止血组合物的制作方法
【专利说明】止血组合物
[0001] 本发明涉及止血组合物领域。
[0002] 发明背景
[0003] 在损伤后，被触发来止住出血的一系列生理机制被称为止血。止血是非常复杂的 过程，其涉及多种分子以及细胞类型。为了便于研宄，止血可被再分为四个重叠的步骤： i )血管收缩，ii )伤口区域中的最初血小板栓的形成，iii)纤维蛋白抗性凝块的形成（凝 固级联），和iv )凝块溶解步骤或纤维蛋白溶解，伤口愈合过程从该步骤开始。
[0004] 通过在血浆中处于可溶的以及无活性形式的因子VII (FVII)与它的被称为组织 因子（下文也称作"TF"）的特异性受体的相互作用来启动凝固级联。在天然形式下，TF主 要位于血管周围多种细胞类型的表面。因此，在正常情况下，当发生损伤或者伤口时，它特 异性地与血浆分子接触。血管破裂之后，通过TF与FVII的相连启动凝固级联，触发多种凝 血因子之间随后的相互作用。最终结果是形成凝血酶（FIIa)，凝血酶随后将血浆中丰度很 高的纤维蛋白原（FI)转化为纤维蛋白纤维。这些纤维蛋白纤维是不可溶的，并且形成网， 其与血小板一起导致被称为纤维蛋白凝块的形成。
[0005] 为了在大量出血的情况下快速止血，各种各样的方法已经使用了几个世纪，例如 直接按压、纱布包扎、缝合线以及止血带。这些技术被称为"非主动"止血手段，当与不同类 型的敷料共同使用时，能够帮助止血过程。现在，最常用的敷料基于生物相容的以及可吸收 材料，例如胶原纤维、明胶或者氧化的纤维素纤维。
[0006] 为了试图提高外科止血效果，在过去几十年中，在研发含有"主动"组分的新产品 方面作了巨大的努力，在传统技术之外，所述产品可以有助于改善止血。在这一点上，市场 上已提供了药物（"主动止血手段"），其含有血浆浓缩物中的整套凝血因子或者基于高纯 度的分离因子。
[0007] 其中，凝血因子VII (FVII)、凝血因子VIII (FVIII)、凝血因子IX(FIX)和凝血因子 XI(FXI)已经在市场上销售了。它们应当通过静脉内途径使用以克服引起某些疾病（如血 友病）各种血浆缺陷。然而，只有凝血酶（也被称为激活因子II (FIIa))或者含有它的组合 物被用作局部止血剂，在手术中被施用于皮肤损伤或出血伤口。实际上，从50年代起，FIIa 已被广泛用于多种外科应用中。在很多公开的申请中，FIIa与海绵型、纱布或凝胶（如胶 原凝胶或明胶）的支持物相联。
[0008] FIIa在凝血级联的最后步骤起作用，直接作用于纤维蛋白原（FI)，促进快速的凝 块形成。因此，它的功效不需要其余凝血因子的激活。然而，为了保证它的功效，必须以高 浓度将FIIa施用于出血表面。这是因为，存在很多降低它们活性浓度的因素，例如：i)它 的浓度由于血液流动被稀释，ii)由于与它的天然抑制剂抗凝血酶III的相互作用，使其快 速失活，iii)由于它在血栓形成中被固定，存在额外的失活，和iv)通过纱布或外科方法中 的冲洗将其机械去除。这些因素（i)-(iv)迫使治疗性FIIa浓度的使用要高于生理凝块形 成所需的浓度。在建议使用肝素的某些外科操作中，建议的FIIa浓度是增加的。
[0009] 除了它的用途，由于FIIa被如此大量的使用，许多它的副反应已被公开。其中： (a)作为促炎症分子，这样的浓度可能引起非生理性炎症过程；(b)由于此种凝血酶在很多 情况下是从非人类的动物血浆中获得的，因而存在免疫原性风险，和（C)从人源血浆中获 得的FIIa具有含有外来物质的风险。除（a)-(C)之外，且与使用浓度无关，凝血酶本身不 能有效地引发适当的血液凝集蔓延，这是快速止血的要求。
[0010] 因此，鉴于以上，需要具有合适止血特征的其他止血组合物。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明的发明人发现，向凝血酶中增加脂化的组织因子（TF)，凝血酶的止血效果 大幅度提高，以这种方式，获得预期效果所需的凝血酶的量就可以降低。
