5 In:单克隆抗体和癌治疗（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy), Alan R. Liss, Inc.，77-96页）可被利用和可被制备。
[0072] 此外，人抗体也可使用另外的技术(其包括噬菌体展示文库）而制备。（参见 Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol.，227:381 (1991) ;Marks 等人，J. Mol. Biol.， 222:581 (1991))。类似地，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如，其 中内源免疫球蛋白基因被部分地或完全地失活的小鼠）制得。在激发时，观察到人抗体产 生，其与在人中包括基因重排、装配和抗体库（antibody repertoire)的所有方面中观察 到的密切相似。此方法在例如，美国专利号5, 545, 807、5, 545, 806、5, 569, 825、5, 625, 126、 5,633,425、5,661，016和]\&^1^等人，81〇八6(*11〇1(^7 10，779-783 (1992)山〇1*6邙等 人，Nature 368 856-859(1994) ;Morrison, Nature 368， 812-13(1994) ;Fishwild 等 人，Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996);以及 Lonberg 和 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93(1995)中描述。
[0073] 人抗体可另外使用转基因非人动物而制备，所述动物被修饰以便在响应抗原的激 发时产生全人抗体而非该动物的内源抗体。（参见PCT公开W094/02602)。在非人宿主中 编码重和轻免疫球蛋白链的内源基因已经被失能，并且编码人重链和轻链免疫球蛋白的活 性的基因座被插入宿主的基因组。人基因例如使用含所需人DNA片段的酵母人工染色体而 被掺入。随后通过将中间转基因动物(其含有少于全部修饰补充）杂交作为子代获得提供 全部所需修饰的动物。这类非人动物的优选实施方案是小鼠，并被称为Xenomouse? (如在 PCT公布WO 96/33735和WO 96/34096中公开）。此动物产生分泌全人免疫球蛋白的B细 胞。抗体可在用目的免疫源免疫之后直接从动物(例如，作为多克隆抗体的制备）或备选地 从来源于该动物的永生化的B细胞（例如产生单克隆抗体的杂交瘤）获得。另外，编码具 有人可变区的免疫球蛋白的基因可被回收并表达以直接获得抗体，或可被进一步修饰以获 得抗体的类似物，例如，单链Fv (scFv)分子。
[0074] 产生缺乏内源免疫球蛋白重链的表达的非人宿主(例如小鼠）的方法的实例在美 国专利号5, 939, 598中公开。它可以通过以下方法获得，所述方法包括：从胚胎干细胞中的 至少一个内源重链基因座中删除J片段基因以阻止基因座的重排和阻止重排的免疫球蛋 白重链基因座的转录物的形成，所述删除通过含编码可选择标志物的基因的靶向载体而实 现；和从胚胎干细胞产生转基因小鼠，其体细胞和生殖细胞含有编码可选择标志物的基因。
[0075] 用于制备目的抗体(例如人抗体)的一种方法在美国专利号5, 916, 771中公开。此 方法包括将含有编码重链的核苷酸序列的表达载体引入培养中的一种哺乳动物宿主细胞 中，将含编码轻链的核苷酸序列的表达载体引入另一哺乳动物宿主细胞，并将两种细胞融 合以形成杂交细胞。该杂交细胞表达含重链和轻链的抗体。
[0076] 在对此方法的进一步改进中，用于鉴定免疫源上的临床相关表位的方法和用于选 择以高亲和力免疫特异性地结合至相关表位的抗体的相关方法在PCT公布WO 99/53049中 公开。
[0077] 抗体可通过含编码上面描述的单链抗体的DNA片段的载体表达。
[0078] 这些可包括载体、脂质体、裸DNA、佐剂-辅助的DNA、基因枪、导管等。载体包括例 如在WO 93/64701中描述的化学缀合物(其具有靶向部分（例如，细胞表面受体的配体）和 核酸结合部分（例如，多聚赖氨酸））、病毒载体（例如DNA或RNA病毒载体）、在例如PCT/ US 95/02140 (W0 95/22618)中描述的融合蛋白（其为含靶向部分（例如对靶细胞特异的 抗体）和核酸结合部分（例如鱼精蛋白））、质粒、噬菌体等。所述载体可为染色体的、非染 色体的或人造的。
