SEQ ID N0.24(本 文称为 C8)、SEQ ID N0.25/SEQ ID N0.26(本文称为 C4)、SEQ ID N0.27/SEQ ID N0.28(本 文称为 E2)、SEQ ID N0.29/SEQ ID N0.30(本文称为 B3)、SEQ ID N0.31/SEQ ID N0.32(本 文称为Dl2)，及其组合。3. -种Fab全人抗体片段，其具有来自重链的重链可变域和来自轻链的轻链可变 域，其中，重链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95%相同：SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 31，及其组合；且其轻链可变域序列与选自下组的氨 基酸序列至少 95%相同：SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 20,SEQ ID 勵.22、5￡〇10勵.24、5￡〇10勵.26、5￡〇10勵.28、5￡〇10勵.30、5￡〇10勵.32，及其组 合。4. 根据权利要求3所述的全人抗体Fab片段，其特征在于，所述抗体的重链/轻链可变 域序列选自下列序列：SEQ ID NO. 1/SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5/ SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7/SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9/SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11/SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 17/SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 19/SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 21/SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 23/SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25/SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 27/SEQ ID NO. 28,SEQ ID NO. 29/SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31/SEQ ID NO. 32,及其组合。5. -种单链人抗体，其具有来自重链的重链可变域、来自轻链的轻链可变域、连接重链 和轻链可变域的连接肽，其中，所述重链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95%相 同：SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 11、 SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 15,SEQ ID NO. 17,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 31，及其组合；所述轻链可变域序 列与选自下组的氨基酸序列至少95%相同：SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. KKSEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 28,SEQ ID NO. 30,SEQ ID NO. 32,及其组合。6. 根据权利要求5所述的全人单链抗体，其特征在于，所述单链全人抗体的重链/轻 链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3/SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5/SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7/SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9/SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11/SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 17/SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 19/SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 21/SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO.23/SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25/SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 27/SEQ ID NO. 28,SEQ ID 勵.29/5￡〇10勵.30、5￡〇10勵.31/5已〇10勵.32，及其组合。7. 根据权利要求5所述的全人单链抗体，其特征在于，所述全人单链抗体具有重链可 变域区和轻链可变域区，且所述单链全人抗体的重链/轻链可变域序列选自下列序列：SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3/SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5/SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7/ SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9/SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11/SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 17/SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 19/SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 21/SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 23/SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25/SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 27/SEQ ID NO. 28,SEQ ID NO. 29/SEQ ID NO. 30,SEQ ID NO. 31/SEQ ID NO. 32,及其组合。8. -种用于治疗广谱哺乳动物癌症或治疗炎性疾病或自体免疫疾病的方法，包括以抗 IGFlR多肽的有效剂量给药，其中所述抗IGFlR多肽选自：与IGFlR表位结合且结合亲和度 为至少KT 6M的IgG类全人抗体、具有重链可变域和轻链可变域的Fab全人抗体片段、具有 重链可变域、轻链可变域以及连接所述轻链和重链可变域的连接肽的单链人抗体，及其组 合； 其中，所述全人抗体的重链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95%相同：SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 15,SEQ ID NO. 17,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 25、SEQ ID N0.27、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 31，及其组合；且所述全人抗体的轻链可变 域序列与选自下组的氨基酸序列至少95%相同：SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6、 SEQ ID N0.8、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 18、 SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 28,SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 32,及其组合； 其中，所述Fab全人抗体片段的重链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95%相 同：SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 11、 SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 15,SEQ ID NO. 17,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 31，及其组合；且所述 Fab 全人 抗体片段的轻链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95%相同：SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 34,及其组合；以及 其中，所述单链人抗体的重链可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95%相同：EQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 15,SEQ ID NO. 17,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 31，及其组合；且所述单链人抗体的轻链 可变域序列与选自下组的氨基酸序列至少95%相同：SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 28,SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 32,及其组合。