蛋白的重组真核细胞培养物进行发酵；b)将来自步骤a)的发酵的细胞培养物离心以得 到发酵产物；c)将步骤b)产生的发酵产物进行均质化以得到发酵匀浆；和d)将步骤c)产 生的发酵匀浆分离以得到沉淀以及澄清的酵母提取物（CYE)，所述酵母提取物含有具有促 凝活性的携带TF的来源微泡；e)收集所述澄清的酵母提取物（CYE)，所述酵母提取物含有 具有促凝活性的携带TF的酵母来源微泡；和，任选地，f)如果需要，通过尺寸分离方法将所 述具有促凝活性的携带TF的酵母来源微泡进行分离或纯化；和g)在带负电荷的磷脂（即， 磷酯酰丝氨酸）中富集获得的微泡，所述富集通过将组分磷酯酰丝氨酸以及含有TF的脂质 微泡孵育来实现。作为所述孵育之前的步骤，可以通过将脂质在缓冲溶液中重悬随后超声 处理，将磷酯酰丝氨酸制备为多层囊泡。
[0093] 产生TF的方法取决于使用的真核细胞。通常，用表达载体转化真核细胞，所述表 达载体含有编码TF蛋白的核苷酸序列，其与细胞内的功能性启动子可操作地相连，所述细 胞可以来自：真菌、酵母、植物或动物（例如鱼、爬行动物、哺乳动物、昆虫等）。可以使用 cDNA文库作为模板以及合适的引物，通过聚合酶链式反应（PCR)将编码TF蛋白的cDNA进 行扩增。实施例1公开了编码成熟hTF蛋白的cDNA的扩增，所述成熟hTF蛋白在3'端含 有18个额外的核苷酸（编码六个组氨酸）。
[0094] 在另一个实施方案中，TF蛋白可遵循完善的色谱纯化的方法从上面的步骤a)到 d)纯化。一旦纯化，可以在体外以最佳磷脂浓度将TF蛋白脂化。
[0095] 在另一个实施方案中，可以从动物组织提取物中获得脂化的TF，例如脑、胎盘和肺 组织，组织可来自不同动物，如羊、牛、兔、狗和人等。优选地，脂化的TF来自人。更优选地， 脂化的TF是人重组体。
[0096] 在本发明中，术语"凝血酶（FIIa) "应被理解为关键的丝氨酸蛋白酶，其在止血中 发挥关键作用。FIIa激活参与凝血级联反应的多种凝血因子，包括纤维蛋白原（FI)、因子 V (FV)、因子VIII (FVIII)、因子XI (FXI)以及因子XIII (FXIII)。FIIa也激活血小板以及血 管内皮细胞。凝血酶前体是凝血素酶原（FII)，其由肝脏分泌至血液中。在凝血级联过程 中，FII以不同的速率转变为Flla，首先通过激活的FX(FXa)，并且在级联的最后步骤通过 凝血素复合物（FXa = FVa)。FII从人源或牛源血浆分离后产生商业的Flla。分离之后，FII 在体外被转化为Flla。所有目前市售的FS都含有人源或牛源的Flla。此外，高度纯化的 重组人FIIa也是可获得的。这种重组人FIIa来自于纯化后的人FII，所述人FII来自重组 中国仓鼠卵巢（CHO)细胞，随后通过体外方法加工为Flla。
[0097] 本发明可以使用的不例性FII蛋白包括人FII (UniProtKB/Swiss-Prot· Version 182, 2012 年 11 月，登录号 P00734.)、牛 FII (UniProtKB/Swiss-Prot. Version 153, 2012 年 11 月，登录号 P00735)、鼠 FII (UniProtKB/Swiss-Prot. Version 141，2012 年 11 月，登录号 P19221)、猪 FII (UniProtKB/Swiss-Prot. Version 37, 2012 年 11 月·登录号 B3STX9)，以及 不同动物的FII蛋白。优选地，凝血酶为人源或牛源，但是更优选人凝血酶，且甚至更优选 重组人凝血酶。
[0098] 本领域公知的是，凝血酶的浓度以单位/mL表示。表示凝血酶的量的单位可以是 "NIH"单位或国际单位。如何将一个系统中表述的单位换算为另一种在本领域也是公知 的：
[0099] IIOWA 单位=(λ 83NIH 单位