[0079] 优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼 氏鼠白血病病毒。DNA病毒载体是优选的。这些载体包括痘载体例如正痘或禽痘载体、疱 疹病毒载体例如单纯疱疹病毒I (HSV)载体（参见Geller，A. I.等人，J. Neurochem， 64:487 (1995) ;Lim, F.等人，in DNA Cloning: Mammalian Systems (在DNA克隆中：哺 乳动物系统），D. Glover编辑（Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller， A. I.等人，Proc Natl. Acad. Sci·: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A. I.等人， Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990))、腺病毒载体（参见 LeGal LaSalle 等人， Science, 259:988 (1993); Davidson 等人，Nat. Genet 3:219 (1993); Yang 等人，J. Virol. 69:2004 (1995))和腺相关病毒载体（参见 Kaplitt, M. G.等人，Nat. Genet. 8:148 (1994))。
[0080] 痘病毒载体将基因引入细胞胞质。禽痘病毒载体仅导致核酸的短期表达。腺病毒 载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒（HSV)载体对于将核酸引入神经细胞是优选的。腺 病毒载体（约2个月）导致与腺相关病毒（约4个月）相比更短期限的表达，所述腺相关 病毒又比HSV载体的表达期限更短。选择的具体载体将取决于靶细胞和被处理的条件。所 述引入可通过标准技术，例如感染、转染、转导或转化进行。基因转移的模式的实例包括例 如，裸DNA、CaPO 4沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂质转染法、细胞显微注射和 病毒载体。
[0081] 可使用载体以靶向基本上任何所需的靶细胞。例如，立体定位注射可用于将载体 (例如腺病毒，HSV)指引至所需位置。另外，颗粒可通过脑室内（icv)灌注使用微泵灌注 系统(例如SynchroMed灌注系统）递送。基于总体流动（bulk flow)的方法(被称为对流 (convection))也被证明在递送大分子至脑的扩展区域的情况下是有效的，并可在递送载 体至靶细胞中是有用的。（参见Bobo等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994); Morrison 等人，Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994))。可使用的其它方法包 括导管、静脉内、肠胃外、腹膜内和皮下注射，以及口服或其它已知的给予途径。
[0082] 这些载体可用于表达大量的抗体，其可以多种方式使用。例如，在样品中检测 PD-LI的存在。抗体也可用于尝试结合并干扰ro-Ll活性。
[0083] 可修改技术以制备对本发明的抗原蛋白特异的单链抗体（参见例如，美国专利号 4,946,778)。此外，可修改方法以构建F ab表达文库（参见例如，Huse等人，1989 Science 246: 1275-1281)，以允许快速和有效鉴定对蛋白或其衍生物、片段、类似物或同系物具有 所需特异性的单克隆Fab片段。含针对蛋白抗原的独特型的抗体片段可通过本领域已知的 技术制备，其包括但不限于：（i)通过胃蛋白酶消化抗体分子制备的F (ab，)2片段；（ii)通过 将F(ab，)2片段的二硫键还原产生的F ab片段；（iii)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分 子而产生的Fab片段和（iv) Fv片段。
