调节止血的组合物及其用途的制作方法

专利名称：调节止血的组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明大体上涉及用于阻止或减少个体中的血液流失或出血的方法和试剂。更特 别地，本发明涉及向个体给予包含蛇毒FV的药物组合物以阻止或减少出血事件时的血液 流失或出血。
背景技术：
针对血管损伤发生血液凝固对于生物的持续生存是至关重要的。鉴于在手术或 损伤或外伤之后控制血液流失的重要性，鉴别促进血液凝固或抑制凝块分解的调节剂(例 如通过纤维蛋白水解性纤维蛋白溶酶/纤维蛋白溶酶原途径；Royston等人，1990，Blood Coagul. Fibrinol. 1 53 ；Orchard 等人，1993，Br. J. Haematol. 85 596)已经成为非常感兴 趣的领域。凝固过程由各种血液成分或因子的复杂相互作用所介导，最终形成纤维蛋白凝 块。一般地，参与被称作凝固“级联”的血液成分是原酶(proenzyme)或酶原(zymogen)，其 为酶学上无活性的蛋白，通过激活剂的作用被转化为蛋白水解酶，所述激活剂本身是激活 的凝固因子。经过这样的转化的凝固因子一般被称作“活性因子”，通过添加小写的“a”后 缀加以指明(例如，因子Vila)。凝固级联中的关键步骤之一是凝血酶原被凝血酶原酶复合物(FXa联合FVa)转 化为凝血酶，参见 Suttie, J. W 和 Jackson, C. Μ, 1977, Physiol Rev, 57 :1_70。存在两个促 进因子X(FX)激活的系统或途径。“内在途径”是指那些通过利用只存在于血浆中的因子 而引起凝血酶形成的反应。一系列的蛋白酶介导的激活最终产生因子IXa(FIXa)，其与因 子VlIla(FVIIla)联合在存在Ca2+和磷脂的情况下将FX切割为FXa。在血液凝固的“外部 途径”中，因子Vlla(FVIIa)及其辅因子、组织因子实施相同的蛋白水解。组织因子是与膜 结合的蛋白，通常不在血浆中循环。但是，在血管被破坏之后，它可以与FVIIa形成复合物 以催化存在Ca2+和磷脂的情况下FX的激活或因子IX(FIX)的激活(Nemerson和Gentry， 1986，Biochem. 25 =4020-4033)。虽然两种凝固途径在止血中的相对重要性是不明确的，但 是近年来发现FVII和组织因子在调节血液凝固中发挥重要作用。因子VII是痕量血浆糖蛋白，其在血液中作为单链酶原循环。酶原是催化上无活 性的(Williams 等人，J. Biol. Chem. 264 :7536_7543 (1989) ；Rao 等人，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 :6687_6691)。单链 FVII 可以在体外被 FXa、FXIIa、FIXa 或凝血酶转化 为双链的FVIIa。相信FXa是FVII的主要生理激活剂。与其它几个参与止血的血浆蛋白类 似，FVII的活性依赖于维生素K，其活性对于蛋白的氨基端成簇的多个谷氨酸残基的γ-羧 基化是必需的。这些Y-羧基化的谷氨酸对于金属相关的FVII与磷脂的相互作用是必需 的。因子V(FV)是作为单链分子合成的大的糖蛋白，在哺乳动物血液中作为丝氨酸蛋 白酶激活的FX的无活性辅因子而循环。当损伤或外伤过程中需要它时，FV被凝血酶或FXa 通过蛋白水解激活。在激活过程中，B结构域被释放并产生激活的FVa。FVa具有两条链，
10一条重链(含有A1-A2结构域)和一条轻链(含有A3-C1-C2结构域)，这两条链通过Ca2+ 依赖性非共价相互作用被连接在一起。激活的蛋白C(APC)通过蛋白水解将人类FVa灭活，这提供了维持止血平衡的有效 调控机制。APC (其为维生素K依赖性的丝氨酸蛋白酶)在氨基酸位置334、534和679切割 人类FVa，将人类FVa转化为无活性的FV，因此使凝血酶原酶复合物变得不稳定并且降低凝 血酶的产生速率。为了使凝血酶原的激活以生理相关的速率进行，FXa必须在Ca2+离子存在的情况 下在磷脂膜上与FVa组装以形成凝血酶原酶复合物(Suttie和Jackson，1977，Physiol. Rev. 57 1)。与单独使用FXa进行催化相比，该复合物的形成能够将凝血酶原的激活增强 IO5 倍。澳洲棕蛇(pseudonaja textilis及相关种)和两种太攀蛇(Oxyuranus scutellus (海岸太攀蛇)和Oxyuranus microlepidotus (内陆太攀蛇))在生产它们的蛇 毒上是独一无二的，所述蛇毒是强促凝血剂毒素，由FXa样蛋白酶联合FVa样因子构成，类 似于人类凝血酶原酶复合物(Masci等人，1988，Biochem Int，17 :825_835)。澳洲棕蛇的 FVa样蛋白酶在334和534位点缺少APC切割，因此在与人类FVa相同的速率时不被转化为 它的无活性形式，因为它只有一个切割位点。美国专利号7，125，846公开了通过联合给予人类FV多肽和人类FVII多肽(同时 或依次)而治疗出血事件和凝固紊乱的方法。公开了这种给药相对于单独给予FVIIa或FV 时的凝固时间、凝块的结实程度和抗性提供了缩短的凝块时间、更坚固的凝块并增加了对 纤维蛋白溶解的抗性。本发明部分基于以下发现进行预测蛇毒FVa蛋白(例如澳洲棕蛇的FVa蛋白) 单独与人类FXa形成复合物以有效使血液凝固。该发现是高度有利的，因为蛇毒FVa蛋白 只在FXa存在的情况下形成凝血酶原酶复合物(并且使血液凝固)，FXa在人类中被限制 在损伤位点，这允许向个体注射蛇毒FVa蛋白而不在不想要的位点引起血液凝固。蛇毒FV 多肽的示例性例子包括以下优点(1)从凝血酶原产生最大量的凝血酶所需的蛇毒FV蛋白 的量在nM浓度范围内；(2)来自蛇毒的FV仅需要FXa以使血液凝固，而FVIIa需要组织因 子、Ca2+和磷脂；(3)蛇毒FV蛋白非常稳定，不容易被APC降解，因为蛇毒FV氨基酸序列的 APC切割位点比人类FV序列少；(4)可以通过加入蛇毒FV使限速的凝血酶原酶的浓度达到 比加入FVIIa可以达到的浓度高得多的浓度，因为内源性FV是有限的；和(5)不需要蛇毒 FXa的活性。不希望被任一个理论或操作模式所限，推测由于哺乳动物血液中FVa的浓度通 常非常低并且形成FVa的FV的浓度也非常低，所以给予蛇毒FVa将增加总的FVa浓度并因 此增加凝血酶原酶复合物的浓度。这继而将显著增加在损伤位点有需要之时形成凝块的速 率。

发明内容
因此，在一个方面，本发明提供了治疗或预防个体中出血事件或凝固紊乱的方法。 这些方法一般包括向个体给予抑制出血的有效量的蛇毒FV多肽。在一些具体实施方式
中， 蛇毒FV多肽包含(a)与SEQ ID NO :2，4，6，8，10或12任一项所示的序列具有至少50% (以及至少51%至至少99%和其中所有的整数百分数)序列相似性或序列同一性的氨基酸序列；或(b)与SEQ ID NO :1，3，5，7，9或11任一项所示的序列具有至少50% (以及至少 51%至至少99%和其中所有的整数百分数)序列相似性或序列同一性的核苷酸序列或其 互补物所编码的氨基酸序列；或(c)与SEQ ID N0:l，3，5，7，9或11任一项所示的序列在至 少低度、中度或高度严谨条件下杂交的核苷酸序列或其互补物所编码的氨基酸序列，其中， (a)、(b)或(c)的氨基酸序列具有选自下列的一个或多个活性抑制出血的活性、减少凝固 时间的活性；增强止血的活性；延长凝块溶解时间的活性或增强凝块强度的活性。适宜地， 以包含药学上可接受载体的组合物的形式给予蛇毒FV多肽。在相关的方面，本发明提供了包含或实质上由如本文广泛定义的蛇毒FV多肽和 药学上可接受载体组成的药物组合物。适宜地，组合物配制为全身或局部给药(例如局部 或静脉内给药)。在一些具体实施方式
中，组合物不包括FVII和/或FVIIa。在一些具体 实施方式中，组合物不包括蛇毒FXa。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽包含轻链和重链结构域，例如在图7中所示。 适宜地，激活肽被置于轻链和重链结构域之间，例如在图7中所示。但是，在特别的具体实 施方式中，蛇毒FV多肽中不存在激活肽。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽包括一个或多个(a)位于重链区域内的多 铜氧化酶结构域；(b)位于轻链区域内的多铜氧化酶结构域；和(c)通常位于轻链区域内的 C-末端膜结合结构域。在这种类型的示例性例子中，蛇毒FV多肽包括(i)至少一个(例 如2个)位于重链区域内的多铜氧化酶结构域；(ii)位于轻链区域内的多铜氧化酶结构 域；和(c)至少一个(例如2个)位于轻链区域内的膜结合结构域。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽包括一个或多个⑴铜氧化还原蛋 白(cupredoxin)结构域，例如在 European Bioinformatics Institute (EBI)数据库 InterPro标志IPR008972和超家族条目SSF49503中所定义；(2)多铜氧化酶1型(铜结 合位点)结构域(本文中也称作多铜_氧化酶1结构域)，例如在EBI InterPro数据库中 在InterPro标志IPR002355和Prosite条目PS00079中所定义；(3)多铜氧化酶2型结构 域(本文中也称作铜氧化酶_2结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR011706 和Pfam条目PF07731中所定义；(4)凝固因子5/8型C结构域(本文中也称作FA58C结构 域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421和SMART登录号SM00231中所定义； (5)凝固因子5/8C-末端结构域(本文中也称作FA58C_3结构域)，例如在EBI数据库中在 InterPro标志IPR000421和Prosite条目PS50022中所定义；(6)凝固因子5/8型C结构 域(本文中也称作F5_F8_型_C结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421 和Pfam条目PF00754中所定义；(7)半乳糖结合样结构域(本文中也称作Gal_结合_样 结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR008979和超家族条目SSF49785中所定 义；(8)凝固因子5/8型C标志1结构域(本文中也称作FA58C_1结构域)，例如在EBI数据 库中在InterPro标志IPR000421和Prosite条目PS01285中所定义；(9)凝固因子5/8型 C标志2结构域(本文中也称作FA58C_2结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志 IPR000421和Prosite条目PS01286中所定义；和(10)凝固因子V结构域(本文中也称作因 子—V结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR0014693和Protein Information Resource条目PIRSF5000150中所定义；或其生物活性片段。在这种类型的示例性例子中， 蛇毒FV多肽包含(1)至少一个铜氧化还原蛋白结构域(例如1、2、3、4、5或6个结构域)；⑵至少一个多铜_氧化酶1结构域(例如1、2或3个结构域)；(3)铜氧化酶—2结构域； (4)至少一个FA58C结构域(例如1或2个结构域)；(5)至少一个FA58C_3结构域(例如 1或2个结构域)；(6)至少一个F5_F8_型_C结构域(例如1或2个结构域)；(7)至少 一个Gal_结合_样结构域(例如1或2个结构域)；(8)至少一个FA58C_1结构域(例如 1或2个结构域)；(9)至少一个FA58C_2结构域(例如1或2个结构域)；和(10)因子_ V结构域。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽包括信号肽结构域。在其它具体实施方式
中，其缺少信号肽结构域。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽包括一个或多个(a) Al结构域；(b)A2结构 域；(c) B结构域，也替换地称作激活结构域；(d) A3结构域；(e) Cl结构域；和(f)C2结构域， 其中A1、A2和A3结构域是多铜氧化酶结构域的不同版本(diverged version)，例如在EBI 数据库中在InterPro标志IPR001117中所定义；B结构域在激活过程中被除去；Cl和C2是 促进膜结合结构域，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421中所定义。在这种类 型的示例性例子中，蛇毒FV多肽包含Al、A2和A3结构域以及Cl和C2结构域。代表性的结构域与天然产生的物种的结构域的长度是相同或非常相似的(具有 例如1，2，3，4，5乃至10个残基的差异)。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽包含一个或 多个(在一些情况下包含所有的)以下的结构域(编号是指图7中的共有编号)一与例如图7所示的任意蛇毒FV多肽(本文中也称作“蛇毒FV”)的残基31-772 所定义的重链结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98%序列相似性或 序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基773-817所定义的激活结构域(也替换 地称作B结构域)具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98%序列相似性或序 列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基818-1461所定义的轻链结构域具有至少 70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98 %序列相似性或序列同一性或与之具有不超过 1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；——与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基31-208，209-337，351-530，500-682， 823-997和963-1153所定义的任意一个铜氧化还原结构域具有至少70，80，85，90，91，92， 93，94，95，96，97或98 %序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1,2,3,5乃至10，15 或20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基307-327,662-681和1120-1138所定义 的任意一个多铜_氧化酶1结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98% 序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差 异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基581-687所定义的铜_氧化酶_2结构域 具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98%序列相似性或序列同一性或与之具 