[0100] IIU =INIH 单位
[0101] INIH 单位=0· 324 ± 0· 073mg
[0102] INIH 单位=IUSP 单位
[0103] 在一个实施方案中，本发明的任何组合物是液体形式。在这一实施方案中，可以通 过制备单独的凝血酶溶液和脂化的TF溶液获得组合物，两种溶液的浓度使得将两种溶液 混合后，得到的组合物具有上文提到的规定浓度的凝血酶和TF。可选地，可以通过制备凝血 酶或脂化的TF溶液并且另一组分以粉末的形式加入获得组合物，只要得到的液体组合物 中每一组分的终浓度为上文提到的浓度。可以使用任何生理上可接受的溶剂。溶剂的示例 性、非限制性实例包括水、盐水缓冲液、磷酸盐缓冲液或体液，如血液或滑液。
[0104] 在另一个实施方案中，本发明的任何组合物是粉末形式。在该实施方案中，可以通 过从液体组合物（可根据以上公开内容获得）出发获得组合物，该液体组合物已具有规定 浓度的凝血酶和脂化的TF，然后可以将其进行公知的制粉技术，只要此种技术不对凝血酶 或TF的稳定性产生不利影响。制粉技术的示例性、非限制性的实例基于干燥技术，例如，冻 干法或喷雾干燥法。
[0105] 可选地，可以通过从粉末形式的凝血酶和脂化的TF出发获得粉末组合物。在该实 施方案中，技术人员可以容易地确定需要的每一组分的量，从而获得每一组分具有规定浓 度的组合物。
[0106] 在另一实施方案中，本发明的任何组合物是固体泡沫形式。这些固体泡沫可以通 过喷雾干燥技术从液体组合物（可根据上文的公开内容获得）获得。
[0107] 在另一个实施方案中，本发明的任何组合物是半固体形式。为了获得这种形式，需 要合适的赋形剂和载体。下文提供了对获得此种半固体组合物有用的赋形剂和载体。
[0108] 在本发明第一方面的实施方案中，组合物还包括交联剂。
[0109] 在本发明第一方面的另一个实施方案中，组合物还包括纤维蛋白溶解抑制剂。
[0110] 在本发明第一方面的另一个实施方案中，组合物还包括CaCl2。
[0111] 在本发明第一方面的又一个实施方案中，组合物还包括交联剂和纤维蛋白溶解抑 制剂。
[0112] 在本发明第一方面的又一个实施方案中，组合物还包括交联剂和CaCl2。
[0113] 在本发明第一方面的又一个实施方案中，组合物还包括纤维蛋白溶解抑制剂和 CaCl2O
[0114] 在本发明第一方面的又一个实施方案中，组合物还包括交联剂、纤维蛋白溶解抑 制剂和CaCl2。
[0115] 优选地，所述交联剂为FXIII或激活的FXIIIa。
[0116] 优选地，所述纤维蛋白溶解抑制剂选自抑肽酶、凝血酸和氨基乙酸。
[0117] 如上文所述，本发明另一方面提供药学或兽医学组合物，所述组合物包括治疗有 效量的本发明第一方面的组合物，以及合适的药学或兽医可接受的赋形剂和/或载体。
[0118] 本文使用的表述"治疗有效量"指当施用该量的组合物时，足以阻止被治疗疾病的 一种或多种症状的发展或将其减轻至一定程度。施用根据本发明的组合物的具体剂量当然 由围绕事件的具体情况决定，包括施用的化合物、给药途径、被治疗的具体状态以及相似的 考虑。
[0119] 制备此类药学或兽医学组合物的方法在本领域是已知的。
[0120] 本发明的药学或兽医学组合物应局部施用于出血部位，可直接施用或者通过载体 材料施用，例如纱布。局部施用的实例包括，但不限于，外部、皮肤、鼻内、囊内、阴道内、颊、 直肠、眼、内窥镜局部应用以及滴注法。
[0121] 本发明第二方面的药学或兽医学组合物可采取以下形式：软的或硬的凝胶、液体、 洗液、乳霜、药膏、糊剂、走珠剂型、喷雾、气溶胶、泡沫、施用垫剂型以及成膜剂型。
[0122] 对于局部给药，合适的药学赋形剂或载体包括，但不限于，保湿剂、润肤剂、乳化 剂、湿润剂、pH调节剂、抗氧化剂、防腐剂、介质或其混合物。使用的赋形剂或载体对皮肤有 亲和性，耐受性好、稳定，并且用量足够提供理想的均一性，易于施用。