[0013] 具体而言，当制备含有脂化的组织因子和凝血酶的组合的组合物时，发现凝血酶 的止血效果协同增加，按此种方式，当脂化的TF以每克组合物5-150ng浓度存在于组合物 中时，可能使用少量的凝血酶（每克组合物1~30IU)。
[0014] 如下文表2总结的，例如，使用含有IIU凝血酶/克组合物的本发明的一种组合物 时，当脂化的TF以5、15或150ng/克组合物的浓度并入时，凝血时间减少约至少5倍。当 含有3Π 或30Π 凝血酶/克组合物的组合物与5、15和150ng/克组合物浓度的脂化的TF 一起时，也观察到了凝血时间的明显减少。
[0015] 因此，这些实验数据允许得到以下结论，当凝血酶与脂化的TF组合时，观察到了 启动纤维蛋白网络形成所需时间的大大减少。这表示，与凝血酶一起施用脂化的TF，获得了 十分强的止血效果。这种在一定浓度下凝血酶与TF的组合产生的协同效果也在体内研宄 中观察到（图1)。
[0016] 因此，第一方面，本发明提供含有脂化的组织因子与凝血酶的组合的组合物，其 中，含有的凝血酶的量为每克组合物1-30IU，含有的脂化的组织因子的量为每克组合物 5_150ng〇
[0017] 除了以上所述，含有低浓度凝血酶的本发明组合物提供的止血效果与施用300UI 凝血酶/mL提供的止血效果基本相同。
[0018] 如以上所述，施用本发明的组合物，使用少量的凝血酶，止住出血需要的时间大大 减少。
[0019] 对于内部创伤的情况，这具有特别的关联性，在内部创伤的情况中，凝血酶或其它 止血产品压迫不足以有效止住出血，患者有很高的死亡风险。使用本发明的组合物，凝血发 生的更快，这表示对于内部创伤的情况有重大的优势，其中止住出血的时间对患者的存活 是关键的。
[0020] 此外，通过使用少量的凝血酶，本发明的组合物避免了本领域公开的与施用大量 凝血酶有关的问题，例如炎症和免疫原性副作用等。
[0021] 本发明第一方面的组合物可以包括其它组分，例如纤维蛋白溶解抑制剂、CaCl2 等，只要所述其它组分对凝血酶和脂化的组织因子的组合的止血活性没有负面影响。
[0022] 鉴于本发明第一方面的组合物的性质，它可以以药学或兽医学组合物的形式被使 用。
[0023] 因此，第二方面，本发明提供药学或兽医学组合物，所述组合物含有治疗有效量的 本发明第一方面的组合物，以及其它合适的药学或兽医学可接受的赋形剂和/或载体。
[0024] 鉴于本发明第一方面组合物的优良的止血性质（下面表2)，本发明第一方面的组 合物和第二方面的药学或兽医学组合物可以与合适的载体材料一起来配制止血组合物
[0025] 因此，第三方面，本发明提供止血组合物，所述组合物含有本发明第一方面所述的 组合物或者本发明第二方面所述的药学或兽医学组合物，和载体材料。
[0026] 第四方面，本发明提供本发明第一方面组合物或本发明第二方面的药学或兽医学 组合物作为止血剂的用途。
[0027] 如以上所讨论的，鉴于本发明的组合物的止血效果，其可用于治疗出血。
[0028] 因此，第五方面，本发明提供作为药物的本发明第一方面的组合物或本发明第二 方面的药学或兽医学组合物或本发明第三方面的止血组合物。该方面可制定为治疗疾病的 方法，所述方法包括向需要的个体施用治疗有效量的本发明第一方面的组合物或本发明第 二方面的药学或兽医学组合物或本发明第三方面的止血组合物，和其它合适的药学或兽医 学可接受的赋形剂和/或载体。
[0029] 第六方面，本发明提供用于治疗出血的本发明第一方面的组合物或本发明第二方 面的药学或兽医学组合物或本发明第三方面的止血组合物。
[0030] 本方面可选地被制定为本发明第一方面的组合物或本发明第二方面的药学或兽 医学组合物或本发明第三方面的止血组合物在制造用于治疗出血的药物中的用途。本方面 可选地被制定为治疗出血的方法，该方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的本发明第 一方面的组合物或本发明第二方面的药学或兽医学组合物或本发明第三方面的止血组合 物，和其它合适的药学或兽医学可接受的赋形剂和/或载体。
