产量增加的植物及制备其的方法

专利名称：产量增加的植物及制备其的方法
技术领域：
本发明总体上涉及分子生物学领域，并且涉及相比对应的野生型植物而言增加植物产量的方法。更加具体而言，本发明涉及通过向植物引入编码细胞周期蛋白D3的核酸来增加产量的方法，其中所述编码细胞周期蛋白D3的核酸在优选于枝条中表达的启动子控制之下。本发明还涉及包含在优选于枝条中表达的启动子控制之下的经分离细胞周期蛋白D3核酸的植物，其中所述植物具有比相应的野生型植物增加的产量。本发明也涉及在本发明方法中使用的构建体。
不断增加的世界人口和逐渐减少的农业可用耕地迫使研究朝向提高农业的效率。传统的作物和园艺学改良方法利用选择育种技术来鉴定具有预期性状的植物。然而，此类选择育种技术有一些缺陷，即这些技术一般为劳动密集型的，而且产生的植物通常包含异质的遗传组分，当这些异质的遗传组分从亲本植物传递时不一定产生预期的性状。分子生物学的进展已经允许人类修饰动物和植物的种质。植物基因工程需要分离和操作遗传物质(一般以DNA或RNA的形式)以及随后将遗传物质引入植物。该技术具有传递具多种改良的经济、农业或园艺性状的作物或植物的能力。在经济上特别让人感兴趣的性状是产量。产量通常定义为作物可测量的经济价值产生。这可以以数量和/或质量的方式进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数量和大小、植物结构(例如，分枝的数量)、种子产量等等。根的发育、营养吸收和胁迫耐受性也是决定产量的重要因素。可以通过优化上述因素之一来增加作物产量，这可以通过修饰植物内在的生长机制来完成。
植物内在的生长机制在于高度有序的合起来称为“细胞周期”的事件。通过细胞周期前进对所有多细胞生物的生长和发育都是基本的，并且对细胞增殖是决定性的。细胞周期的主要组分在酵母、哺乳动物和植物中高度保守。细胞周期一般分为下列连续的时期G0G1SG2M。DNA复制或合成一般发生在S期(“S”指DNA合成)，而染色体的有丝分裂分离发生在M期(“M”指有丝分裂)，其间插入间期G1(DNA复制之前的细胞生长期)和G2(DNA扩增之后细胞准备分裂的时期)。细胞分裂在M期的最后步骤胞质分裂之后完成。离开细胞周期并变成静止的细胞称为处于G0期。这个时期的细胞可以受刺激而重新进入细胞周期的G1期。G1、G2和G0中的“G”代表“间期”。细胞周期进程的完成使得细胞分裂时的每个子细胞都接受完整拷贝的亲本基因组。
细胞分裂受两个主要的细胞周期事件控制，即DNA合成的起始和有丝分裂的起始。每个这些主要事件的每步转换受特定蛋白质复合体(参与DNA复制和分裂)代表的检验点(checkpoint)控制。在哺乳动物和植物细胞中，G1/S边界时DNA合成所需基因的表达受转录因子的E2F家族调节(La Thangue，1994；Muller等人，2001；De Veylder等人，2002)。进入细胞周期由整合信号并允许细胞周期基因转录激活的E2F/Rb复合体调节/触发。细胞周期不同时期之间的转换以及因此细胞周期的进行通过形成和激活不同异二聚体的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(通常称为依赖细胞周期蛋白的激酶(CDK)来驱动。这些激酶活性的前提是与特定的细胞周期蛋白物理结合，激活的时间主要取决于细胞周期蛋白的表达。细胞周期蛋白的结合诱导相结合CDK的N端圆形突出部的构象变化，并且促成复合体的定位和底物特异性。当单体的CDK结合细胞周期蛋白时，它们被激活，并因此具有激酶活性。细胞周期蛋白的蛋白质水平在细胞周期中起伏，并因此代表着决定CDK激活作用定时的主要因素。这些包含细胞周期蛋白和CDK的复合体在细胞周期中的周期性激活介导了细胞周期转换(检验点)的时序调节。
细胞周期蛋白可以分为有丝分裂的细胞周期蛋白(在高等真核生物中称为A型和B型细胞周期蛋白，而芽殖酵母中称为CLB)和G1特异的细胞周期蛋白(在哺乳动物中称为D型细胞周期蛋白，而在芽殖酵母中称为CLN)。H型细胞周期蛋白调节CAK(CDK激活性激酶)的活性。植物中已知的所有四种类型的细胞周期蛋白主要是通过与它们的人类对应物相似而得到鉴定。在拟南芥属(Arabidopsis)中，已经描述了十种A型、九种B型、十种D型和一种H型细胞周期蛋白(Vandepoele等人，2002)。
10种D型细胞周期蛋白分为7个亚类D1至D7，这反映它们彼此之间没有高度的序列相似性，这与A型和B型细胞周期蛋白相反。仅D3和D4亚类具有不同成员，分别为三个和两个。作为敲除单个D3型细胞周期蛋白却未能观察到突变表型的一种解释，先前已经提出了D3型细胞周期蛋白的冗余(Swaminathan等人，2000)。两个D3型细胞周期蛋白通过新近的片段重复来连接，这表明它们在功能上是冗余的。因为三个中的两个定位在重复结构中，所以相似假说可以用于D4细胞周期蛋白。
与A型和B型细胞周期蛋白相比较，D型细胞周期蛋白表现出来的更大的趋异性可能反映D型细胞周期蛋白在将发育信号和环境线索整合入细胞周期中的推定作用。例如，D3型细胞周期蛋白已经表现出应答植物激素例如细胞分裂素和油菜素类固醇，而CYCD2和CYCD4在G1初期激活，并应答糖有效性(综述见Stals和Inzé，2001)。
已经报道，CYCD2；1基因在烟草中过量表达增加细胞分裂并增加整体植株的生长速率而没有形态学变化(Cockcroft等人，2000)。
已经报道，在CaMV 35S启动子控制下的CYCD3；1基因在拟南芥属中过量表达使植物子叶扩大、植物终体积显著减小以及发育畸变。在细胞水平，细胞从G1期推挤出来，从而在分生组织区域和正常没有或有限细胞分裂的区域中都导致异常的细胞分裂。这种细胞数量的增加伴随着细胞大小的下降(Dewitte等人，2003)。
更加精确地影响植物细胞周期并因此更加精确地修饰植物多种生长特征的能力将在诸如作物增产、植物育种的领域中、在观赏植物的生产、树木管理、园艺学、林业、生物反应器(用于诸如药物、抗体、或疫苗的生物技术生产、或有机废物的生物转化)中使用的藻类的生产中以及其它此类领域中具有许多应用。
本发明的目的是克服在植物中表达细胞周期蛋白D3的现有技术中相关的一些问题。
现在已经发现，向植物中引入能在枝条中优先表达编码细胞周期蛋白D3的核酸的启动子控制下的编码细胞周期蛋白D3的核酸导致植物具有增加的产量。因此，根据本发明，提供了在植物中增加产量的方法，其包括向植物引入能在枝条中优先表达编码细胞周期蛋白D3的核酸的启动子控制下的编码细胞周期蛋白D3的核酸。
文中所述术语“增加的产量”用来表示任意一种或多种下列参数的增加(每个都相比对应的野生型植物而言)(i)植物一种或多种地上部分(可收获的)增加的生物量(重量)；(ii)增加的种子产量，这可来自于种子的生物量(种子重量)增加，并且其可以是每棵植株或单粒种子基础上的种子重量增加，并且种子重量的增加可来自于种子大小例如种子长度和/或种子宽度和/或种子面积改变；(iii)增加的(饱满)种子数量；(iv)增加的种子大小，这也可影响种子的成分；(iv)增加的种子体积，这也可影响种子的成分；(vi)增加的收获指数，其表达为可收获部分(例如种子)的产量与总生物量的比率；和(vii)增加的千粒核重量(TKW)，这通过计数饱满种子数量和它们的总重量外推得到。TKW增加可来自于种子大小和/或种子密度增加。
以谷物为例，产量增加可以显示为下列一种或多种情况每公顷或每英亩植物数量的增加、每棵植物谷穗数量的增加、行数、每行的果实数量、果实重量、千粒核重量、谷穗长度/直径等的增加。以稻为例，产量增加可以显示为下列一个或多个参数的增加每公顷或每英亩的植物数量、每棵植物的圆锥花序数量、每个圆锥花序的小穗数量、每个圆锥花序的花朵数量、种子填充率的增加、千粒核重量的增加等。产量的增加也可以导致改变的结构，或可以作为改变的结构的结果发生。
根据本发明的优选特征，使用本发明的方法导致植物具有增加的产量，其中所述的产量增加至少通过下列一种情况显示增加的地上面积、增加的种子总数、增加的(饱满)种子数量、增加的种子重量和增加的收获指数，每种情况都相对于相应的野生型植物而言。因此，根据本发明，提供了增加植物产量尤其是种子产量的方法，其中所述方法包括向植物引入能在枝条中优先表达编码细胞周期蛋白D3的核酸的启动子控制下的编码细胞周期蛋白D3的核酸。