有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1147-1298和1303-1457所定义的任意 一个Gal_结合_样结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98%序列相似 性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1146-1296和1302-1455所定义的任意 一个FA58C结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98%序列相似性或序 列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1147-1296和1303-1455所定义的任意 一个FA58C_3结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98%序列相似性或 序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1141-1455所定义的FA58C_2结构域具 有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98%序列相似性或序列同一性或与之具有 不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；——与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1187-1215和1347-1374所定义的任 意一个FA58C_1结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98%序列相似性 或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域； 和——与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1162-1293和1318-1452所定义的任 意一个 F5_F8_ 型 _C 结构域具有至少 70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97 或 98%序列相 似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结 构域。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽包含一个或多个(在一些情况下包含所有 的)以下的结构域(编号是指图7中的共有编号)一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基31-348所定义的Al结构域具有至少70， 80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98 %序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1， 2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基349-691所定义的A2结构域具有至少 70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98%序列相似性或序列同一性或与之具有不超过 1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基772-817所定义的B结构域具有至少70， 80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98 %序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1， 2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基819-1148所定义的A3结构域具有至少 70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98%序列相似性或序列同一性或与之具有不超过 1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1149-1299所定义的Cl结构域具有至少 70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98 %序列相似性或序列同一性或与之具有不超过 1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1300-1461所定义的C2结构域具有至少 70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98 %序列相似性或序列同一性或与之具有不超过 1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域。在一些具体实施方式
中，激活或B结构域不存在。
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在特别的具体实施方式
中，重链包含以下序列AQLREYx1X2AAQLEDffDYNpQpEELsRLsEsx3LTFKKIVYREYELDFKQEX4X5RDX6LsGLLGPTLRG EV ⑶ X7LIIYFKNFATQPVSIHPQSAVYNKWSEGSSYSDGTSDVERLDDAVPPGQSFKYVffNITAEIGPKKADPPCL TYAYYSHV 匪 VRDFNSGLIGALLICKEGSLNAX8GX9QKFFNREYVLX1(iFSVFDESKNWYRKPSLQYTINGFANGTLP DVQACAYDHISffHLIGMSSSPEIFSVHFNGQTLEQNHYKVSTIXnX12VGGASVTAX13MSVSRTGKffLISSLVAKHL
qagmygylnikdcgx14px15tltrklsfrex16x17x18ix19x20weyfiaaeeitwdyx21peipssvdrrykaqyldnfs nfigkkykkavfrqyedx22nftkptyaiwpkergilgpvikakvrdtvtivfknlasrpysiyvhgvsvskdaegax 23ypsdpkenithgkavepgqvytykwtvldtdeptvkdsecitklyhsavdmtrdiasgligpllx24ckx25kalsx2 6x27gvqnkadveqhavfavfdenkswylednikkycsnpsx28vkkddpkfyksnvmytlngyasdrtevx29x30fhqs
EVVX31ffHLTSVGTVDEIVPVHLSGHTFLSKGKHQDILNLFPMSGESATVTMDNLGTWLLSSffGSCEMSNGMRLRFLD
anyddedegneeeeeddgdifadifx32px33evvx34kkeevpvnfvpdpesdalakelglx35ddex36npx37x38qx39r x40eqteddeeqlmx41asx42lglr[seq ID NO: 15]，其中X1选自碱性氨基酸残基(例如，Arg或His，或其修饰的形式)；&选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Ile或Leu， 或其修饰的形式)；X3选自酸性氨基酸残基(例如Glu或Asp，或其修饰的形式)；X4选自带电的氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，或 酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式)；X5选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例 如Leu，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Pro，或其修饰的形式)；X6选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或小 的氨基酸残基，例如Ala，或其修饰的形式)；X7选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例 如lie，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Ser，或其修饰的形式)；X8选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式， 或酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式)；X9选自小的氨基酸残基(例如Ser或Ala，或其修饰的形式)； Xltl选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Met或Val， 或其修饰的形式)；X11选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式，或中 性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)；X12选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Pro，或其修饰的形式，或疏 水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Leu，或其修饰的形式)；X13选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形 式，或酸性氨基酸残基例如Asp，或其修饰的形式)；X14选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如His，或其修饰的形式，或中 性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)；X15选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形
15式，或酸性氨基酸残基例如Asp，或其修饰的形式)；X16选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Leu，或其修 饰的形式，或具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Trp，或其修饰的形式)；X17选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例 如Met，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Arg，或其修饰的形式)；X18选自碱性氨基酸残基(例如Arg或Lys，或其修饰的形式)；X19选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例 如Met，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Lys，或其修饰的形式)；X20选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形 式，或碱性氨基酸残基例如Lys，或其修饰的形式)；X21选自小的氨基酸残基(例如Pro或Ala，或其修饰的形式)；X22选自小的氨基酸残基(例如Gly或Ser，或其修饰的形式)；&3选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Ile或Val， 或其修饰的形式)；X24选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基， 或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Ala，或其修饰的形式)；X25选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基， 例如Leu，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Arg或His，或其修饰的形式)；&6选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Ile或Val， 或其修饰的形式)；X27选自碱性氨基酸残基(例如Arg或Lys，或其修饰的形式)；X28选自小的氨基酸残基(例如Ser或Ala，或其修饰的形式)；X29选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Leu，或其修 饰的形式，或具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Trp，或其修饰的形式)；X3tl选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式，或碱 性氨基酸残基例如Arg，或其修饰的形式)；X31选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Gln，或其修饰的形 式，或酸性氨基酸残基例如Glu，或其修饰的形式)；X32选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Ser或其修饰的形式，或中 性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧 链的残基，例如lie，或其修饰的形式)；X33选自小的氨基酸残基(例如Pro或Ser,或其修饰的形式)；X34选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，或疏 水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如He，或其修饰的形式)；X35选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Leu或lie， 或其修饰的形式，或具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Phe，或其修饰的形式)；X36选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式，或小 的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；X37不存在或选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的残基，例如lie，或其修饰的形式)；X38选自任意氨基酸残基(例如带电的氨基酸残基，包括碱性氨基酸残基，例如 Lys,或其修饰的形式，和酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残 基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如He，或其修饰的形式)；X39选自小的氨基酸残基(例如Ser或Pro，或其修饰的形式)；X4tl选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Ser，或其修饰的形式，或碱 性氨基酸残基，例如arg，或其修饰的形式)；x41选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基， 例如he，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如lys，或其修饰的形式)；和X42选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Val，或其修 饰的形式，或具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式)。激活肽的代表性具体实施方式