[0031] 又一方面，本发明提供本发明第一方面的组合物或本发明第二方面的药学或兽医 学组合物或本发明第三方面的止血组合物作为伤口愈合剂的用途。
[0032] 最后，本发明的组合物可提供为试剂盒。
[0033] 因此，第八方面，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的组合 物或本发明第二方面所述的药学组合物和施用器，所述施用器允许同时施用凝血酶和脂化 的组织因子。
[0034] 附图简要说明
[0035] 图1表示肝脏中单独切口的几种处理的凝血时间。每个柱对应三至六次独立实 验中得到的止血时间（以秒为单位）的平均值，X轴描述每个测试物。结果的统计学显著 性通过Newman-Keuls多重比较检验进行了确认，给出以下p值：柱6与柱5和柱3的p值 〈0.05。
[0036] 发明详细描述
[0037] 如上文所述，第一方面，本发明提供含有凝血酶和脂化的组织因子的组合物。
[0038] 在一个实施方案中，本发明第一方面的组合物是固体形式、半固体形式或液体形 式。
[0039] 本发明中，术语"固体形式"应被理解为包括粉末和固体泡沫。
[0040] 本发明中，术语"半固体形式"应被理解为包括药膏、糊剂、乳霜、软的或硬的凝胶、 悬浮液、乳剂和栓剂。
[0041] 本发明中，术语"液体形式"应被理解为包括液体泡沫、溶液和洗液。
[0042] 在一个实施方案中，本发明第一个方面的组合物包含浓度为每克组合物10-30IU 的凝血酶。
[0043] 在另一个实施方案中，本发明第一方面的组合物包含浓度为每克组合物1IU、每克 组合物3IU或每克组合物30IU的凝血酶。
[0044] 在另一个实施方案中，本发明第一方面的组合物包含浓度为每克组合物5-15ng 的脂化的组织因子。
[0045] 在另一个实施方案中，本发明第一方面的组合物包含浓度为每克组合物150ng的 脂化的组织因子。
[0046] 在另一个实施方案中，本发明第一方面的组合物选自：
[0047] -每克组合物IIU凝血酶和每克组合物5ng脂化的TF ;
[0048] -每克组合物IIU凝血酶和每克组合物15ng脂化的TF ;
[0049] -每克组合物IIU凝血酶和每克组合物150ng脂化的TF ;
[0050] -每克组合物3IU凝血酶和每克组合物5ng脂化的TF ;
[0051] -每克组合物3IU凝血酶和每克组合物15ng脂化的TF ;
[0052] -每克组合物3IU凝血酶和每克组合物150ng脂化的TF ;
[0053] -每克组合物30IU凝血酶和每克组合物5ng脂化的TF ;
[0054] -每克组合物30IU凝血酶和每克组合物15ng脂化的TF ;和
[0055] -每克组合物30IU凝血酶和每克组合物150ng脂化的TF。
[0056] 在另一个实施方案中，本发明第一方面的组合物选自：
[0057] -每克组合物IIU凝血酶和每克组合物150ng脂化的TF ;
[0058] -每克组合物3IU凝血酶和每克组合物150ng脂化的TF ;和
[0059] -每克组合物30IU凝血酶和每克组合物150ng脂化的TF ;
[0060] 在另一个实施方案中，本发明第一方面的组合物包含每克组合物20IU凝血酶和 每克组合物8ng脂化的TF。
[0061] 在本发明中，术语"组织因子（TF) "应被理解为完整的膜糖蛋白，其广泛分布于 动物界中。TF存在于多种细胞类型中，主要是在内皮下组织，对于启动凝血级联的外源途 径是必须的，该凝血级联导致产生FIIa并形成稳定的纤维蛋白凝块。可用在本发明中的 示例性 TF 蛋白包括人 TF(UniProtKB/Swiss-Prot. Version