无论植物(其中引入能在枝条中优先表达编码细胞周期蛋白D3的核酸的启动子控制下的编码细胞周期蛋白D3的核酸)在无胁迫条件下或者植物暴露于不同胁迫下，与对照植物相比，实施本发明的方法都使植物产量增加。一般而言，植物暴露于胁迫时应答为生长更加缓慢。在严重胁迫条件下，植物甚至会完全停止生长。另一方面，本文将温和胁迫定义为任何当植物暴露于该胁迫时不会导致植物完全停止生长的胁迫。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫处理)的进步，所以种植的作物植物通常不会遇到严重胁迫。结果，温和胁迫诱导的生长让步常常是农业不可预期的性状。温和胁迫是植物可能暴露于其中的一般胁迫(typical stress)。这些胁迫可能是植物暴露于其中的日常性生物或非生物(环境)胁迫。一般的非生物或环境胁迫包括由异常的热或冷/冷冻温度造成的温度胁迫、盐胁迫、水胁迫(干旱或过量的水)。非生物胁迫也可以由化学物质造成。生物胁迫一般为那些由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫造成的胁迫。
更加有利地，本发明的方法可以施用于任何植物。
本文所用术语“植物”包含整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)以及植物细胞、组织和器官，其中上述每个部分都优选地包含目的基因。术语“植物”也包含悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中每个上述部分都优选地包含目的基因。
在本发明方法中尤其有用的植物包括所有属于绿色植物(Viridiplantae)总科的植物，尤其是包括选自下列名单的饲料或饲料荚果、观赏植物、食品作物、树木或灌木的单子叶和双子叶植物，其中包括金合欢属(Acacia spp.)、槭树属(Acer spp.)、猕猴桃属(Actinidia spp.)、七叶树属(Aesculus spp.)、新西兰贝壳杉(Agathis australis)、Albiziaamara、三色桫椤(Alsophila tricolor)、须芒草属(Andropogon spp.)、落花生属(Arachis spp)、槟榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、黄芪(Astragalus cicer)、Baikiaea plurijuga、桦木属(Betula spp.)、芸苔属(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫铆(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱缨花属(Calliandra spp)、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属(Capsicum spp.)、决明属(Cassia spp.)、距瓣豆(Centroema pubescens)、木瓜属(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffeaarabica)、Colophospermum mopane、变异小冠花(Coronillia varia)、枸子(Cotoneaster serotina)、山楂属(Crataegus spp.)、香瓜属(Cucumisspp.)、柏木属(Cupressus spp.)、Cyathea dealbata、木梨(Cydoniaoblonga)、圆球柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅属(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、木梨(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大叶骨碎补(Davallia divaricata)、山马蝗属(Desmodium spp.)、迪卡兰(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、镰扁豆属(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、锥穗稗(Echinochloa pyramidalis)、Ehrartia spp.、穇子(Eleusine coracana)、Eragrestis spp.、刺桐属(Erythrina spp.)、桉属(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、金茅(Eulaliavillosa)、荞麦属(Fagopyrum spp.)、费约罗(Feijoa sellowiana)、草雷属(Fragaria spp.)、千斤拔属(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、银杏(Ginkgo biloba)、Glycine javanica、Gliricidiaspp、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦属(Grevillea spp.)、Guibourtiacoleosperma、岩黄芪属(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黄茅(Heteropogon contortus)、大麦(Hordeum vulgare)、Hyparrheniarufa、小连翅(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭蓝(Indigo incarnata)、鸢尾属(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子属(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、Leucaena leucocephala、Loudetiasimplex、Lotonus bainesii、百脉根属(Lotus spp.)、硬皮豆(Macrotylomaaxillare)、苹果属(Malus spp.)、Manihot esculenta、紫苜蓿(Medicagosativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉(Musa sapientum)、烟草属(Nicotianum spp.)、驴食草属(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、稻属(Oryza spp.)、非洲双翼豆(Peltophorum africanum)、狼尾草属(Pennisetum spp.)、鳄梨(Persea gratissima)、碧冬茄属(Petunia spp.)、菜豆属(Phaseolus spp.)、槟榔竹(Phoenix canariensis)、Phormiumcookianum、石楠属(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松属(Pinusspp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、杨属(Populus spp.)、牧豆树(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobiumstellatum、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、Rhaphiolepsisumbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhus natalensis、欧洲醋粟(Ribes grossularia)、茶藨子属(Ribes spp.)