[0084] 杂缀合物抗体也在本发明的范围内。杂缀合物抗体由两个共价连接的抗体组 成。这类抗体已例如被提议将免疫系统细胞靶向至不需要的细胞（参见美国专利号 4,676,980)和用于 HIV 感染的治疗（参见 TO 91/00360 ;TO 92/200373 ;EP 03089)。预期 所述抗体可使用合成蛋白化学中的已知方法(包括包含交联剂的那些）在体外制备。例如， 免疫毒素可使用二硫化物交换反应（disulfide exchange reaction)或通过形成硫醚键而 构建。针对此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇酯（iminothiolate)和甲基-4-巯基 丁酰亚胺酸酯和例如在美国专利号4, 676, 980中公开的那些。
[0085] 对于效应子功能，为了增强例如抗体在治疗癌症中的效果，修饰本发明的抗体可 能为合乎需要的。例如，可将半胱氨酸残基引入Fe区，由此允许在此区中链间二硫键的 形成。由此生成的同源二聚抗体可增强内化能力和/或增加补体-介导的细胞杀伤和抗 体-依赖性细胞的细胞毒性（ADCC)。（参见Caron等人，J. Exp Med.，176: 1191-1195 (1992)和 Shopes, J. Immunol·, 148: 2918-2922 (1992))。备选地，抗体可经工程改造 以具有双Fc区，并且可由此具有增强的补体裂解和ADCC能力。（参见Stevenson等人， Anti-Caner Drug Design(抗癌药物设计），3: 219-230 (1989))。
[0086] 本发明还涉及免疫缀合物，其包含与细胞毒性剂例如毒素（例如，细菌、真菌、植 物或动物源的酶活性毒素，或其片段）或放射性同位素（即，放射性缀合物）缀合的抗体。 [0087] 可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒 素 A链（来自铜绿假单胞菌（Aewi/offlmas aerwgifliosa))、菌麻毒素 A链、相思豆毒蛋白A 链、蒴莲根毒素 A链、α-八叠球菌（α-sarcin)、油桐（Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋 白、美国商陆蛋白（Phytolaca americana proteins) (PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜抑制因 子、泻果素、巴豆毒素、石碱草抑制因子、白树毒素、丝林霉素、局限曲霉素（restrictocin)、 酚霉素（phenomycin)、依诺霉素（neomycin)和单端孢霉烯族毒素类（tricothecenes)。多 种放射性核素对于制备放射性缀合抗体是可利用的。实例包括 212Bi、131I、131In、9°Y和186Re。
[0088] 抗体和细胞毒性剂的缀合物使用多种双功能蛋白-偶联剂例如N-琥珀酰亚胺 基-3-(2-吡啶基二硫醇）丙酸酯（STOP)、亚胺基硫代环戊烷（IT)、亚胺酯的双功能衍生 物（例如己二亚胺酸二甲酯盐酸盐）、活性酯（例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯）、醛（例如 戊二醛）、双叠氮化合物（例如双（对-叠氮苯甲酰）己二胺）、双-重氮衍生物（例如 双-(对-重氮苯甲酰）-乙二胺）、二异氰酸酯（例如甲苯基2, 6-二异氰酸酯）和双-活 性氟化合物（例如1，5-二氟代-2, 4-二硝基苯）制造。例如，蓖麻毒素免疫毒素可按在 Vitetta等人，Science 238: 1098 (1987)中描述而制备。碳-14-标记的1-异硫氰酰基 苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸（MX-DTPA)是用于将放射核苷酸缀合至抗体的范例性的螯 合剂。（参见 W094/11026)。
[0089] 本领域的普通技术人员将认识到，种类繁多的可能的部分可偶联至所得抗体或本 发明的其它分子。（参见，例如，〃Conjugate Vaccins〃，Contributions to Microbiology and Immunology ("缀合物疫苗"，对微生物和免疫学的贡献），J. M. Cruse和R. E. Lewis, Jr (编辑），Carger Press, New York, (1989),其全部内容通过引用并入本文）。