9. 根据权利要求8所述的治疗广谱哺乳动物癌症的方法，其特征在于，所述全人抗体 的重链/轻链可变域序列选自以下序列：SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3/SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5/SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7/SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9/SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11/SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17/SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 19/SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 21/SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23/SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25/SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 27/SEQ ID NO. 28, 5￡〇10勵.29/5￡〇10勵.30、5￡〇10勵.31/5￡〇10勵.32，及其组合。10. 根据权利要求8所述的治疗广谱哺乳动物癌症的方法，其特征在于，所述全人抗体 Fab片段具有重链可变域和轻链可变域，其中所述抗体的重链/轻链可变域序列选自以下 序列：SEQ ID NO. 1/SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5/SEQ ID N0.6、 SEQ ID NO. 7/SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9/SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11/SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 17/SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 19/SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 21/SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 23/SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25/SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 27/SEQ ID NO. 28,SEQ ID NO. 29/SEQ ID NO. 30,SEQ ID NO. 31/SEQ ID NO. 32,及其组合。11. 根据权利要求8所述的治疗广谱哺乳动物癌症的方法，其特征在于，所述全人单 链抗体具有重链可变域和轻链可变域，其中所述抗体的重链/轻链可变域序列选自以下序 列：SEQ ID NO. 1/SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5/SEQ ID N0.6、SEQ ID NO. 7/SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9/SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11/SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 17/SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 19/SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 21/SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 23/SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25/SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 27/SEQ ID NO. 28,SEQ ID NO. 29/SEQ ID NO. 30,SEQ ID NO. 31/SEQ ID NO. 32,及其组合。12. 根据权利要求8所述的治疗广谱哺乳动物癌症的方法，其特征在于，待治疗的广谱 哺乳动物癌症选自骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、任何儿科癌、肾癌、白血病、肾移行 细胞癌、沃纳-莫里森综合征、肢端肥大症、膀胱癌、肾母细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、良性前列 腺增生、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、胃癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、滑膜肉瘤、转移性类癌 相关性腹泻、血管活性肠肽分泌肿瘤、头颈部癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、孤立性浆细胞 瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、生殖细胞肿瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾横纹肌样 瘤、尤因肉瘤、软骨肉瘤、血液恶性肿瘤、慢性成淋巴细胞白血病、慢性骨髓单核细胞性白血 病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性粒细胞白 血病、慢性成髓细胞性白血病、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性 骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病、肥大细胞白血病、肥大细胞瘤、滤泡性 淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、蕈样真菌病、西扎里综合征、 皮肤T细胞淋巴瘤、慢性骨髓增殖性疾病、中枢神经系统肿瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、非成胶 质细胞瘤脑癌、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层瘤、髓母细胞瘤、星形细 胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤和脉络丛乳头状瘤、骨髓增生性障碍、 真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜 癌、类癌肿瘤、生殖细胞肿瘤、肝癌、格雷夫斯氏病及其组合。
【专利摘要】本公开提供了涉及或源自抗IGF1R抗体的组合物及方法。更具体地来说，本公开提供了与IGF1R结合的全人抗体、能够结合IGF1R的所述抗体片段及衍生物、包含所述片段的IGF1R结合性多肽。进一步而言，本公开提供了编码所述抗体、抗体片段和衍生物及多肽的核酸，包含所述多肽的细胞，用于制备所述抗体、抗体的片段和衍生物及多肽的方法，以及使用所述抗体、所述抗体片段及其衍生物和多肽的方法，包括治疗或诊断患有IGF1R相关疾病或症状的对象，包括各种炎性疾病和各种癌症。
【IPC分类】A61P35/00, A61K39/395
【公开号】CN104994872
【申请号】CN201380043624
【发明人】兰迪·加斯特沃特, 周贺钺, 陆国弟
【申请人】索伦托治疗有限公司
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2013年6月12日
【公告号】CA2875543A1, EP2863947A2, US20130344069, WO2013191982A2, WO2013191982A3