、洋槐(Robiniapseudoacacia)、蔷薇属(Rosa spp.)、悬钩子属(Rubus spp.)、柳属(Salixspp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属(Spinacia spp.)、Sporobolusfimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫芦茶属(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黄背草(Themedatriandra)、车轴草属(Trifolium spp.)、小麦属(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越桔属(Vaccinium spp.)、野豌豆属(Viciaspp.)、葡萄(Vitis vinifera)、锥穗沃森花(Watsonia pyramidata)、马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、玉米(Zea mays)、苋属(amaranth)、菊芋(artichoke)、天门冬属(asparagus)、青花椰菜(broccoli)、孢子甘蓝(Brussels sprouts)、甘蓝、卡诺拉油菜(canola)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝(collard greens)、亚麻、球茎甘蓝(kale)、兵豆属(lentil)、油菜籽(oilseed rape)、秋葵(okra)、洋葱、马铃薯、水稻、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、西红柿、南瓜(squash)、茶和藻类等。根据本发明优选的实施方案，植物为诸如大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜籽、棉花、西红柿、马铃薯或烟草的作物植物。进一步优选地，植物为单子叶植物，例如甘蔗。更加优选地，植物是谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、小米、黑麦属、燕麦属或高粱属。
细胞周期蛋白D3可以使用不同方法鉴定。例如，可以在翻译的拟南芥属核酸数据库中比对(blast)(例如缺口开始罚分(the gap openingpenalty)和缺口延伸罚分(the gap extension penalty)使用比对默认参数)查询的蛋白质序列。在查询序列为细胞周期蛋白D3的情况下，比对结果中第一个命中的是拟南芥属细胞周期蛋白D3。另一种鉴定细胞周期蛋白D3的方法是，通过使用例如Vector NTI套件(InforMax，Bethesda，MD)中的AlignX程序将查询序列与已知的细胞周期蛋白D3的蛋白质序列进行比对。然后用缺口开始罚分10和缺口延伸罚分0.01执行多重比对。为了更好地定位一些保守区域，也需要进行小的手工编辑。如果查询序列是细胞周期蛋白D3，那么其将与已知的细胞周期蛋白D3序列比对。
本文所用术语“细胞周期蛋白D3”指的是用于构建细胞周期蛋白或细胞周期蛋白D的系统树(例如

图1所示的系统树)时归入包括细胞周期蛋白D3s(而非其它D型细胞周期蛋白，例如细胞周期蛋白D1、D2、D4、D5、D6和D7)的任何氨基酸序列。文中谈及编码细胞周期蛋白D3的核酸是指编码上文定义的细胞周期蛋白D3氨基酸的核酸。
本领域技术人员可以使用制作此类系统树的已知技术和软件(例如GCG、EBI或CLUSTAL软件包)采用默认参数轻易地确定任何讨论的氨基酸序列是否属于上述定义。基于此类系统树的构建，认为聚类在细胞周期蛋白D3组中的序列属于“细胞周期蛋白D3”的定义。编码此类序列的核酸将在本发明方法的使用中有用。
细胞周期蛋白D3一般具有结合和激活植物CDK以及Rb的能力。此外，细胞周期蛋白D3可以包含一种或多种并优选所有下列序列(i)细胞周期蛋白盒；(ii)位于大约前40个氨基酸之内的LxCxE基序(大多数细胞周期蛋白D的特征)；以及(iii)图2所示的盒标识的一种或多种并优选所有的保守区域(如图2所示，允许盒内一个错配)。
下文表1给出了编码归入上述细胞周期蛋白D3定义的细胞周期蛋白D3的核酸实例。表中显示的编码细胞周期蛋白D3的核酸在实施本发明的方法中有用，其中所述本发明的方法即通过引入并表达任意一种这些能在枝条中优选表达该核酸的启动子控制之下的核酸来获得具有相对于对应的野生型植物产量增加的植物。如后文所述，编码细胞周期蛋白D3的核酸优选SEQ ID NO1表示的核酸或者是SEQ ID NO1的功能变体。
表1编码细胞周期蛋白D3的核酸实例根据本发明，希望在枝条中增强或增加细胞周期蛋白D3核酸的表达。本领域详细记录了获得增强或增加的基因或基因产物表达的方法，而且所述方法包括例如启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。
编码细胞周期蛋白D3的核酸与能在枝条中优先表达该核酸的启动子有效相连。该启动子的实例是具有可与β-扩展蛋白启动子相当的表达特性的启动子。应当清楚地是，本发明的适用范围既不限制于SEQ ID NO1代表的细胞周期蛋白D3，也不限制于在本发明方法中使用β-扩展蛋白启动子。
编码细胞周期蛋白D3的核酸可以得自任意来源。编码细胞周期蛋白D3的核酸/基因可以从微生物来源例如、酵母或真菌、或从植物、藻类或动物(包括人类)来源分离。这个核酸可以通过精心设计的人工处理来修饰其在组合物和/或基因组环境中的天然形式。核酸优选同源的核酸，即从植物(无论是从它将被引入的相同物种，或者从不同植物物种)获得的核酸。核酸可以从双子叶物种中分离，优选从芸苔科(Brassicaceae)中分离、更加优选从拟南芥中分离。更加优选地，从拟南芥中分离的细胞周期蛋白D3是D3型细胞周期蛋白，例如细胞周期蛋白D3；1、细胞周期蛋白D3；2或细胞周期蛋白D3；3。最优选地，细胞周期蛋白D3是来自拟南芥的细胞周期蛋白D3；3，尤其是SEQ ID NO1代表的核酸序列和SEQ ID NO2代表的氨基酸序列。
SEQ ID NO1代表的序列描述了来自拟南芥的细胞周期蛋白D3；3，而SEQ ID NO2为相应的氨基酸序列。有利地，本发明的适用范围不限制于使用SEQ ID NO1代表的来自拟南芥属的细胞周期蛋白D3；3。本发明的方法也可以使用编码细胞周期蛋白D3的核酸的功能性变体或使用所编码多肽的功能性变体来实行。在本发明的方法中尤其有用的是SEQ IDNO1代表的核酸的功能性变体或SEQ ID NO2代表的氨基酸的功能性变体。
本文所用术语“功能性变体”为保持结合及激活植物CDK能力的细胞周期蛋白D3(例如见Healy等人(2001，J.Biol.Chem.276(10)7041-7047))。在大多数情况下，功能性变体也补偿CLN(酵母中D型细胞周期蛋白的术语)缺陷的酵母突变体，见例如Swaminathan等人(2000，PlantPhys 1241658-1667)，尤其是1663页。功能性变体是如下意义的细胞周期蛋白D3，即当用于构建细胞周期蛋白或细胞周期蛋白D系统树(例如图1描述的系统树)时，归入包括细胞周期蛋白D3(而非其它D型细胞周期蛋白，例如细胞周期蛋白D1、D2、D4、D5、D6和D7)的氨基酸序列。本文谈及编码细胞周期蛋白D3的核酸是指编码上文定义的细胞周期蛋白D3氨基酸的核酸。此外，功能性变体可以包含一种或多种并优选地所有下列特征(i)细胞周期蛋白盒；(ii)位于大约前40个氨基酸之内的LxCxE基序(大多数细胞周期蛋白D的特征)；以及(iii)图2所示的盒标识的一种或多种并优选所有的保守区域(如图2所示，允许盒内一个错配)。此外，本领域技术人员也可以轻易地通过简单地用待检验功能的变体代替下文实施例部分描述的序列来确定特定细胞周期蛋白D3是否为功能性变体(根据其是否能够增加植物产量)。