包含以下序列sfkgsvaeeelkhtalaleedahasdpridsnsax43nx44ddiagryl[seqid no 16],其中X43选自碱性氨基酸残基(例如Arg或His，或其修饰的形式)；和X44选自小的氨基酸残基(例如Ser或Pro，或其修饰的形式)。在一些具体实施方式
中，轻链包含以下序列RTI X45RX46NKRRYYIAAEEVLffDYSP IX47KSQVRSX48X49AKTTFKKAIFRSYLDDTFQTP STGGEYEK
hlgilgpiiraevddvx50ex51qfx52nlasrpyslhahgllyekssegrsyddx53spelfkkddaimpngtytyvwq
vpprsgptdntekckswayysgvnpekdihsgligpilicqkgmidkynrtidirefvlffmvfdeekswyfpksdk
stceekligvqx54sx55htfpaingipyqlqglx56mykdenvhwhllnmggpkdx57hvvnfhgqtfteegrednqlg vlpllpgtfasikmkpskigtwlletevgenqergx58qalftvidkx59cklpmglasgiiqdsqisasghvx60ywe
PKLARLNNTGX61X62NAffS IIKKEHEHPWIQIDLQRQVVITGIQTQGTVX63LLX64HSYTVE YFVTYSX65DGQNffITF
kgrhsx66tqmhfegnsdgttvkenhidppiiaryirlhptkfynx67ptfriellgcevegcsvplgmesgaikx68s
ElTAssYKKTffffssffEPX69LARLNLX70GX71TNAffQPX72 vnnkdqfflqldlqhltkltsiitqgatsmttx73myvkt fsihytddnstwx74pyldvrtsmekvftgninx75dghvkhffx76ppilsrfirii pktffnqyialrielfgcevf [ seq id no :17],其中x45选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有芳香族侧链的残基， 例如tyr，或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如asn，或其修饰的形式)；X46选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式，或小 的氨基酸残基，例如gly，或其修饰的形式)；X47选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式，或小 的氨基酸残基，例如gly，或其修饰的形式)；x48选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基， 例如leu，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如arg，或其修饰的形式)；X49选自小的氨基酸残基(例如Pro或Ala，或其修饰的形式)；x5tl选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基或其修饰的形式，例如lie，或其 修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式)；
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X51选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Val或lie， 或其修饰的形式)；X52选自碱性氨基酸残基(例如，Arg或Lys，或其修饰的形式)；X53选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形 式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；X54不存在或选自小的氨基酸残基(例如Ser或其修饰的形式)；X55选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Arg或His，或其修饰的形 式，或疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Leu，或其修饰的形式)；X56选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式，或疏 水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式)；X57选自任意氨基酸残基(包括疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基， 例如lie，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式)；X58选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例 如Met，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式)；X59选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式，或小 的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；X6tl选自选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式， 或小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；X61选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例 如Met，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；X62选自疏水性氨基酸残基(例如具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Phe或Tyr， 或其修饰的形式)；X63选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如His，或其修饰的形式，或中 性/极性氨基酸残基，例如Gln，或其修饰的形式)；X64选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)，或 中性/极性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式)；X65选自带电的氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，或 酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式)；X66选自带电的氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或 碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；X67选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式，或碱 性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式)；X68选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形 式，或酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式)；X69选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有芳香族侧链的残基， 例如Phe，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Ser，或其修饰的形式)；X7tl选自带电的氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或 碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；X71选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式，或碱
18性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式)；X72选自带电的氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或 碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；X73选自小的氨基酸残基(例如Ala或Ser，或其修饰的形式)；X74选自选自碱性氨基酸残基(例如Lys或Arg，或其修饰的形式)；X75选自小的氨基酸残基(例如Ser或Gly，或其修饰的形式)；X76选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，或中 性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽包含信号肽，其适宜地包括序列 MGRYSVSPVPKCLLLMFLGWSGLKYYQ(SEQ ID NO: 18)。蛇毒FV多肽适宜地包括这样的多肽序列其包含与SEQ ID NO :15，16和17任一 项所示的序列具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98%序列相似性或序列同 一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基差异的氨基酸序列。代表性的蛇毒FV多肽包含与SEQ ID NO 2和4(棕蛇)、SEQ ID NO :6和8(内陆 太攀蛇)和SEQ ID NO: 10和12 (海岸太攀蛇)任一项所示的序列具有至少70，80，85，90， 91，92，93，94，95，96，97或98 %序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至 10，15或20个氨基酸残基差异的序列。适宜地，蛇毒FV多肽缺少信号肽结构域和激活肽 (或B)结构域中的至少一个。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽包含以下的任意一个或多个FXa结合位点、 凝血酶原结合位点和凝血酶切割位点。在这种类型的示例性例子中，蛇毒FV多肽包含至少 一个Fxa结合位点(例如，1个或2个)，凝血酶原结合位点和凝血酶切割位点。代表性的 蛇毒FV多肽包含以下任意一个或多个(1)在大约残基338-379的FXa结合位点；(2)在大约残基524-537的FXa结合位点；(3)在大约残基703-707的凝血酶原结合位点；和(4)在大约残基772-773的凝血酶切割位点；其中，编号是指图7中的共有编号。适宜地，蛇毒FV多肽在相对于图7的共有编号的残基818-819和/或残基537-538 上包含APC位点。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽的激活的蛋白C(APC)位点比野生 型哺乳动物(例如人)的FV少一个或多个(例如1，2，3，4或5)。在一些具体实施方式
中，以包含药学上可接受载体或稀释剂的组合物的形式给予 蛇毒FV多肽。组合物可以通过注射(全身)给药或通过局部应用以阻止或减少个体中从 出血位点或个体体内的血液流失。组合物可用于治疗由于医学或手术干预、有害的外伤或其它形式的组织损害而经 历出血事件的个体，其示例性的例子包括凝血病，包括多次输血个体中的凝血病；先天性 或获得性凝血或出血紊乱，包括肝功能降低(“肝脏疾病”)；血小板功能缺陷或血小板数量 减少；必需的凝固“化合物”(例如血小板或vonWillebrand因子蛋白)缺少或异常；纤维 蛋白溶解增加；抗凝血剂治疗或溶栓治疗；给予降低个体形成或维持血液凝块的能力的药 物；和干细胞移植。
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在一些具体实施方式
中，出血发生于器官，例如，如大脑、内耳区域、眼睛、肝脏、 肺、肿瘤组织、胃肠道；在其它非限制性例子中，出血是弥散性的，例如，如出血性胃炎和子 宫大出血。在其它具体实施方式
中，出血事件是与个体中的手术或外伤相连的出血，所述个 体具有维持或形成血液凝块能力的缺陷，例如由于急性关节血肿(关节出血)、慢性血友 病性关节炎、血肿(例如肌肉、腹膜后、舌下和咽后)、其它组织中的出血、血尿症(肾道出 血)、大脑出血、手术(例如肝切除术)、拔牙和胃肠道出血(例如UGI出血)。此外，组合物 可用于治疗个体中由于例如外伤或手术或血小板数目或活性低下而发生的出血事件。在另一个方面，本发明涉及以上广泛定义的蛇毒FV多肽在制备用于防止或减少 个体中的血液流失或出血的药物或试剂盒中的用途。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽 配制成局部给药。试剂盒可以包括例如一个或多个组合物形式的FV多肽和药学上可接受 的载体；一个或多个用于制备蛇毒FV多肽以向个体给药的容器；一个或多个其它试剂和/ 或其它治疗剂；用于向患者给予蛇毒FV多肽的设备或其它材料；和给予试剂盒以治疗个体 中的血液流失的说明书。在一些具体实施方式
中，试剂盒不包括FVII和FVIIa。在一些具 体实施方式中，试剂盒不包括蛇毒FXa。适宜地，试剂盒用于减少获得完全止血所需的时间；减少维持止血所需的时间； 减少凝固时间；延长凝块溶解的时间；和增加出血位点凝块的强度。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽配制成用获得以下一项或多项的有效量来 给予(1)抑制出血(即抑制出血的有效量)；(2)减少凝固时间(即减少凝固时间的有效 量)；(3)增强止血(即，增强止血的有效量)；(4)延长凝块溶解时间(即，延长凝块溶解时 间的有效量)；和(5)增强凝块强度(即增强凝块强度的有效量)。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽配制为由个体之外的人员给药。或者，蛇毒 FV多肽配制为自己给药。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽配制为在个体需要使用之前向个体提供。