[0123] 当本发明的药学或兽医学组合物是局部使用时，它可配制为多种形式，包括，但不 限于，溶液、洗液、凝胶、药膏、糊剂、乳霜、软的或硬的凝胶、液体、泡沫、走珠剂型、喷雾、气 溶胶、施用垫剂型以及成膜剂型。可以根据本领域已知的方法制备这些局部药学组合物。合 适的药学赋形剂和/或载体以及它们的量可由本领域技术人员根据制备的剂型的种类容 易地确定。
[0124] 在本发明第二方面的药学或兽医学组合物的一个实施方案中，组合物包括交联 剂。
[0125] 在本发明第二方面的药学或兽医学组合物的另一个实施方案中，组合物还包括纤 维蛋白溶解抑制剂。
[0126] 在本发明第二方面的药学或兽医学组合物的另一实施方案中，组合物还包括 CaCl2O
[0127] 在本发明第二方面的药学或兽医学组合物的又一实施方案中，组合物还包括交联 剂和纤维蛋白溶解抑制剂。
[0128] 在本发明第二方面的药学或兽医学组合物的又一实施方案中，止血组合物还包括 交联剂和CaCl2。
[0129] 在本发明第二方面的药学或兽医学组合物的又一实施方案中，组合物还包括纤维 蛋白溶解抑制剂和CaCl2。
[0130] 在本发明第二方面的药学或兽医学组合物的又一实施方案中，组合物还包括交联 剂、纤维蛋白溶解抑制剂和CaCl2。
[0131] 优选地，所述交联剂为FXIII。
[0132] 优选地，所述纤维蛋白溶解抑制剂选自抑肽酶、凝血酸和氨基乙酸。
[0133] 本发明的组合物可用作经历手术的患者通过常规外科技术（如缝合线、绷带和烧 灼）控制出血时的止血辅助物，以及标准外科技术（例如缝合线和绷带）中的辅助物以防 止渗漏。
[0134] 在又一方面，本发明提供止血组合物和载体材料，所述组合物包括本发明第一方 面的组合物或本发明第二方面的药学或兽医学组合物。
[0135] 在本发明中，在组合物、效果和用途中涉及的术语"止血剂"应被理解为促进凝血 的物质，即，能止住出血。它也可被称为"抗出血药物"和"促凝剂"。
[0136] 术语"载体材料"应被理解为允许在其上沉积、运输和在期望的部位释放本发明组 合物的合适的材料基质，所述期望的部位例如本发明组合物发挥治疗效果的部位。所述载 体材料可以是固体载体。固体载体的示例性、非限制性的实例包括敷料、创可贴、敷布、膏药 等。液体载体的示例性、非限制性的实例包括凝胶、喷雾、漱口水等。组合物组分与固体材 料之间的相互作用可以是物理或化学相互作用。
[0137] 在一个实施方案中，载体材料是由胶原、明胶或氧化再生纤维素制成的固体载体。
[0138] 在另一个实施方案中，载体材料是用于分散粉末的装置。
[0139] 在一个实施方案中，第一方面的组合物以液体形式施用于载体材料，即，用本发明 的组合物浸润载体。
[0140] 在本发明第三方面的止血组合物的另一个实施方案中，止血组合物包括交联剂。
[0141] 在本发明第三方面的止血组合物的另一个实施方案中，止血组合物还包括纤维蛋 白溶解抑制剂。
[0142] 在本发明第三方面的止血组合物的另一实施方案中，止血组合物还包括CaCl2。
[0143] 在本发明第三方面的止血组合物的又一实施方案中，止血组合物还包括交联剂和 纤维蛋白溶解抑制剂。
[0144] 在本发明第三方面的止血组合物的又一实施方案中，止血组合物还包括交联剂和 CaCl2O
[0145] 在本发明第三方面的止血组合物的又一实施方案中，止血组合物还包括纤维蛋白 溶解抑制剂和CaCl2。
[0146] 在本发明第三方面的止血组合物的又一实施方案中，止血组合物还包括交联剂、 纤维蛋白溶解抑制剂和CaCl2。
[0147] 优选地，所述交联剂为FXIII。
[0148] 优选地，所述纤维蛋白溶解抑制剂选自抑肽酶、凝血酸和氨基乙酸。
[0149] 由于以上详细指出的性质，本发明的组合物可用作伤口愈合剂。
[0150] 表述"伤口愈合"