在实施本发明方法中有用的合适功能性变体核酸及氨基酸序列包括(i)编码细胞周期蛋白D3的核酸的部分，优选SEQ ID NO1的序列代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸的部分；(ii)编码细胞周期蛋白D3的核酸的备选剪接变体，优选SEQ ID NO1的序列代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸的备选剪接变体；(iii)编码细胞周期蛋白D3的核酸的等位变体，优选SEQ ID NO1的序列代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸的等位变体；以及细胞周期蛋白D3氨基酸序列的同源物、衍生物和活性片段，其中优选SEQID NO2的序列代表的细胞周期蛋白D3。
对本领域技术人员显而易见，使用全长的编码细胞周期蛋白D3的DNA序列并非执行本发明方法的先决条件。本发明方法可以有利地使用编码细胞周期蛋白D3的DNA/核酸的功能性部分、尤其是SEQ ID NO1代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸的功能性部分来实行。部分指的是由原始的(更大的)DNA分子衍生或制备的一段DNA。部分可以进行制备，例如通过使用本领域众所周知的技术例如通过在例如SEQ ID NO1的核酸序列中制造一个或多个删除来制备。
因此，根据本发明，提供了增加植物产量的方法，其包括向植物引入SEQ ID NO1代表的核酸的功能性部分，而其中所述功能性部分于能在枝条中优选表达所述功能性部分的启动子控制之下。
另一在本发明方法中有用的功能性变体是编码细胞周期蛋白D3的核酸的备选剪接变体，尤其是SEQ ID NO1的序列代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸的备选剪接变体。本文所用术语“备选剪接变体”包含其中所选的内含子和/或外显子已经被删除、替代或添加的核酸序列变体。此类变体是其中蛋白质的生物学活性保持不受影响的变体，这可以通过选择性地保持蛋白质的功能性片段来实现。此类剪接变体可以在自然中找到或者可以是人造的。制备此类剪接变体的方法在本领域众所周知。
因此，本发明也提供了增加植物产物的方法，其中包括向植物引入编码细胞周期蛋白D3的核酸的备选剪接变体，尤其是SEQ ID NO1代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸的备选剪接变体，而其中所述备选剪接变体于能在枝条中优选表达该剪接变体的启动子控制之下。
另一在本发明的方法中有用的变体为编码细胞周期蛋白D3的核酸的等位变体，尤其是SEQ ID NO1的序列代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸的等位变体。等位变体天然存在，而且包含在本发明方法中的是使用这些天然的等位基因。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)以及小插入/删除多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL形成了大多数生物天然存在的多态性株系中最大的序列变体集。
因此，本发明也提供了增加植物产物的方法，其中包括向植物引入编码细胞周期蛋白D3的核酸的等位变体，尤其是SEQ ID NO1代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸的等位变体，其中所述等位变体于能在枝条中优选表达该剪接变体的启动子控制之下。
更有利地，根据本发明的方法也可以使用细胞周期蛋白D3的同源物、衍生物或活性片段来实行，优选使用SEQ ID NO2代表的细胞周期蛋白D3的同源物、衍生物或活性片段。编码SEQ ID NO2代表的氨基酸的同源物、衍生物或活性片段的核酸可以轻易地通过本领域技术人员众所周知的常规技术来确定。
蛋白质的“同源物”包含相对所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸替换、删除和/或插入、但具有与它们所衍生自的未修饰蛋白质类似的生物学和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。要产生此类同源物，蛋白质的氨基酸可以用其它具有相似性质(例如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或断裂α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的氨基酸代替。保守替换表为本领域众所周知(例如见Creighton(1984) Proteins.W.H.Freemanand Company)。
在本发明方法中有用的同源物为那些归入功能性变体定义的同源物，即具有结合及激活植物CDK的能力并且是上文定义的细胞周期蛋白D3的同源物。此外，同源物可以表征为具有优选至少与SEQ ID NO2代表的氨基酸序列有30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的增加的序列同一性(见图3，其显示细胞周期蛋白D3彼此之间具有低百分数的同一性，但是尽管如此，与SEQ IDNO230％的同一性足以鉴定其它细胞周期蛋白D3)。此外，同源物可以包含一种或多种并且优选所有下列序列(i)细胞周期蛋白盒；(ii)位于大约前40个氨基酸之内的LxCxE基序(大多数细胞周期蛋白D的特征)；以及(iii)图2所示的盒标识的一种或多种并优选所有的保守区域(如图2所示，允许盒内一个错配)。
术语“同源物”还包含两种特殊形式的同源物，其中包括涉及用来描述基因祖先关系的进化概念的种间类似序列和种内类似序列。术语“种内类似的”涉及物种基因组中导致种内类似基因的基因重复。术语“种间类似的”涉及不同生物中由于祖先关系的同源基因。
在例如单子叶植物物种中的种间类似物可以轻易地通过进行所谓的相互匹配搜索(reciprocal blast search)找到。这可以通过第一次匹配完成，其中涉及在任意序列数据库(例如对公众开放的NCBI数据库，这可以在http//www.ncbi.nlm.nih.gov.上找到)中匹配正在讨论的序列(例如SEQ IDNO1或SEQ ID NO2)。如果在稻中搜索种间类似物时，那么就可以用在例如NCBI上可获得的水稻日本晴(Oryza sativa Nipponbare)的28,469个全长cDNA克隆中匹配正在讨论的序列。当从核苷酸开始时，可以使用BLASTn，或者当从蛋白质开始时使用TBLASTX，其中使用标准的默认值(期望10，排列50)。匹配结果可以进行过滤。然后将已过滤结果或未过滤结果的全长序列对正在讨论的序列(SEQ ID NO1或2)进行反向匹配(第二次匹配)。最后比较第一次和第二次匹配的结果。在大家族的情况下，使用ClustalW，然后通过临近连接树来帮助形象化聚类。
同源物可以是蛋白质的“替换变体”形式，即氨基酸序列中至少有一个残基被移去，而在其位置插入了不同残基。氨基酸替换一般为单残基，但也可以是成群的，这取决于多肽的功能性约束因素(functionalconstraints)；插入通常为大约1-10个氨基酸残基的数量，而删除在大约1-20个残基的范围。优选地，氨基酸替换包含保守性氨基酸替换。
同源物也可以是蛋白质的“插入变体”形式，即在蛋白质的预定位点引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包含单个或多个氨基酸的氨基末端融合和/或羧基末端融合以及序列内的插入。一般而言，氨基酸序列内的插入比氨基末端或羧基末端融合小，数量大约为1-10个残基。氨基或羧基末端融合蛋白质或肽的实例包括酵母双杂交系统中使用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外被蛋白、6×(组氨酸)标记、谷胱甘肽S-转移酶标记、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、表位100标记、c-myc表位、FLAG-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