图1是在存在磷脂和澳洲棕蛇(P. textilis)蛇毒FV的情况下，重新钙化柠檬酸 化的血浆的凝固时间的代表图示。图2是在存在添加的钙的情况下，柠檬酸化的全血的凝固时间与浓度升高 (0. 4-550nM)的澳洲棕蛇蛇毒FV的代表图示。对照对应于595秒的凝固时间(0时间钙化 之后)。图3的代表图示显示了两个小组(每组5只小鼠)的血液流失的时间过程。一个 小组按照在第W256]段中描述的“小鼠尾部切除出血模型”以盐水在切下的尾巴上进行局 部处理。第二个小组按照相同的方式处理，不同的是使用盐水中的FVa溶液。在10分钟的 时间间隔内测定每只动物的血液流失，也测定处理溶液中的血液流失。图4是使用来自图3的数据的代表图示，其显示了 (a)每个测试组内的合计血液 流失，每组共5只动物(见上端的图)；和(b)每个测试组中每20g小鼠的合计平均血液流 失，每组共5只动物(见下端的图)。图5是静脉内注射100 μ 1盐水中的500nmol/L FVa( ■ ) ；100 μ 1盐水(对照)
20(·)；和100 μ 1盐水中的抑肽酶(ΙΙΟμπιοΙ/1) ( ▲)之后进行的小鼠尾部切除实验的代
表图示。每组η = 10。图6是(a)考马斯染色的凝胶(凝胶1)和(b) Western印迹(凝胶2)的代表性 图像，其证明用抗-蛋白酶重链抗体(针对含有澳洲棕蛇FXa样蛋白酶重链的重组GST融 合蛋白的绵羊抗血清)似乎去除了亲和纯化的FV制备物的因子Xa。凝胶(a)和(b)的泳 道1包含澳洲棕蛇蛇毒FV蛋白；泳道2包含澳洲棕蛇FXa样蛋白酶；泳道3包含FV (Dardak 和Xa亲和去除之后)。图7例示了分离的蛇毒FV之间的序列比对。显示了源自以下蛇的蛇毒FV的氨基 酸序歹丨J 澳洲棕蛇(棕蛇)(SEQ ID NO 2)、0. microlepidotus (内陆太攀蛇)(SEQ ID NO 6 和 8)和 0. scutellatus (海岸太攀蛇)(SEQ ID NO: 10 和 12)。表 A序列简要描述
序列编号序列长度SEQIDNO1对应于来自澳洲棕蛇毒腺的FV样基因4383nt(AY168281)的编码和非编码区的核苷酸序列SEQIDNO2SEQ ID NO 1的编码区编码的FV样多肽1460aaSEQIDNO3对应于来自澳洲棕蛇肝脏的FV样基因4737nt(AY576416)的编码和非编码区的核苷酸序列SEQIDNO4SEQ ID NO 3的编码区编码的FV样多肽1459aaSEQIDNO5对应于来自内陆太攀蛇毒腺的FV样基因4383nt(AY940210)的编码和非编码区的核苷酸序列SEQIDNO6SEQ ID NO 5的编码区编码的FV样多肽1460aaSEQIDNO7对应于来自内陆太攀蛇毒腺的FV样基因的编码和4380nt非编码区的核苷酸序列SEQIDNO8SEQ ID NO 7的编码区编码的FV样多肽1459aaSEQIDNO9对应于来自海岸太攀蛇毒腺的FV样基因4380nt(AY940209)的编码和非编码区的核苷酸序列SEQIDNO10SEQ ID NO 9的编码区编码的FV样多肽1459aaSEQIDNO11对应于来自海岸太攀蛇毒腺的FV样基因的编码和4675nt非编码区的核苷酸序列SEQIDNO12SEQ ID NO 11的编码区编码的FV样多肽1458aaSEQIDNO13对应于人类FV基因的编码区和非编码区的核苷酸9179nt序列SEQIDNO14SEQ ID NO 13的编码区编码的人类FV多肽2224aaSEQIDNO15蛇毒FV重链742aaSEQIDNO16蛇毒FV激活肽45aaSEQIDNO17蛇毒FV轻链644aaSEQIDNO18蛇毒FV信号肽27aa
2具体实施例方式1.定义除非另有指明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技 术人员通常理解的相同含义。虽然与本文描述的相似或等同的任何方法和材料均可用于实 施或测试本发明，但是描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，以下定义了下述术语。本文使用的冠词“a”和“an”是指一个或多个(即，至少一个)该冠词的语法客体。 举例来讲，"an元件”意思是一个元件或多个元件。“大约”意思是数量、水平、数值、数字、频率、百分率、尺寸、大小、量、重量或长度比 参考数量、水平、数值、数字、频率、百分率、尺寸、大小、量、重量或长度改变30，25，20，25， 10，9，8，7，6，5，4，3，2 或用于参考或全长多核苷酸或多肽序列的片段的术语“生物活性片段”是指具有参 考序列的至少大约 0. 1,0. 5，1,2,5,10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，35，40，45，50， 55，60，65，70，75，80，85，90，95，96，97，98，99%的活性的片段。本发明范围内包括长度为 至少大约 18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，40，50，60，70，80，90，100，120，140， 160，180，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500,2000 个核苷酸或残基的生 物活性片段，其包含或编码参考多核苷酸或多肽的活性。代表性的生物活性片段一般参与 相互作用，例如分子内或分子间相互作用。分子间相互作用可以是特异性结合相互作用或 酶的相互作用。分子间相互作用可以是蛇毒FV分子和FXa分子间的。蛇毒FV蛋白的生物 活性部分包括包含与SEQ ID NO =2,4,6,8,10和12的蛇毒FV的氨基酸序列具有足够相似 性或同一性或源于其中的氨基酸序列的肽。本文使用的术语“出血紊乱”是指在出血事件中表现的任何先天性的、获得性的或 诱导的，细胞或分子来源的缺陷。出血紊乱的例子包括但不限于，凝固因子缺陷、凝固因子 抑制剂、血小板功能缺陷、血小板减少症、血管性假性血友病(von Willebrand disease)和 例如由于出血和/或输血引起的凝固蛋白稀释、纤维蛋白溶解增加和血小板数目减少引起 的凝血病。本文使用的术语“出血事件”是指与手术、外伤和其它形式的组织损害相联的有害 的、非控制的和经常性的过量出血，以及具有如上定义的出血紊乱的个体中的有害的出血。本文使用的术语“凝块溶解时间”、“凝块强度，，和“凝固时间，，是指用于检测个体 的止血系统状态的临床参数。可以在适宜的间隔从个体获取血液样品并通过一些方式例如 Meh 等人，(2001，Blood Coagulation and Fibrinolysis, 12 627-637) ；Vig 等人，(2001， Hematology,6(3) :205_213) ；Vig 等人’ (2001, Blood Coagulation andFibrinolysis, 12(7) :555_561) ；Glidden 等人，(2000, Clinical and App 1 iedThrombosis/Hemostasis, 6(4) 226-233 ；McKenzie 等人，(1999，Cardiology, 92 (4) :240_247)和 Davies 等人， (1995, Journal of the American Society of Nephrology, 6 (4) :1250_1255)描述的凝血 弹性描记法检测一个或多个参数。可以按照例如Carr等人，(1991，Am J Med，302 13-8) 的描述检测凝块强度。本文使用的术语“凝固紊乱”是指破坏身体控制血液凝固能力的紊乱。最经常为 人所知的凝固紊乱是血友病，在该病症中患者持续出血很长一段时间直至凝固。还有其它
22的多种原因引起的凝固紊乱，其非限制性例子包括血友病B、血友病C、消耗性凝血病、血 小板减少症、血管性假性血友病(Von Willebrand disease)和低凝血酶原血症。“编码序列”是指对基因的多肽产物的编码做出贡献的任何核酸序列。相反，术语 “非编码序列”是指不对基因的多肽产物的编码做出贡献的任何核酸序列。贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括 (comprises) ” “包括(comprising) ”将被理解为暗示包括所述的步骤或元素或步骤或 元素的组，但不排除任何其它的步骤或元素或步骤或元素的组。因此，使用术语“包括 (comprising)”等是指所列的元素是需要的或强制性的，但是其它元素是可选的并且可以 存在或不存在。“由……组成”意思是包括并且局限于词组“由……组成”之后跟随的任意 词。因此，词组“由……组成”是指所列的元素是需要的或强制性的并且不存在其它任何元 素。“基本上由……组成”意思是包括该词组后所列的任何元素，并且局限于不干扰本公开 中的所列元素的活性或作用或对其无贡献的其它元素，因此，词组“基本上由……组成”是 指所列的元素是需要的或强制性的，但是所述其它元素是可选的并且可以存在或不存在， 这取决于它们是否影响所列元素的活性或作用。术语“互补的”和“互补性”是指碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸的序 列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”是互补的。互补性可以是“部分的”，其中只有一 些核酸碱基是根据碱基配对规则匹配的。或者，在核酸之间可以有“完全”或“全部”互补 性。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著影响。“对应于(corresponds to)，，或“对应于(corresponding to)，，意思是(a)具有 与参考多核苷酸序列的全部或部分实质上相同或互补的核苷酸序列，或编码与肽或蛋白中 的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多核苷酸；或(b)具有与参考肽或蛋白中的氨基酸序列 实质上相同的氨基酸序列的肽或多肽。在治疗或预防病症的上下文中“有效量”是指向有此治疗或预防需要的个体给予 的(单一剂量或作为系列的部分)有效治疗或预防该病症的活性剂的量。有效量将根据待 治疗的个体的健康或身体条件、待治疗个体的分类组、组合物的配制、医疗状况的评价和其 它相关因子而变化。预期该量将落在相对宽的范围内，可以通过常规试验加以确定。本文使用的术语“功能”和“功能性的”等是指生物学、酶学或治疗上的功能。本文使用的术语“FV多肽”包括但不限于蛇毒FV多肽，并且预期包括但不限于，具 有与SEQ ID而2，4，6，8，10或12任一项所示的序列以及源自其它物种(例如，如，牛、猪、 狗、小鼠、大鼠和鲑鱼)的野生型(天然产生的)FV具有至少50% (以及至少51%至至少 99%和其中所有的整数百分数)序列同一性的氨基酸序列的多肽。它还包括可能存在于或 产生于个体与个体之间的FV的天然等位基因变种。同样，糖基化和其它翻译后修饰的程度 和位置可以根据所选的宿主和宿主细胞环境的性质而改变。术语“FV”还预期包括酶原形 式的FV多肽，以及那些经过处理以产生其各自生物活性形式的多肽。它还包括这样的FV 多肽经过相对于参考或天然产生的蛇毒FV的化学修饰，和/或相对于参考或天然产生的 蛇毒FV的氨基酸序列含有一个或多个改变，和/或相对于参考或天然产生的全长或前体蛇 毒FV含有截短的氨基酸序列。因此，例如，蛇毒FV多肽包括天然产生的或参考全长或前体 蛇毒FV的经处理的形式，包括但不限于，FVa多肽。可替代的，或除此之外，蛇毒FV多肽可 以显示出相对于参考或天然产生的蛇毒FV不同的性质，包括稳定性、磷脂结合性、改变的特异性活性等。术语“FV多肽”还包括具有稍微修饰的氨基酸序列的多肽，例如，具有修饰 的N-末端(包括N-末端氨基酸删除或添加)的多肽，和/或经过相对于参考或天然产生 的蛇毒FV的化学修饰的多肽。FV多肽还包括这样的多肽显示出与参考或天然产生的FV 实质上相同或更优的生物活性，或者可替代地，相对于参考或天然产生的FV显示出实质上 改变的或降低的生物活性。它们还包括但不限于这样的多肽通过插入、删除或取代一个或 多个氨基酸而具有不同于参考或天然产生的FV的序列的氨基酸序列，示例性的例子包括 显示出至少大约 10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，110%，120% 和130%的参考或天然产生的FV(在相同的细胞中产生的)的特异性活性的多肽。具有与 参考或天然产生的FV实质上相同或改进的生物活性的FV多肽包括显示出至少大约25%， 50 %，75 %，100 %，110 %，120 %或130 %的参考或天然产生的FV (在相同的细胞类型中产 生的)的特异性生物活性的多肽。为了本发明的目的，FV生物活性可以通过例如测定制备 物使血浆凝固能力(如Thorelli等人，1998，Thromb Haemost, 80 :92所描述)而进行定量。 相反，相对于参考或天然产生的FV具有实质上降低的生物活性的FV多肽是那些显示出大 约25%，10%，5%或以下的参考或天然产生的FV(在相同的细胞类型中产生的)的特 异性活性的多肽。术语“基因”是指遗传单位，其在染色体上占有特定的基因座并且由转录和/或翻 译调控序列和/编码区和/或非翻译序列(即，内含子、5’和3’非翻译序列)组成。本文使用的术语“止血”是指在损伤位点形成稳定的和固体的纤维蛋白凝块或栓 塞，其有效地阻止出血并且不会被纤维蛋白水解系统容易地分解。“同源性”是指相同或组成型保守替换的核酸或氨基酸的百分比数目。可以使用序 列比对程序例如 GAP (Deveraux 等人，1984，Nucleic Acids Research 12，387-395)(通过 引用并入本文)确定同源性。按照这个方式，可以通过将空隙插入比对中而进行与本文所 列的序列相似或实质上不同长度的序列的比较，这样的空隙通过例如GAP所用的比较算法确定。术语“宿主细胞”包括这样的个体细胞或细胞培养物其可以是或已经是本发明任 意的重组载体或分离的多核苷酸的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，由于天然、偶 然或人为的突变和/或改变，该子代不一定与最初的母代细胞完全相同(形态学或总DNA 互补)。宿主细胞包括在体内或体外经过本发明的重组载体或多核苷酸转染或感染的细胞。 包含本发明的重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞。本文使用的术语“杂交”是指互补性核苷酸序列的配对以产生DNA-DNA杂交体或 DNA-RNA杂交体。互补性碱基序列是根据碱基配对规则相关的那些序列。在DNA中，A与T 配对；C与G配对。在RNA中，U与A配对；C与G配对。在这个意义上，本文使用的术语“匹 配”和“错配”是指互补性核酸链中配对的核苷酸的杂交潜力。匹配的核苷酸有效地杂交， 例如如上所述的经典的A-T和G-C碱基对。错配是其它的那些不有效杂交的核苷酸组合。“分离的”是指实质上或基本上不含在其天然状态中通常具有的成分的材料。例 如，本文使用的“分离的多核苷酸”是指从天然产生状态的其两侧序列中纯化而来的多核苷 酸，例如，从通常临近片段的序列中除掉的DNA片段。或者，本文使用的“分离的肽”或“分 离的多肽”等是指在体外从天然细胞环境或从与细胞的其它成分的结合中分离和/或纯化 的肽或多肽分子，即，其不与体内物质结合。
24