[0090] 偶联可通过任何化学反应实施，所述化学反应结合两个分子，只要抗体和其它部 分保持它们各自的活性。此连接可包括许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、插层、配 位结合和络合。然而，优选的结合是共价结合。共价结合可通过存在的侧链的直接缩合或 通过外部的桥接分子的掺入而完成。许多二价的或多价的连接剂在将蛋白分子(例如本 发明的抗体）偶联至其它分子中是有用的。例如，代表性的偶联剂可包括有机化合物例如 硫酯、碳二亚胺、琥拍酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醒、重氮苯和环己二胺（hexamethylene diamines)。该列表不意图为本领域已知多种种类的偶联剂的穷举，而是较常见的偶联剂 的范例。（参见 Killen 和 Lindstrom, Jour. Tmmun. 133:1335-2549 (1984) ;Jansen 等 人，Immunological Reviews 62:185-216 (1982);和 Vitetta 等人，Science 238:1098 (1987))。优选的连接物在以下文献中描述（参见，例如，Ramakrishnan, S.等人，Cancer Res. 44:201-208 (1984)，其描述MBS (Μ-马来亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯）的 使用）。还参见，美国专利号5, 030, 719,其描述通过寡肽连接物的方式偶联至抗体的卤 化乙酰基酰肼衍生物的使用。特别优选的连接物包括：（i) EDC (1-乙基-3-(3-二甲氨 基-丙基）碳二亚胺盐酸盐；（ii) SMPT (4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α -甲基-α - (2-吡 啶基二硫代）-甲苯（?丨61^6〇^111.(：〇.，〇3七（215586);(丨^)3?0?(琥珀酰亚胺基-6 [3-(2-批陡基二硫代）丙酰氨基]己酸酯（Pierce Chem. Co.，Cat #21651G) ;(iv)磺 基-LC-SPDP (磺基琥珀酰亚胺基6 [3-(2-吡啶基二硫代）-丙酰胺]己酸酯（Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G);和（V)缀合至EDC的磺基-NHS (N-羟基磺基-琥珀酰亚胺：Pierce Chem. Co.，Cat. #24510)。
[0091] 上面描述的连接物含有具有不同性质的组分，由此导致具有不同生理化学特性的 缀合物。例如，烷基羧酸酯的磺基-NHS酯与芳香羧酸酯的磺基-NHS酯相比为更稳定的。 含连接物的NHS-酯与磺基-NHS酯相比为更不可溶的。另外，连接物SMPT含空间阻碍性二 硫键并可形成具有增加的稳定性的缀合物。二硫键通常与其它键相比更不稳定，因为二硫 键在体外被裂解开，导致可获得较少的缀合物。磺基-NHS尤其可增强碳二亚胺偶联的稳定 性。碳二亚胺偶联（例如EDC)，当联合磺基-NHS使用时，比单独的碳二亚胺偶联反应，形成 对水解更有抗性的酯。
[0092] 本文公开的抗体还可配制为免疫脂质体。含抗体的脂质体通过本领域已知的方法 (例如在 Epstein 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985) ;Hwang 等人， Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980);和美国专利号 4, 485, 045 和 4, 544, 545 中描述）制备。具有增加的循环时间的脂质体在美国专利号5, 013, 556中公开。
[0093] 特别有用的脂质体可通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的 磷酯酰乙醇胺（PEG-PE)的脂质组合物生成。将脂质体挤压通过确定的孔径的滤器以产生 具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab'片段可如在Martin等人，J. Biol. Chem.， 257: 286-288 (1982)中描述通过二硫互换反应缀合至脂质体。