蛋白质“删除变体”形式的同源物表征为从蛋白质移去一个或多个氨基酸。
蛋白质的氨基酸变体可以轻易地使用本领域众所周知的肽合成技术(例如固相肽合成法等)或通过重组DNA操作来制备。操作DNA序列以产生蛋白质的替换、插入或删除变体的方法在本领域众所周知。例如，在DNA的预定位点制备替换突变的技术为本领域技术人员众所周知，并且其包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的定点诱变或其它定点诱变方法。
“衍生物”包括与天然存在形式的蛋白质例如SEQ ID NO2代表的蛋白质的氨基酸相比包含天然及非天然存在氨基酸残基的替换、删除或添加的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。蛋白质的“衍生物”包含与天然存在形式的多肽的氨基酸序列相比包括天然发生改变的、糖基化的、酰基化的或非天然存在的氨基酸残基的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。与衍生物衍生自的氨基酸序列相比，衍生物也可以包含一个或多个非氨基酸替换物，例如与氨基酸序列共价或非共价结合的报道分子或其它配基、以及相比天然存在的蛋白质为非天然存在的氨基酸残基，例如结合以促进其检测的报道分子。
细胞周期蛋白D3蛋白质的“活性片段”包含蛋白质的至少五个连续氨基酸残基，其中残基保持与天然存在的蛋白质相似的生物学和/或功能性活性。任何情况下，“同源物、衍生物和活性片段”为那些落入上述“功能性变体”定义的同源物、衍生物和活性片段。
搜索和鉴定细胞周期蛋白D3同源物的方法完全在本领域技术人员的范围之内。用于比较的序列比对方法为本领域众所周知，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、ALIGN X(来自载体NTI)和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48443-453，1970)来寻找两个全序列最大化匹配数目而最小化缺口数目的比对。BLAST算法计算两个序列之间的百分数序列同一性，并进行相似性的统计分析。进行BLAST分析的软件通过国际生物技术中心(National Centre forBiotechnology Information)对公众开放。适合在本发明的方法中使用的同源物，即那些具有与SEQ ID NO2代表的氨基酸序列至少30％序列同一性的同源物，可以通过取得全长的细胞周期蛋白D3蛋白质序列并使用相似性/同一性矩阵发生器例如MatGAT(矩阵总体比对工具)来鉴定，其中所述相似性/同一性矩阵发生器计算所给数据集每对序列之间的相似性和同一性，而不需要进行数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(缺口开始罚分为12，而缺口延伸罚分为2)进行一系列的配对比对。然后使用例如Blosum60作为算分矩阵来计算相似性和同一性，最后将结果置于距离矩阵中。
因此，本发明也提供了包括向植物引入编码细胞周期蛋白D3的同源物、衍生物或活性片段例如SEQ ID NO2代表的细胞周期蛋白D3的同源物、衍生物或活性片段的核酸来增加植物产量的方法，其中所述同源物、衍生物或活性片段于能在枝条中优选表达该核酸的启动子控制之下。
本发明也提供了促进本发明方法中使用的核苷酸序列引入和/或表达的基因构建体和载体。
因此，提供的基因构建体包含(i)编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体、优选SEQ ID NO1代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体(如上文定义)，其中所述核酸编码细胞周期蛋白D3多肽或其功能性变体、优选编码SEQ IDNO2代表的细胞周期蛋白D3多肽或其功能性变体；(ii)能在枝条尤其是营养性(地上)枝条的细胞膨胀带(cell expansionzone)中优选表达(i)的核酸的启动子；和任选地(iii)转录终止序列。
本发明方法中使用的构建体可以使用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术构建。基因构建体可以插入适合转化入植物并且适合在转化的细胞中表达目的基因的载体中，所述载体可以是商品化载体。
用包含目的序列(即编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体(如上文定义)，例如SEQ ID NO1代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体(如上文定义))的载体转化植物。目的序列与能在枝条优选表达目的序列的启动子有效连接。术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在本文都可以相互交换使用，并且用来表示更广泛的含义，指能够影响与它们连接的序列表达的调控性核酸序列。上述术语包含衍生自经典真核基因组基因的转录调节序列(包括精确转录起始所需的TATA盒，包括或不包括CCAAT盒序列)和额外的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，其中所述调控元件改变基因在响应发育和/或外界刺激或组织特异方式中的表达。术语还包含经典原核基因的转录调控序列，此时其可包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”还包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。本文所用术语“有效连接的”指启动子序列和目的基因之间的功能性连接，如此来使启动子序列能够起始目的基因的转录。
编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体例如SEQ ID NO1代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体与能在枝条中优选表达该核酸的启动子有效相连。优选地，能在枝条中优选表达该核酸的启动子具有与β-扩展蛋白启动子相当的表达谱，例如图5所示。本领域技术人员可以使用常规技术轻易地鉴定出具有与β-扩展蛋白启动子相当表达谱的启动子。更加具体而言，能在枝条中优选表达该核酸的启动子为能在枝条、尤其是营养性(地上)枝条的细胞膨胀带中驱动表达的启动子。最优选地，能在枝条中优选表达该核酸的启动子为β-扩展蛋白启动子(SEQ ID NO3)。
任选地，也可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。术语“终止子”包含调控序列，其为转录单位末端标志的3’加工、初级转录物多聚腺苷化和转录终止的DNA序列。额外的调控元件可以包括转录以及翻译增强子。本领域技术人员知道适合在实施本发明中使用的终止子和增强子序列。此类序列为本领域技术人员所知或者能够轻易获得。
本发明的基因构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制序列起始点。实例之一是，当需要基因构建体作为附加型基因元件(例如质粒或黏粒分子)维持在细菌细胞中时。优选的复制起点包括但不局限于复制起始点f1和colE1。