“从……获得”是指这样的样品，例如，如，从特定的个体来源分离而来或衍生而来 的多核苷酸提取物或多肽提取物。例如，提取物可以获自直接从个体分离的组织或生物液 体。本文使用的术语“寡核苷酸”是指通过磷酸二酯键连接的多个核苷酸残基(脱氧 核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关的结构变体或合成类似物)组成的聚合物(或其相关 的结构变体或合成类似物)。因此，虽然术语“寡核苷酸”通常是指其中的核苷酸残基和残基 之间的键是天然产生的核苷酸聚合物，但是应该理解，该术语范围内还包括各种类似物，包 括但不限于，肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioates)、甲基磷酸酯、 2-0-甲基核糖核酸等等。分子的精确大小可以根据特定的应用而变化。寡核苷酸通常长 短很短，一般是大约10至30个核苷酸残基，但是该术语可以指任意长度的分子，虽然术语 “多核苷酸”或“核酸”通常用于大的寡核苷酸。本文使用的术语“可操作连接”是指将结构基因置于启动子的调控控制之下，然后 启动子控制基因的转录和可选的翻译。在构建异源启动子/结构基因组合时，一般优选使 遗传序列或启动子与基因转录起始点的距离大体上等于遗传序列或启动子与天然环境中 该遗传序列或启动子控制的基因之间的距离，即该遗传序列或启动子所源自的基因。本领 域中已知该距离的一些变化可以被适应而不丧失功能。类似地，调控序列元件相对于其控 制的异源基因的优选位置由天然环境中元件的位置决定，即该元件所源自的基因。术语“患者”和“个体”相互交换地使用，是指人类或其它哺乳动物患者和个体，包 括任何需要使用本发明的方法检查或治疗的个体。但是，应该理解“患者”不意味着存在症 状。落入本发明范围的合适的哺乳动物包括但不限于，灵长类、家畜动物(例如，绵羊、牛、 马、驴、猪)、实验室测试动物(例如，兔子、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、宠物(例如，猫、狗)和 被捕获的野生动物(例如，狐狸、鹿、澳洲野狗(dingo))。“药学上可接受的载体”是指可以用于安全地向动物(优选哺乳动物，包括人类) 局部或全身给药的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质。本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术 语通常指长度为至少10个碱基的核苷酸的聚合物形式，不论是核糖核苷酸或脱氧核糖核 苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指显示出与参考多核苷酸序列实质上序列 同一性的多核苷酸，或与参考序列在下文定义的严谨条件下杂交的多核苷酸。这些术语还 包括通过添加、删除或替换至少一个核苷酸而与参考多核苷酸不同的多核苷酸。因此，术 语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸被添加或删除或被不同核苷酸 取代的多核苷酸。在这个意义上，本领域中广泛理解的是可以对参考多核苷酸进行某些改 变(包括突变、添加、删除和替换)而改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物学功能或活 性。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然产生的等位基因变体。“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中相互替换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变 体和合成类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然产生 的氨基酸(例如相应的天然产生的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物以及天然产生的 氨基酸聚合物。术语“多肽变体”是指通过添加、删除或替换至少一个氨基酸残基而与参考多肽不
25同的多肽。在一些具体实施方式
中，多肽变体相对于参考多肽具有一个或多个替换，其可以 是保守性或非保守性的。在一些具体实施方式
中，多肽变体包括保守性替换，在此意义上， 本领域广泛理解的是一些氨基酸可以改变为其它具有广泛相似性质的氨基酸而不改变多 肽活性的性质。多肽变体还包括其中一个或多个氨基酸被添加或删除或被不同氨基酸残基 替换的多肽。“引物”是指这样的寡核苷酸当与DNA的一条链配对时，在存在合适的聚合剂的 情况下，能够启动引物延伸产物的合成。引物优选是单链的以获得最大扩增效率，但也可以 是双链的。引物必须足够长以在存在聚合剂的情况下启动延伸产物的合成。引物的长度取 决于很多因素，包括应用、要使用的温度、模板反应条件、其它试剂和引物来源。例如，取决 于靶序列的复杂程度，寡核苷酸引物通常包含15至35个或更多个核苷酸残基，虽然其可以 包括更少的核苷酸残基。引物可以是大的多核苷酸，例如大约200个核苷酸残基至几千个 碱基或更多。可以将引物选择为与该引物设计用于杂交的模板上的序列“实质上互补”，并 且作为合成的起始位点。“实质上互补”意思是引物互补性足以与靶多核苷酸杂交。优选 地，引物不含有相对于该引物设计用于杂交的模板的错配，但这不是必须的。例如，非互补 性核苷酸残基可以与引物的5’末端连接，引物序列的其余部分与模板是互补的。或者，非 互补性核苷酸残基或非互补性核苷酸残基延伸可以散布于引物内，只要引物序列与其要杂 交的模板序列具有足够的互补性，从而形成用于合成引物的延伸产物的模板。“探针”是指与特定序列或亚序列或另一个分子的其它部分结合的分子。除非另有 指明，否则术语“探针”通常是指通过互补性碱基配对与另一个多核苷酸(通常称为“靶多 核苷酸”)结合的多核苷酸探针。探针可以与缺少与探针完全序列互补性的靶多核苷酸结 合，这取决于杂交条件的严谨度。探针可以进行直接或间接标记。“调控元件”或“调控序列”意思是在特定宿主细胞中表达可操作连接的编码序列 所必需的核酸序列(例如DNA)。例如，适合于原核细胞的调控序列包括启动子和可选的顺 式作用序列，例如操纵子序列和核糖体结合位点。适合于真核细胞的控制序列包括启动子、 多腺苷化信号、转录增强子、翻译增强子、调节mRNA稳定性的引导或尾随序列，以及将转录 的多核苷酸编码的产物靶向细胞中的细胞内腔室或细胞外环境的定向序列。本文使用的术语“序列同一性”是指在比较窗口中序列基于一个核苷酸一个核苷 酸或基于一个氨基酸一个氨基酸的相同程度。因此，“序列同一性百分率”这样计算在比 较窗口比较两个最佳比对的序列，确定两个序列中产生相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I) 或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、 HiS、ASp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数目以生成匹配位置的数目，将匹配位置的数目 除以比较窗口中总的位置数目(即窗口大小)，并且将结果乘以100以产生序列同一性百分 率。本发明考虑到在本发明的方法和系统中全长蛇毒FV序列及其生物活性片段的用途。通 常来讲，全长蛇毒FV的生物活性片段可能参与相互作用，例如，分子内或分子间相互作用。 分子间相互作用可以是特异性结合相互作用或酶的相互作用(例如相互作用可以是瞬间 的，产生或打破共价键)。全长蛇毒FV的生物活性片段包括那些包含与(推导的)全长蛇 毒FV的氨基酸序列具有足够相似性的氨基酸序列的或源于其中的氨基酸序列的肽。通常 来讲，生物活性片段包含具有全长蛇毒FV的至少一个活性的结构域或基序，并且可以包括 A1、A2、B、A3、C1或C2结构域中的一个或多个(在一些情况下全部包括)。全长蛇毒FV的生物活性片段可以是例如长度为30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400或500个
氨基酸残基的多肽。适宜地，生物活性片段具有不低于其所源自的全长多肽的约1 %、10 %、 25%、50%的活性。“相似性”是指相同或以下表C中定义的组成型保守替换的氨基酸数目的百分 率。可以使用序列比对程序例如GAP (Deveraux等人1984，Nucleic AcidsResearch 12: 387-395)来确定相似性。按照这个方式，可以通过将空隙插入比对中而进行与本文所列 的序列相似或实质上不同长度的序列的比较，这样的空隙通过例如GAP所用的比较算法确定。用于描述两个或两个以上多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序 列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分率”和“实质上相同”。“参考序列”的长 度为至少12个但通常为15-18个，常常为至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。 因为两个多核苷酸每个可以包含(1)在两个多核苷酸之间相似的序列(即，仅仅全部多核 苷酸序列的一部分)，和(2)在两个多核苷酸之间不同的序列，所以，两个(或两个以上) 多核苷酸之间的序列比较通常这样进行将两个多核苷酸的序列与“比较窗口”进行比较以 鉴别并比较序列相似性的局部区域。“比较窗口”是指概念上的至少6个连续位置的片段， 经常为大约50至大约100个，更经常为大约100至大约150个，其中，在将两个序列优化 比对之后，将一个序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。比较窗口相对于参考 序列(参考序列不包含添加或删除)可以包含大约20%或20%以下的添加或删除(即空 隙)，以进行两个序列的优化比对。可以通过算法(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7. 0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA 中的 GAP, BESTFIT，FASTA，和TFASTA)的计算机化应用或通过所选的不同方法中的任意一个所产生 的检验和最佳比对(即，在对比窗口产生最高的同源性百分率)来进行用于比对对比窗口 的序列的优化比对。还可以参考例如由Altschul等人，1997，Nucl. Acids Res. 25 3389公 开的BLAST程序家族。可以在Ausubel 等人，“Current Protocols in Molecular Biology”， John Wiley & Sons Inc，1994-1998，第15章的单元19.3中找到序列分析的详细讨论。本文使用的“严谨度”是指杂交和洗涤程序中的温度和离子强度条件、存在或不存 在某些有机溶剂。严谨度越高，固定的靶核苷酸序列和洗涤之后保持与靶向杂交的标记的 探针多核苷酸序列之间的互补性越高。术语“高度严谨”是指只有那些具有高频互补性碱 基的核苷酸序列才杂交的温度和离子条件。所需的严谨度依赖于核苷酸序列并取决于杂交 过程中存在的各种成分。一般地，将严谨条件选择为比特定序列在确定的离子强度和PH下 的热熔解温度(Tm)低大约10-20°C。Tm是50%的靶序列与互补性探针杂交时的温度(在 确定的离子强度和PH下)。术语“转化”意思是通过导入外源或内源核酸改变生物(例如细菌、酵母、哺乳动 物、鸟类、爬行类、鱼类或植物)的基因型。本文使用的术语“治疗(treatment) ”、“治疗(treating) ”等是指获得想要的药理 学和/或生理学效应。该效应可以是预防性的一完全或部分防止疾病或其症状；和/或可 以是治疗性的一部分或全部治愈疾病和/或该疾病的有害影响。本文使用的“治疗”涵盖 哺乳动物(特别是人)的疾病的任意治疗，包括(a)防止易于患上某疾病但尚未被诊断患 有该疾病的个体发生该疾病；(b)抑制疾病，即使其发展停滞；和(c)缓解疾病，即使疾病倒退。“载体”是指这样的多核苷酸分子，优选为源自例如质粒、噬菌体、酵母或病毒的 DNA分子，其中可以插入或克隆入多核苷酸。载体优选含有一个或多个独特的限制性位点， 并且能够在确定的宿主细胞(包括靶细胞或组织或其前体细胞或组织)中自主复制，或可 以整合进入确定的宿主基因组中，从而克隆的序列是可复制的。因此，载体可以是自主复 制的载体，即以额外染色体实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如线性或闭合 环状质粒、额外染色体元件、微小染色体或人工染色体。载体可以包含任意确保自我复制 的方式。或者，载体可以是当被引入宿主细胞时，其整合进入基因组中并且与其所整合 进入的基因组一起复制。载体系统可以包含单一载体或质粒、两个或两个以上载体或质粒 (其一起包含需要导入宿主细胞基因组的总DNA)或转位子。载体的选择通常取决于载体 与该载体要引入的宿主细胞的兼容性。在本例中，载体优选是病毒或源自病毒的载体，其 在动物和优选在哺乳动物细胞中是可操作的有功能的。这样的载体可以源自痘病毒、腺病 毒或酵母。载体还可以包括选择性标记物，例如抗生素抗性基因，其可用于选择合适的转 化子。这样的抗性基因的例子对于本领域技术人员是已知的，包括赋予抗生素卡那霉素和 G418 (Geneticin )抗性的nptll基因和赋予对抗生素潮霉素B抗性的hph基因。术语“野生型”和“天然产生的”相互替换地使用，是指具有从天然产生的来源分 离出来的基因或基因产物的特性的基因或基因产物。野生型基因或基因产物(例如多肽) 是在群体中最常见到的，因此被人为地指定为该基因的“正常的”或“野生型”形式。2.本发明的FV分子本发明部分基于以下确定当在不存在其它凝固因子例如因子Xa和/或因子 VIIa的情况下向个体给予蛇毒FV多肽可以实质性增强人类血浆和全血的凝固。本发明 人令人惊奇地发现单独加入低浓度(例如纳摩尔范围的)的来自澳洲棕蛇Pseudonaja textilis的FV多肽可以引起柠檬酸化的血浆凝固速率的显著提高。因此，本发明人考虑 蛇毒FV多肽可用于治疗或预防手术损伤或外伤后自伤口的血液流失以及血液中内在因子 V水平较低的个体(例如，患有副血友病或Owren副血友病的个体中，其症状可能包括以下 任意一种或多种出血进入皮肤、过度瘀伤、流鼻血、牙龈出血、过量月经出血、手术或外伤 的延长出血或过量出血，以及脐带残端出血)中的血液流失。因此，本发明提供了防止或减少个体中的血液流失或出血的方法，其中以组合 物的形式给予FV多肽，所述组合物可选地包含药学上可接受的载体或稀释剂。可以通 过注射或局部给予组合物以防止或减少个体中的血液流失。可以从中获得蛇毒多肽的 蛇的非限制性例子包括澳洲常见的棕蛇Pseudonaja textilis、海岸太攀蛇(Oxyuranus scutellatus)、内陆太攀蛇(Oxyuranus microlepidotus)、大陆虎蛇(Notechis scutatus, 澳东蛇(Tropidechis carinatus)和红腹伊澳蛇(Pseudechisporphyriacus)以其它及来 自眼镜蛇(Elapidae)属的蛇。可以使用标准的蛋白纯化技术从蛇毒或从其它来源(包括 产生蛇毒FV的细胞和组织)分离蛇毒FV多肽。在一些具体实施方式
中，从眼镜蛇属的澳 洲蛇(例如以上所列的任意一种澳洲蛇)的毒腺分离蛇毒FV。或者，可以通过重组DNA技 术或通过化学合成产生蛇毒FV蛋白或其片段。本发明的多肽包括那些作为可选择性翻译和翻译后事件的存在结果而产生的多 肽。多肽可以在这样的系统中表达例如培养的细胞，相对于在原态细胞中表达多肽时存