[0094] 抗PD-Ll的抗体的用涂 本发明的特异性结合ro-Li蛋白的抗体或其片段可被给予用于癌症或其它增殖性病 症的治疗。许多癌症过量表达ro-Li和ro-Li的增量调节与高风险预后因子相关。在肿瘤 细胞中ro-Li的过量表达也可指示肿瘤细胞逃避抗-肿瘤免疫的机制，例如通过诱导τ细 胞衰竭。这类癌症包括肾细胞癌和乳腺癌。其它范例性的癌症是与τ细胞衰竭相关或利用 τ细胞衰竭以逃避抗-肿瘤τ细胞活性的那些癌症。本发明抗体的使用可增强在响应用肿 瘤抗原肽刺激时肿瘤抗原-特异性τ细胞增殖和产生细胞因子的能力，由此提高τ细胞活 性或抗-肿瘤免疫应答。
[0095] 本发明的特异性结合ro-Li蛋白的抗体或其片段可被给予用于慢性感染的治疗。 这类慢性感染包括，例如，病毒感染、细菌感染和寄生虫感染。范例性的慢性病毒感染是 HIV。在慢性HIV感染期间，HIV-特异性⑶8+ T细胞功能上被损害，表现出产生细胞因子 和效应子分子的能力降低和增殖能力减弱。ro-Ι在HIV感染个体的HIV-特异性CD8+ T细 胞上高表达。本发明抗体的使用可增强在响应用HIV肽刺激时HIV-特异性T细胞增殖和 产生细胞因子的能力，由此提高T细胞活性或抗-病毒免疫应答。
[0096] 可将本发明的抗体(其包括双特异性、多克隆、单克隆、人源化和全人抗体）用作治 疗剂。这些药剂可通常用于在受试者中治疗或预防癌症，增加疫苗功效或提高天然免疫应 答。将抗体制剂(优选地对其靶抗原具有高特异性和高亲和力的抗体制剂)给予受试者并且 通常因其与靶标的结合而具有效果。抗体的给予可消除或抑制或干扰ro-Li蛋白的活性。
[0097] 本发明的抗体能够诱导细胞死亡。细胞死亡通过直接或间接的机制诱导。例如， PD-Ll被huro-Ll抗体结合可导致补体依赖性细胞毒性（⑶C)。备选地，huPD-Ll抗体结合 ro-Li，并导致第二细胞类型的募集，其会杀伤TO-L14-表达的靶细胞。范例性的机制(依据 该机制huro-Li抗体通过第二细胞类型的募集介导细胞死亡）包括但不限于抗体-依赖性 细胞毒性（ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬（ADCP)。靶ro-Ll-表达的细胞类型包括肿瘤细胞 和T细胞，例如，活化的T细胞。
[0098] 本发明的特异性结合ro-Ll蛋白的抗体或其片段可以药物组合物的形式给予用 于癌症或慢性感染的治疗。涉及制备治疗组合物(其包含抗体）的原理和考虑，以及选择 组分的指南提供于例如 Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 第 19 版 (Alfonso R. Gennaro等人编著）Mack Pub. Co·, Easton, Pa.，1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends (药物吸收促进： 概念、可能性、限制和趋势），Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa.，1994;和 Peptide And protein Drug Delivery (肤和蛋白药物递送）（Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4)，1991，M. Dekker，New York 中。
[0099] 本发明抗体的治疗上有效的量通常涉及实现治疗目标所需的量。如上指出，这可 以是抗体和它的靶抗原之间的结合相互作用，在某些情况下，这干扰靶的机能。此外，给予 所需量取决于抗体对它的特异性抗原的结合亲和力，并也取决于给予的抗体从给予了该抗 体的自由体积的其它受试者中耗尽的速率。本发明抗体或抗体片段的治疗上有效的剂量给 药的常用范围（以非限制实例的方式）可为约0.1 mg/kg体重-约50 mg/kg体重。常用给 药频率可在例如从每天两次至一周一次的范围内。
[0100] 在使用抗体片段的情况下，特异性结合至靶蛋白的结合结构域的最小的抑制性片 段是优选的。例如，基于抗体的可变区序列，可设计肽分子，其保持结合靶蛋白序列的能 力。这类肽可化学合成和/或通过重组DNA技术制备。（参见，例如,Marasco等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90: 7889-7893 (1993))。制剂还可根据治疗的特定适应症的需 要而含有超过一种活性化合物，优选相互间无不利影响的具有互补活性的那些。备选地