基因构建体可以任选地包含选择性标记基因。如本文所用，术语“选择性标记基因”包括任何赋予细胞表型的基因，其中它的表达促进已用目的核酸构建体转染或转化的细胞的鉴定和/或筛选。适当标记可以选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的代谢性状或允许视觉筛选。选择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的npt II，或磷酸化潮霉素的hpt)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar；或提供草甘膦抗性的aroA或gox)、或者提供代谢性状的基因(例如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA)。视觉标记基因导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)、发光(例如萤光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。
本发明也包括通过本发明方法可以获得的植物。因此本发明提供了通过本发明方法可以获得的植物，其中所述植物包含与能在枝条中优选表达该核酸的启动子有效连接的编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体。
本发明也提供了生产具有增加产量的转基因植物的方法，其中包括向植物引入和表达编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体，尤其是SEQID NO1代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体(如上文定义)，其中所述核酸与在枝条中优选表达该核酸的启动子有效连接。
更加具体而言，本发明提供了生产相比对应的野生型植物具有增加产量的转基因植物的方法，其中所述方法包括(i)向植物或植物细胞引入编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体，优选SEQ ID NO1代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体，其中所述核酸或其功能性变体编码细胞周期蛋白D3多肽或其功能性变体，其中所述多肽优选SEQ ID NO2为代表、或者是其功能性变体，并且所述核酸或其功能性变体于能在枝条尤其是营养(地上)枝条的细胞膨胀带中优选表达该核酸的启动子控制之下；(ii)在促进再生和成熟植物生长的条件下培养植物细胞。
核酸或功能性变体可直接引入植物细胞或植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其它部分)。根据本发明优选的特性，核酸优选通过转化引入植物。
术语“引入植物”主要指用正在讨论的特定核酸(编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体)转化植物，然而该术语也指其它导致正在讨论的特定核酸引入植物的方法，例如育种技术。育种技术为本领域技术人员熟知。
本文所指术语“转化”包含外源多核苷酸向宿主细胞内的转移，不论用来转移的方法为何种方法。能够随后克隆繁殖的植物组织(不论通过器官发生还是通过胚胎发生)都可以用本发明的基因构建体来转化，并由其再生出整棵植物。特定组织的选择由于对所转化的特定物种有效并且最适合的克隆繁殖系统而不尽相同。示例性的组织靶点包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、呈现分生组织的组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱发性分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞，并且可以维持非整合的，例如作为质粒。备选地，它可以整合入宿主基因组。然后，所得的转化的植物细胞可以用来以本领域技术人员已知的方式再生植物。
现在，植物物种的转化是非常常规的技术。有利地，几种转化方法中的任意一种都可以用来将目的基因引入适当的祖细胞。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄入的化学物质、直接将DNA注射入植物、基因枪轰击、使用病毒或花粉的转化以及显微注射。方法可以选自制备原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等人，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等人，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)、原生质体的电穿孔(Shillito R.D.等人，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)、显微注射入植物材料(Crossway A.等人，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)、DNA或RNA包被的粒子轰击(Klein T.M.等人，1987，Nature 327，70)、用病毒感染(非整合型)等。表达编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体的转基因水稻植物优选地通过农杆菌介导的转化、使用水稻转化众所周知的方法来生产，例如任意一篇下列文章描述的方法公开的欧洲专利申请EP1198985 A1、Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(Plant J.6(2)271-282，1994)，其中所述公开在此处以其整体引入作为参考。在谷物转化的情况下，优选的方法为如Ishida等人(Nat.Biotechnol.1996 Jun；14(6)745-50)或Frame等人(Plant Physiol.2002 May；129(1)13-22)所述，其中所述公开在此处以其整体引入作为参考。
一般在转化之后，对植物细胞或细胞群筛选一种或多种标记的存在，其中所述标记由与目的基因共转移的植物可表达的基因编码，然后将转化的材料再生成为整个植物。
DNA转移和再生之后，推定转化的植物可以估测(例如使用Southern分析)目的基因的存在、拷贝数和/或基因组组织。备选地或额外地，新引入DNA的表达水平可以使用Northern和/或Western分析来监测，这两种技术都为本领域普通技术人员熟知。
产生的经转化植物可以通过多种方式繁殖，例如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可以自交来产生纯合的第二代(T2)转化体，然后T2代植物通过经典的育种技术进一步繁殖。
产生的转化生物可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和未转化细胞的嵌合体、无性系转化体(例如所有转化为包含表达盒的细胞)、转化和未转化组织的嫁接物(例如，在植物中，将经转化的根状茎嫁接于未转化的接穗)。
根据本发明的方法也可以不向植物引入编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体来实行。这可以通过优选在编码细胞周期蛋白D3的基因的基因座中引入基因修饰来实现，如此以便允许在枝条中优选表达该基因。本文定义的基因的基因座用来表示基因组区域，其包括目的基因和编码区域上游或下游的10KB。
遗传修饰可以例如通过任意一种(或多种)下列方法来引入T-DNA激活、TILLING、诱变、同源重组或者如上文详述通过在植物(细胞)中引入和表达编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体，该核酸于能在枝条中优选表达该核酸的启动子控制之下。