28在的翻译后修饰，其产生实质上相同的翻译后修饰；或者可以在这样的系统中表达相对 于在原态细胞中表达时存在的翻译后修饰，其产生翻译后修饰的改变或没有该翻译后修饰 (例如糖基化或切割)。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽具有下列一个或多个特征当FXa (例如哺乳动物FXa如但不限于人类FXa)存在时，它具有使血液凝固的能 力；它具有至少一个多铜氧化酶结构域(例如，Al、A2、A3结构域)；它具有至少一个膜结合结构域(例如Cl、C2结构域)；它具有轻链和重链。在一些具体实施方式
中，蛇毒FV多肽是单一多肽链的形式，如Bos等人(2007， Blood ASH Annual Meeting Abstracts 110 Abstract 1765)所描述。本发明考虑到在本发明方法中全长蛇毒FV多肽及其生物活性片段的的用途。通 常来讲，全长蛇毒FV多肽的生物活性片段可能参与相互作用，例如，分子内或分子间相互 作用。这样的生物活性片段包括那些包含与(推导的)全长蛇毒FV多肽的氨基酸序列具 有足够相似性的氨基酸序列的或源于其中的氨基酸序列的肽，例如SEQ ID NO =2,4,6,8,10 或12所示的氨基酸序列，所述片段包括的氨基酸少于全长蛇毒FV多肽并且表现出该多肽 的至少一个活性。通常来讲，生物活性片段包含具有全长蛇毒FV多肽的至少一个活性的结 构域或基序，并且可以包括一个或多个以下结构域(在一些情况下全部包括)多铜氧化酶 结构域(例如1型和2型)、膜结合结构域、铜氧化还原蛋白结构域、凝固因子5/8型结构 域(例如 FA58C、FA58C_3、F5_F8_ 型 _C、FA58C_2、FA58C_1)、半乳糖结合样结构域、FXa 结 合位点、凝血酶原结合位点、凝血酶切割位点。在一些具体实施方式
中，生物活性片段包含 一个或多个APC切割位点，例如相对于图7的共有编号的残基818-819和/或残基537-538 上。全长蛇毒FV多肽的生物活性片段可以是例如长度为30，40，50，60，70，80，90，100，120， 150，300，400or 500，600，800，900，1000，1100，1200，1300，1400 或更多个氨基酸残基的多 肽。适宜地，生物活性片段具有不低于其所源自的全长多肽的至少1%、10%、25%、50%的 活性。本发明还考虑到是野生型或天然产生的蛇毒FV的变体的蛇毒FV多肽。这样的 “变体”多肽包括通过在原态蛋白的N-末端和/或C-末端删除(所谓的截短)或添加一 个或多个氨基酸、通过在原态蛋白的一个或多个位点删除或添加一个或多个氨基酸或通过 在原态蛋白的一个或多个位点替换一个或多个氨基酸而从该原态蛋白衍生的蛋白。这样的 FV变体多肽的非限制性例子包括全长或前体蛇毒FV的经处理的形式，包括但不限于，从酶 原或前体形式中除去了信号肽结构域和激活肽(或B)结构域的FVa多肽。在一些具体实 施方式中，变体多肽比野生型哺乳动物(例如人)FV少一个或多个(例如1，2，3，4或5个) 的激活的蛋白C(APC)位点。本发明包括的变体蛋白是有生物活性的，S卩，它们持续具有想要的原态蛋白的生 物活性。这样的变体可以来自，例如，遗传多态性或来自人类操作。原态或野生型蛇毒FV 的生物活性变体与原态蛋白的氨基酸序列具有至少40%、50%、60%、70%，一般为至少 75%,80%,85%,经常为大约90%至95%或更多，通常为大约98%或更多的序列相似性或 同一性，如本文其它地方描述的序列比对程序(使用缺省参数)所测定。落入变体多肽范围内的野生型蛇毒FV多肽的生物活性变体可以通常与蛋白具有多达200、100、50或20个氨 基酸残基的差异或者适宜地，仅有1-15个氨基酸残基、仅有1-10个氨基酸残基、例如6-10 个、仅5个、仅4、3、2个或甚至1个氨基酸残基的差异。在一些具体实施方式
中，变体多肽 与SEQ ID NO :2，4，6，8，10和12的相应序列具有至少一个但是15、10或5个氨基酸残基 以下的差异。在其它具体实施方式
中，它与SEQ ID NO :2，4，6，8，10和12的相应序列具有 20%、15%、10%或5%以下的残基差异。可以以各种方式改变蛇毒FV多肽，包括氨基酸替换、删除、截短和插入。这样的操 作的方法在本领域中一般是已知的。例如，可以通过DNA突变来制备FV多肽的氨基酸序列 变体。诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如Kunke 1(1985,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 488-492)，Kunkel 等人，(1987，Methods in Enzymol, 154 :367_382)，美 国专利号 4，873，192，Watson, J. D.等人，("Molecular Biology of the Gene”，Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif.，1987)及其中引用的参考文献。可以 在 Dayhoff 等人，(1978) Atlas of ProteinSequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found. ,Washington,D. C.)的模型中找到合适的不影响目标蛋白生物学活性的氨基酸替换 的指导。筛选通过点突变或截短而制备的组合文库的基因产物的方法以及筛选cDNA文库 以获取具有选定的特征的基因产物的方法在本领域是已知的。这样的方法可适用于迅速 筛选通过FV多肽的组合诱变产生的基因文库。Recursive ensemble mutagenesis (REM) 是一种增强文库中功能性突变体频率的技术，其可与筛选检验组合用于鉴别FV多肽变体 (Arkin 和 Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :7811-7815 ；Delgrave 等人，(1993) Protein Engineering, 6 :327_331)。保守性替换，例如将一个氨基酸替换为另一个具有相 似性质的氨基酸可能是需要的，如下文更详细讨论的。变体FV多肽可以在其序列相对于亲代(例如天然产生的或参考的)FV氨基酸序 列的不同位置上包含保守性氨基酸替换。“保守性氨基酸替换”是指其中氨基酸残基被具 有相似侧链的氨基酸残基替换。本领域中已经确定了具有相似侧链的氨基酸残基家族，其 一般可以次级分类如下酸性的残基由于在生理pH时丧失H离子而带有负电荷，当肽处于生理pH的水性 介质中时，残基被水溶液吸引从而寻找包含该残基的肽的构象中的表面位置。具有酸性侧 链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。碱性的残基由于在生理pH或其一个或两个pH单位之内(例如组氨酸)与H离 子结合而带有正电荷，当肽处于生理PH的水性介质中时，残基被水溶液吸引从而寻找包含 该残基的肽的构象中的表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电的残基在生理pH时是带电的，因此，包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸 (即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。疏水性的残基在生理pH时是不带电的，当肽处于水性介质中时，残基被水溶液 排斥从而寻找包含该残基的肽的构象中的内部位置。具有疏水性侧链的氨基酸包括酪氨 酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。中性的/极性的残基在生理pH时是不带电的；但是，当肽处于水性介质中时，残 基不被水溶液足够地排斥从而它将寻找包含该残基的肽的构象中的内部位置。具有中性/ 极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
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本说明书还将某些氨基酸描述为“小的”，因为它们的侧链不够大(即使缺少极性 基团)，不能赋予疏水性。除了脯氨酸之外，“小的”氨基酸是指当至少一个极性基团位于侧 链时，具有四个或四个以下碳的氨基酸；当侧链上无极性基团时，具有三个或三个以下碳的 氨基酸。具有小的侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。基因编码的二级氨 基酸脯氨酸是特殊情况，因为已知其影响肽链的二级构象。脯氨酸的结构与所有其它天然 产生的氨基酸的不同之处在于其侧链与α-氨基基团的氮以及α-碳结合。但是，几个氨基 酸相似性矩阵(例如，由例如 Dayhoff 等人，(1978)，A model of evolutionary change in proteins. Matrices fordetermining distance relationships In M. 0. Dayhoff, (ed.), Atlas of protein sequenceand structure, Vol. 5, pp. 345—358, National Biomedical Research Foundation, Washington DC 禾口 Gonnet 等 人’ (1992), Science,256(5062) 14430-1445公开的PAM120矩阵和PAM250矩阵)将脯氨酸与甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨 酸包括在相同的组中。因此，为了本发明的目的，脯氨酸被分类为“小的”氨基酸。分类为极性或非极性所需的吸引或排斥程度是人为设定的，因此，本发明特别考 虑到的氨基酸被分类为一类或另一类。多数没有经过特别命名的氨基酸可以基于其已知行 为进行分类。氨基酸残基可以进一步被次级分成环形或非环形的、以及芳香族或非芳香族的 (一看即知是根据残基的侧链取代基团进行的分类)以及小的或大的。如果残基含有总共 4个或4个以下碳原子(包括羧基碳)则认为该残基是小的，只要存在另一个极性取代基； 如果不存在，则为3个或3个以下。当然，小的残基一定是非芳香族的。取决于其结构特征， 氨基酸残基可以被分成两类或更多类。对于天然产生的蛋白氨基酸，根据该方案进行的次 级分类显示于表B。表B氨基酸次级分类
权利要求
一种治疗或预防个体中的出血事件或凝固紊乱的方法，该方法包括向个体给予有效量的抑制出血的蛇毒FV多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽包含(a)与SEQID NO =2,4,6,8,10 或12任一项所示的序列具有至少50%序列相似性的氨基酸序列；或(b)与SEQ ID NO :1， 3，5，7，9或11任一项所示的序列具有至少50%序列相似性的核苷酸序列或其互补物所编 码的氨基酸序列；或(c)与SEQ ID NO :1，3，5，7，9或11任一项所示的序列在至少低度严谨 条件下杂交的核苷酸序列或其互补物所编码的氨基酸序列，其中，(a)、(b)或(c)的氨基酸 序列具有选自下列的一个或多个活性抑制出血的活性、减少凝固时间的活性；增强止血 的活性；延长凝块溶解时间的活性或增强凝块强度的活性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽以包含药学上可接受的载体的组合物 的形式给药。
4.根据权利要求3所述的方法，其中组合物配制为通过局部给药或静脉内给药。
5.根据权利要求3所述的方法，其中组合物不包括FVII和/或FVIIa。
6.根据权利要求3所述的方法，其中组合物不包括蛇毒FXa。
7.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽包含轻链和重链结构域，如图7所示。
8.根据权利要求7所述的方法，其中激活肽被置于轻链和重链结构域之间，如图7所示。
9.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽不具有激活肽。
10.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV包括一个或多个(a)位于重链区域内的 多铜氧化酶结构域；(b)位于轻链区域内的多铜氧化酶结构域；和(c)位于轻链区域内的膜 结合结构域。
11.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV包括一个或多个(1)铜氧化还原蛋白结 构域，如在 European Bioinformatics Institute(EBI)数据库 InterPro 标志 IPR008972 和超家族条目SSF49503中所定义；(2)多铜_氧化酶1型结构域，如在EBI InterPro数据 库中在InterPro标志IPR002355和Prosite条目PS00079中所定义；(3)铜氧化酶_2结 构域，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR011706和Pfam条目PF07731中所定义；(4) FA58C结构域，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421和SMART登录号SM00231中所 定义；(5)FA58C_3结构域，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421和Prosite条目 PS50022中所定义；(6)F5_F8_S_C结构域，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421 和Pfam条目PF00754中所定义；(7) Gal_结合_样结构域，如在EBI数据库中在InterPro 标志IPR008979和超家族条目SSF49785中所定义；(8) FA58C_1结构域，如在EBI数据库中 在 InterPro 标志 IPR000421 和 Prosite 条目 PS01285 中所定义；(9)FA58C_2 结构域，如 在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421和Prosite条目PS01286中所定义；和(10) 因子结构域，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR0014693和ProteinInformation Resource条目PIRSF5000150中所定义；或其生物活性片段。
12.根据权利要求11所述的方法，其中蛇毒FV多肽包含(1)至少一个铜氧化还原 蛋白结构域；(2)至少一个多铜_氧化酶1结构域；(3)铜氧化酶—2结构域；(4)至少一个 FA58C结构域；(5)至少一个FA58C_3结构域；(6)至少一个F5_F8_型_C结构域；(7)至少 一个Gal_结合_样结构域；(8)至少一个FA58C_1结构域；(9)至少一个FA58C_2结构域； 和(10)因子^结构域。
13.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽缺少信号肽结构域。
14.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽包括一个或多个(a)Al结构域；(b) A2结构域；(c)B结构域；(d) A3结构域；(e) Cl结构域；和(f)C2结构域，其中A1、A2和A3 结构域是多铜氧化酶结构域的不同版本，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR001117中 所定义；B结构域在激活过程中被除去；Cl和C2是促进膜结合的结构域，如在EBI数据库中 在InterPro标志IPR000421中所定义。
15.根据权利要求14所述的方法，其中蛇毒FV多肽包含Al、A2和A3结构域以及Cl和 C2结构域。
16.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽包含一个或多个以下的结构域(编 号是指图7中的共有编号)一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基31-772所定义的重链结构域具有至少70%序 列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基773-817所定义的激活结构域具有至少70% 序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基818-1461所定义的轻链结构域具有至少70% 序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基31-208，209-337，351-530，500-682，823-997 和963-1153所定义的任意一个铜氧化还原结构域具有至少70%序列相似性或与之具有不 超过20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基307-327,662-681和1120-1138所定义的任 意一个多铜_氧化酶1结构域具有至少70%序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残 基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基581-687所定义的铜_氧化酶_2结构域具有 至少70%序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1147-1298和1303-1457所定义的任意一个 Gal_结合_样结构域具有至少70 %序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异 的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1146-1296和1302-1455所定义的任意一个 FA58C结构域具有至少70%序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构 域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1147-1296和1303-1455所定义的任意一个 FA58C_3结构域具有至少70%序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结 构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1141-1455所定义的FA58C_2结构域具有至 少70%序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1187-1215和1347-1374所定义的任意一个 FA58C_1结构域具有至少70%序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结 构域；一与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1162-1293和1318-1452所定义的任意一个f5_f8_型_c结构域具有至少70%序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异 的结构域。
17.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒fv多肽包含以下一个或多个结构域(编号 是指图7中的共有编号)一与例如图7所示的任意蛇毒fv的残基31-348所定义的al结构域具有至少70%序 列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒fv的残基349-691所定义的a2结构域具有至少70%序 列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒fv的残基772-817所定义的b结构域具有至少70%序 列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒fv的残基819-1148所定义的a3结构域具有至少70% 序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒fv的残基1149-1299所定义的cl结构域具有至少70% 序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；一与例如图7所示的任意蛇毒fv的残基1300-1461所定义的c2结构域具有至少70% 序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域。
18.根据权利要求17所述的方法，其中蛇毒fv多肽缺少激活肽或b结构域。
19.根据权利要求17所述的方法，其中重链包含以下序列
20.AQLREYx1X2AAQLEDffDYNpQpEELsRLsEsx3LTFKKIVYREYELDFKQEX4X5RDX6LsGLLGpTLRGEv ⑶ x7liiyfknfatqpvsihpqsavynkwsegssysdgtsdverlddavppgqsfkyvwnitaeigpkkadppclt yayyshvnmvrdfnsgligallickegslnax8gx9qkffnreyvlx10fsvfdesknwyrkpslqytingfangtlpdVQACAYDHISffHLIGMSSSPEIFSVHFNGQTLEQNHYKVSTIXnX12VGGASVTAX13MSVSRTGKffLISSLVAKHLQagmygylnikdcgx14px15tltrklsfrex16x17x18ix19x20weyfiaaeeitwdyx21peipssvdrrykaqyldnfsn figkkykkavfrqyedx22nftkptyaiwpkergilgpvikakvrdtvtivfknlasrpysiyvhgvsvskdaegax2 3ypsdpkenithgkavepgqvytykwtvldtdeptvkdsecitklyhsavdmtrdiasgligpllx24ckx25kalsx26 x27gvqnkadveqha vfavfdenkswylednikkycsnpsx28vkkddpkfyksnvmytlngyasdrtevx29x30fhqsEVVX31ffHLTSVGTVDEIVPVHLSGHTFLSKGKHQDILNLFPMSGESATVTMDNLGTWLLSSffGSCEMSNGMRLRFLDanyddedegneeeeeddgdifadifx32px33ewx34kkeevpvnfvpdpesdalakelglx35ddex36npx37x38qx39r x40eqteddeeqlmx41asx42lglr[seq id no: 15]， 其中X1选自碱性氨基酸残基(例如，Arg或His，或其修饰的形式)； X2选自疏水性氨基酸残基；X3选自酸性氨基酸残基(例如Glu或Asp，或其修饰的形式)； X4选自带电的氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如LyS，或其修饰的形式，或酸性 氨基酸残基，例如glu，或其修饰的形式)；X5选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如 Leu,或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Pro，或其修饰的形式)；X6选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或小的氨 基酸残基，例如Ala，或其修饰的形式)；X7选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如 lie，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Ser，或其修饰的形式)；X8选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或 酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式)；X9选自小的氨 基酸残基(例如Ser或Ala，或其修饰的形式)； X10选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Met或Val，或其 修饰的形式)；X11选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式，或中性/ 极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)；X12选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Pro，或其修饰的形式，或疏水性 氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Leu，或其修饰的形式)；X13选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或 酸性氨基酸残基例如Asp，或其修饰的形式)；X14选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如His，或其修饰的形式，或中性/ 极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)；X15选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或 酸性氨基酸残基例如Asp，或其修饰的形式)；X16选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Leu，或其修饰的 形式，或具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Trp，或其修饰的形式)；X17选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如 Met,或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Arg，或其修饰的形式)； X18选自碱性氨基酸残基(例如Arg或Lys，或其修饰的形式)； X19选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如 Met,或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Lys，或其修饰的形式)；X20选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或 碱性氨基酸残基例如Lys，或其修饰的形式)；X21选自小的氨基酸残基(例如Pro或Ala，或其修饰的形式)； X22选自小的氨基酸残基(例如Gly或Ser，或其修饰的形式)； &3选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Ile或Val，或其 修饰的形式)；X24选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，或其 修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Ala，或其修饰的形式)；X25选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如 Leu,或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Arg或His其修饰的形式)；&6选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Ile或Val，或其 修饰的形式)；X27选自碱性氨基酸残基(例如Arg或Lys，或其修饰的形式)； X28选自小的氨基酸残基(例如Ser或Ala，或其修饰的形式)； X29选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Leu，或其修饰的形式，或具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Trp，或其修饰的形式)；X30选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Arg，或其修饰的形式)；X31选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Gln，或其修饰的形式，或 酸性氨基酸残基例如Glu，或其修饰的形式)；X32选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Ser，或其修饰的形式，或中性/ 极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的 残基，例如lie，或其修饰的形式)；X33选自小的氨基酸残基(例如Pro或Ser，或其修饰的形式)； X34选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，或疏水性 氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如He，或其修饰的形式)；X35选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Leu或lie，或其 修饰的形式，或具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Phe，或其修饰的形式)；X36选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式，或小的氨 基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；X37不存在或选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的残基，例如He，或其修饰 的形式)；X38选自任意氨基酸残基(例如带电的氨基酸残基，包括碱性氨基酸残基，例如Lys，或 其修饰的形式，和酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括 具有脂肪族侧链的残基，例如He，或其修饰的形式)；X39选自小的氨基酸残基(例如Ser或Pro，或其修饰的形式)； X4tl选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Ser，或其修饰的形式，或碱性氨 基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式)；X41选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如 He,或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；和X42选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Val，或其修饰的 形式，或具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式)。