T-DNA激活标记(Hayashi等人，Science (1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因组区域或基因编码区域上游或下游10KB中插入通常包含启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA，如此构型以便启动子指引靶基因表达。一般地，破坏靶基因的天然启动子对其表达的调节，并将基因置于新引入的启动子的控制。启动子一般插入在T-DNA中。这个T-DNA例如通过农杆菌(Agrobacterium)感染随机插入植物基因组，并导致插入T-DNA附近的基因过量表达。所得转基因植物显示由于临近所引入启动子的基因过量表达造成的显性表型。为了实现产量增加，待引入的启动子可以是任意能在枝条中优选表达的启动子。
遗传修饰也可以使用TILLING(Targeted Induced Local Lesions INGenomes，靶向诱导基因组局部损害)技术引入编码细胞周期蛋白D3的核酸/基因的基因座中。这是在产生和/或鉴定、并最终分离能够呈现细胞周期蛋白D3生物活性的编码细胞周期蛋白D3的核酸的诱变变体中有用的诱变技术。TILLING也允许筛选携带此类突变变体的植物。这些突变变体甚至可以呈现比其天然形式的基因呈现的细胞周期蛋白D3活性更高的细胞周期蛋白D3活性。TILLNG组合了高密度诱变和高通量筛选方法。TILLNG中一般遵循的步骤是(a)EMS诱变(Redei和Koncz，1992；Feldmann等人，1994；Lightner和Caspar，1998)；(b)DNA制备和混合个体；(c)PCR扩增目的区域；(d)变性和退火以便形成异源双链体；(e)DHPLC，其中混合物中异源双链体的存在检测为色谱图中额外的峰；(f)鉴定突变个体；以及(g)测序突变体的PCR产物。TILLING法为本领域众所周知(McCallumNat Biotechnol.2000 ADr；18(4)455-7，Stemple 2004(TILLING-ahigh-throughput harvest for functional genomics.Nat Rev Genet.2004Feb；5(2)145-50)综述)。
诱变可以用来产生编码细胞周期蛋白D3的核酸的变体。产生突变变体的方法为本领域众所周知。
TDNA激活、TILLING和定点诱变是能够产生新型等位基因和细胞周期蛋白D3变体的技术的实例。
同源重组允许在基因组确定的选择位置引入所选核酸。同源重组是在生物科学中常规地用于低等生物例如酵母或藓类植物立碗藓(physcomitrella)的标准技术。在植物中进行同源重组的方法已经不仅在模型植物(Offringa等人，Extrachromosomal homologous recombinationand gene targeting in plant cells after Agrobacterium-mediatedtransformation.1990 EMBO J.1990 Oct；9(10)3077-84)中得到描述，也在作物植物例如稻(Terada R，Urawa H，Inagaki Y，Tsugane K，Iida S.Efficient gene targeting by homologous recombination in rice.NatBiotechnol.2002.Iida和TeradaA tale of two integrations，transgene andT-DNAgene targeting by homologous recombination in rice. Curr OpinBiotechnol.2004 Apr；15(2)132-8)中得到描述。待靶向的核酸(可以是编码细胞周期蛋白D3的核酸或如上文定义的其变体)不必靶向编码细胞周期蛋白D3的基因的基因座，而是可以引入到例如高表达的区域。待靶向的核酸可以是改良的用来替代内源基因的等位基因，或者可以除了内源基因以外额外地引入。
本发明清楚地延及通过本文所述的任意方法产生的任意植物细胞或植物，并且涉及其所有植物部分和繁殖体。本发明进一步延及包含通过任意上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器官或整个植物的后代，其中唯一的要求是后代呈现与那些通过根据本发明的方法在亲本中产生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。本发明还包括包含分离的编码细胞周期蛋白D3的核酸分子的宿主细胞，其中所述核酸分子与能在枝条中表达该核酸的启动子有效相连。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。本发明也延及植物的可收获部分，例如但不局限于种子、叶、果实、花、茎培养物、根状茎、块茎和鳞茎。
本发明也包含编码细胞周期蛋白D3的核酸的用途以及细胞周期蛋白D3多肽的用途。
这样的一种用途当然涉及编码细胞周期蛋白D3的核酸在增加植物产量、尤其是在增加地上面积、增加种子总数、增加(饱满)种子数量、增加种子重量以及增加收获指数等的用途，其中所述核酸与能在枝条中优选表达该核酸的启动子有效连接。编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体如上文定义。优选SEQ ID NO1代表的核酸或其如上文定义的功能性变体。
编码细胞周期蛋白D3和细胞周期蛋白D3多肽的核酸也可以在育种程序中找到用途。细胞周期蛋白D3可以是SEQ ID NO1代表的核酸或其如上文定义的功能性变体；或者细胞周期蛋白D3可以是SEQ ID NO2代表的氨基酸或其如上文定义的功能性变体。例如，编码细胞周期蛋白D3的核酸或其部分可以在染色体(或其部分)上、优选和一个或多个相关家族成员在一起。在此育种程序的实例中，在植物中鉴定可能与编码细胞周期蛋白D3蛋白质的核酸遗传性连接的DNA标记，其中所述基因可以是编码细胞周期蛋白D3蛋白质自身的基因或任意其它可以直接或间接影响编码细胞周期蛋白D3蛋白质表达和/或细胞周期蛋白D3自身活性的基因。然后这个DNA标记可以在育种程序中用来选择相比对应的野生型植物具增加产量的植物。
细胞周期蛋白D3的等位变体也可以用于常规育种程序，例如标记辅助育种。此类育种程序有时需要通过诱变处理植物来向植物中引入等位变体。一种合适的诱变方法是EMS诱变。然后通过例如PCR来鉴定等位变体。接下来是筛选步骤，筛选正在讨论序列导致植物相比对应的野生型植物产量增加的优良等位变体。筛选一般通过监测包含正在讨论序列的不同等位变体例如SEQ ID NO1的不同等位变体的植物产量来实施。产量监测可以在温室或田地中完成。更多的任选步骤包括杂交植物，其中将鉴定出来的优良等位变体与另一植物杂交。这可以用来例如制备感兴趣的表型特征的组合。
编码细胞周期蛋白D3和细胞周期蛋白D3多肽的核酸也可以在其作为生长调节剂中找到用途。细胞周期蛋白D3可以是SEQ ID NO1代表的核酸或其如上文定义的功能性变体；或者细胞周期蛋白D3可以是SEQ IDNO2代表的氨基酸或其如上文定义的功能性变体。因为这些细胞周期蛋白D3在增加植物产量中有用，所以细胞周期蛋白D3也是有用的生长调节剂，例如除草剂或生长刺激剂。因此，本发明提供了用作生长调节剂的包含细胞周期蛋白D3、以及适当载体、稀释剂或赋形剂的组合物。
如上所述，根据本发明的方法导致植物具有增加的产量。这些有利性状也可以与其它有利的经济性状例如进一步的产量增强性状、多种胁迫的耐受性、修饰多种结构特征和/或生物学和/或生理学特征的性状组合。
附图描述现在本发明将参考下列图进行描述，其中图1为用ClustalW和默认值、然后通过平均距离树计算制备的多重比对。显示了细胞周期蛋白D3的聚类。
图2为已知的细胞周期蛋白D3蛋白质序列的比对。该序列使用VectorNTI套件(InforMax，Bethesda，MD)的AlignX程序进行比对。多重比对使用缺口开始罚分10和缺口延伸罚分0.01进行。在需要更好放置一些保守区域的地方也进行了较小的人工编辑。显示的线指示细胞周期蛋白D3与其它细胞周期蛋白D分离。一些细胞周期蛋白D3特异的基序用方框框住。