21.根据权利要求7所述的方法，其中激活肽包含以下序列 sfkgsvaeeelkhtalaleedahasdpridsnsax43nx44ddiagryl[seqid no 16], 其中X43选自碱性氨基酸残基(例如Arg或His，或其修饰的形式)；和 X44选自小的氨基酸残基(例如Ser或Pro，或其修饰的形式)。
22.根据权利要求7所述的方法，其中轻链包含以下序列 rtix45rx46nkrryyiaaeevlwdyspix47ksqvrsx48x49akttfkkaifrsylddtfqtpstggeyekhlgilgpiiraevddvx50ex51qfx52nlasrpyslhahgllyekssegrsyddx53spelfkkddaimpngtytyvwqvpprSGPTDNTEKCKSffAYYSGVNPEKDIHSGLIGPILICQKGMIDKYNRTIDIREFVLFFMVFDEEKSWYFPKSDKSTCeekligvqx54sx55htfpaingipyqlqglx56mykdenvhwhllnmggpkdx57hvvnfhgqtfteegrednqlgvlp llpgtfasikmkpskigtwlletevgenqergx58qalftvidkx59cklpmglasgiiqdsqisasghvx60ywepklARLNNTGX61X62NAWSIIKKEHEHPffIQIDLQRQVVITGIQTQGTVX63LLX64HSYTVEYFVTYSX65DGQNWITFKGRhsx66tqmhfegnsdgttvkenhidppiiaryirlhptkfynx67ptfriellgcevegcsvplgmesgaikx68seitASSYKKTffffSSffEPX69LARLNLX70GX71TNAffQPX72VNNKDQffLQIDLQHLTKITSIITQGATSMTTX73MYVKTFSIhytddnstwx74pyldvrtsmekvftgninx75dghvkhffx76ppilsrfiriipktwnqyialrielfgcevf[seqid no :17],其中X45选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有芳香族侧链的残基，例如 Tyr,或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)；X46选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式，或小的氨 基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；X47选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式，或小的氨 基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；X48选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如 Leu,或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式)； X49选自小的氨基酸残基(例如Pro或Ala，或其修饰的形式)； X5tl选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基或其修饰的形式，例如lie，或其修饰 的形式，或小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式)；X51选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Val或lie，或其 修饰的形式)；X52选自碱性氨基酸残基(例如，Arg或Lys，或其修饰的形式)； X53选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或 碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；X54不存在或选自小的氨基酸残基(例如Ser或其修饰的形式)； X55选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Arg或His，或其修饰的形式，或 疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Leu，或其修饰的形式)；X56选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式，或疏水性 氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式)；X57选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如 lie，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式)；X58选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如 Met，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式)；X59选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式，或小的氨 基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；X6tl选自选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或小 的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；X61选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如 Met，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；X62选自疏水性氨基酸残基(例如具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Phe或Tyr，或其 修饰的形式)；X63选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如His，或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如Gln，或其修饰的形式)；X64选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)，或中性/ 极性氨基酸残基，例如Gln，或其修饰的形式)；X65选自带电的氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，或酸性 氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式)；X66选自带电的氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或碱性 氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；X67选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式，或碱性氨 基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式)；X68选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或 酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式)；X69选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有芳香族侧链的残基，例如 Phe，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Ser，或其修饰的形式)；X7tl选自带电的氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或碱性 氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；X71选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式，或碱性氨 基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式)；X72选自带电的氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或碱性 氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；X73选自小的氨基酸残基(例如Ala或Ser，或其修饰的形式)； X74选自选自碱性氨基酸残基(例如Lys或Arg，或其修饰的形式)； X75选自小的氨基酸残基(例如Ser或Gly，或其修饰的形式)； X76选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如LyS，或其修饰的形式，或中性/ 极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)。
23.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽包含(1)与SEQID NO 15所示的 序列具有至少70%序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的氨基酸序列； 和(2)与SEQ ID NO :17所示的序列具有至少70%序列相似性或与之具有不超过20个氨 基酸残基的差异的氨基酸序列。
24.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽包含序列MGRYSVSPVPKCLLLMFLGWSGLKYYQ。
25.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽包含与SEQID NO :2,SEQ IDNO :4,SEQ ID NO 6, SEQ ID NO :8，SEQ ID NO 10 和 SEQ ID NO 12 任一项所示的序列具有至少 70% 序列相似性或序列同一性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的序列。
26.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽缺少信号肽结构域和激活肽(或B)结 构域中的至少一个。
27.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽包含FXa结合位点、凝血酶原结合位点 和凝血酶切割位点中的一个或多个。
28.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽包含至少一个Fxa结合位点，凝血酶原 结合位点和凝血酶切割位点。
29.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽包含以下任意一个或多个(1)在大约残基338-379的FXa结合位点；(2)在大约残基524-537的FXa结合位点；(3)在大约残基703-707的凝血酶原结合位点；(4)在大约残基772-773的凝血酶切割位点； 其中，编号是指图7中的共有编号。
30.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽在相对于图7的共有编号的残基 818-819和/或537-538上包含APC位点。
31.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽的激活的蛋白C(APC)位点比野生型哺 乳动物的FV少一个或多个。
32.—种药物组合物，其基本上由权利要求1定义的蛇毒FV多肽和药学上可接受的载 体或稀释剂组成。
33.根据权利要求32所述的组合物，其配制为局部给予。
34.根据权利要求32所述的组合物，其不包括FVII和/或FVIIa。
35.根据权利要求32所述的组合物，其不包括蛇毒FXa。
36.权利要求1定义的蛇毒FV多肽在制备用于治疗血液流失或凝固紊乱的药物中的用途。
37.根据权利要求36所述的用途，其中蛇毒FV多肽配制为注射或局部应用，以防止或 减少个体中的从个体的身体上或身体内的出血位点的血液流失。
38.根据权利要求36所述的用途，其中药物不包括FVII和/或FVIIa。
39.根据权利要求36所述的用途，其中药物不包括蛇毒FXa。
40.权利要求1定义的蛇毒FV多肽在制备用于防止或减少血液流失或凝固紊乱的试剂 盒中的用途。
41.根据权利要求40所述的用途，其中试剂盒包括任意一种或多种药学上可接受的载 体或稀释剂；一种或多种用于制备蛇毒FV多肽以向个体给药的容器；一种或多种其它试剂 和/或其它治疗剂；用于向患者给予蛇毒FV多肽的设备或其它材料；和给予试剂盒以治疗 个体中的血液流失的说明书。
42.根据权利要求40所述的用途，其中试剂盒不包括FVII和/或FVIIa。
43.根据权利要求40所述的用途，其中试剂盒不包括蛇毒FXa。
44.根据权利要求40所述的用途，其中试剂盒用于以下一项或多项减少获得完全止 血所需的时间；减少维持止血所需的时间；减少凝固的时间；延长凝块溶解的时间；和增加 出血位点凝块的强度。
45.根据权利要求40所述的用途，其中蛇毒FV多肽配制成用于有效获得以下一项或 多项的量来给予(1)抑制出血；(2)减少凝固时间；(3)增强止血；(4)延长凝块溶解时间； 和(5)增强凝块强度。
46.根据权利要求40所述的用途，其中蛇毒FV多肽配制为由个体之外的人员给药。
47.根据权利要求40所述的用途，其中蛇毒FV多肽配制为自己给药。
48.根据权利要求40所述的用途，其中蛇毒FV多肽配制为在需要使用其之前向个体提{共。
全文摘要
本发明公开了蛇毒FV多肽在用于防止或减少出血事件中的血液流失或出血的方法和组合物中的用途。
文档编号A61K38/36GK101969984SQ200880121960
公开日2011年2月9日 申请日期2008年12月18日 优先权日2007年12月20日
发明者J·德泽西, P·P·马希 申请人:昆士兰大学;维诺米克斯私人有限公司