图3为用MatGAT(矩阵总体比对工具)制备的相似性/同一性，其中MatGAT计算所给数据集中每对序列之间的相似性和同一性，而不需要进行数据预比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(缺口开始罚分为12，而缺口延伸罚分为2)进行一系列配对比对。然后使用例如Blosum60作为算分矩阵来计算相似性和同一性，最后将结果置于距离矩阵中。序列相似性显示在分界线底部一半处，而序列同一性显示在分界线顶部一半处。SEQ ID NO2的序列在矩阵中指示为数字5。具有与SEQ ID NO2的序列至少30％序列同一性的序列包含细胞周期蛋白D3。
图4显示用来在稻(Oryza sativa)中表达β-扩展蛋白启动子控制下的拟南芥细胞周期蛋白D3；3基因的双元载体。
图5显示β-扩展蛋白启动子驱动的GUS表达的照片。“C植物”的照片是当稻植物达到大约5cm大小时GUS染色的照片。“B植物”的照片是当稻植物达到大约10cm大小时GUS染色的照片。具有相当表达谱的启动子也可用于本发明的方法中。
图6详述了用于进行根据本发明的方法中的序列的实例。
实施例现在本发明将参考下列实施例进行描述，其中所述实施例仅作为例证DNA操作除非另外说明，否则重组DNA技术按照(Sambrook(2001)分子克隆实验室手册，第3版，冷泉港实验室出版社，CSH，纽约)或Ausubel等人(1994)、Current Protocols in Molecular Biology、CurrentProtocols的卷1和2中描述的标准方案进行。植物分子操作的标准材料和方法在R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)(BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)发表)中进行了描述。
实施例1基因克隆拟南芥属细胞周期蛋白D3；3(国内索引CDS0018)使用拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增。在对从幼苗提取的RNA进行反转录之后，将cDNA克隆进入pCMV Sport6.0。库的平均插入片段大小为1.5kb，而最初克隆数为1.59×107集落生成单位(cfu)。在第一次6×1011cfu/ml的扩增之后，最初效价测定为9.6×105cfu/ml。提取质粒之后，在50μl PCR混合物中使用200ng用作模板。使用引物prm0360(正义、起始密码子黑体，AttB1位点斜体5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGCTTTAGAAGAGGAGGA 3’)和prm0361(反义、互补的，终止密码子黑体，AttB2位点斜体5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCGAGGACTACTATAAGCA 3’)进行PCR扩增，其中所述引物包括进行Gateway重组的AttB位点。PCR在标准条件下使用HifiTaq DNA聚合酶进行。也使用标准方法扩增1086bp的PCR片段并纯化。然后进行Gateway方法的第一个步骤BP反应，在此期间PCR片段在体内与pDONR201质粒重组，从而产生根据Gateway命名法的“进入”克隆p0443。质粒pDONR201作为Gateway技术的部分从Invitrogen购得。
实施例2载体构建随后进入克隆p0443用来与用于稻转化的目的载体p3169进行LR反应。这个载体在T-DNA边界中包含下列功能原件植物选择性标记、植物筛选性标记和用于LR与已在进入克隆中克隆了的目的序列体内重组的Gateway盒。用于在营养性(地上)枝条的膨胀带中表达的β-扩展蛋白启动子定位于Gateway盒上游。
LR重组步骤之后，将所得表达载体(见图4)转化入农杆菌菌株LBA4404，并随后转化入稻植物。让转化的稻植物生长，然后检测实施例3中描述的参数。
实施例3评估和结果产生了大约15-20颗独立的T0代稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室进行生长和T1代种子收获。维持5个T1后代分离出转基因3∶1存在/缺失比的事件。对于每一个这些事件，通过监测可见标记的表达筛选出大约10株包含转基因的T1代幼苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少转基因的T1代幼苗(失效合子)。最好的T1事件进一步在T2代中用与T1代相同的方法进行评估，但其中每个事件使用更多的个体。
统计分析t-检验和F-检验使用双因素ANOVA(变体分析)作为植物表型特征整体评价的统计模型。对从用本发明的基因转化的所有事件的所有植物中测量得到的所有参数进行F-检验。F-检验用来检验基因对所有转化事件的影响以及验证基因的整体效应(也称为总体基因效应)。真实总体基因效应的显著性阈值设置为F-检验5％的概率水准。显著的F-检验值指基因效果，其表示不仅仅是基因的存在或位置导致表型不同。
3.1营养生长测量将经选择的T1代植物(大约10株具转基因，而大约10株不具转基因)转移至温室。每棵植物接受独特的条码标签来将表型数据与相应植物明确地联系起来。经选择的T1代植物在10cm直径盆的土壤中在下列环境设置下生长(在土上)光周期＝11.5小时、日光强度＝30,000Lux或更多、白天温度＝28℃或更高、夜间温度＝22℃、相对湿度＝60-70％。转基因植物和相应的失效合子在随机位置相邻地生长。从播种阶段到成熟阶段，每棵植物数次经过数字成像机(digital imaging cabinet)成像。在每个时间点每棵植物至少从6个不同角度采取数字图像(2048×1536像素、1千6百万色彩(16 million colours))。下文所述参数使用图像分析软件以自动方式从所有植物的所有数字图像中衍生。
3.1.1地上植物面积植物地上面积通过计数排除背景后地上植物部分的像素总数测定。这个值为在同一时间点从不同角度拍摄的图像的平均数，并通过校准将其转化为以平方毫米表达的物理表面值。实验显示，这种方式测定的地上植物面积与植物地上部分的生物量相关。T1和T2的评测结果如下文表1所示。显示了转基因植物和对应失效合子之间的百分数差异。进行T1和T2评估的F检验p值都很显著，表明转基因的存在对地上面积具有总体效应。
表2地上面积
3.2种子相关参数测量收获成熟的初级圆锥花序、装袋、并贴上条码标签，然后在37℃烤箱中干燥三天。最后拍打圆锥花序，并收集和计数所有种子。使用鼓风装置将饱满外壳和空外壳分开。弃去空外壳，再次计数剩余部分。在分析天平上称重饱满外壳。这个过程产生下文描述的种子相关参数。
3.2.1种子总数通过计数从植物收获的外壳数目测定每棵植物的种子总数。下文表2显示T1和T2评估的结果。显示了转基因植物和对应失效合子之间的百分数差异。进行T1和T2评估的F检验p值都很显著，表明转基因的存在对产生的种子总数具有显著效应。
表3种子总数
3.2.2饱满种子数饱满种子数通过计数分离步骤后依然存在的饱满外壳数测定。T1和T2代评估的结果如下文表3所示。显示了转基因植物和对应失效合子之间的百分数差异。进行T1和T2评估的F检验p值都很显著，表明转基因的存在显著增加产生的饱满种子数。
表4饱满种子数
3.2.3种子总重量种子总产量通过称重从植物收获的饱满外壳测定。下文表4显示T1和T2评估的结果。显示了转基因植物和对应失效合子之间的百分数差异。进行T1和T2评估的F检验p值都很显著，表明转基因的存在显著增加种子重量。
表5种子总重量
3.2.4植物的收获指数本发明中收获指数定义为种子总产量和地上面积(mm2)的比率乘以因子106。下文表5显示T1和T2评估的结果。显示了转基因植物和对应失效合子之间的百分数差异。进行T1和T2评估的F检验p值都很显著，表明转基因的存在显著增加收获指数。
表6收获指数
实施例4p油质蛋白∷cyclin D3；3的比较数据使用与上述制备和评估pβ-扩展蛋白∷cyclin D3；3相同的方法制备和评估包含上述构建体的植物。下文表6-8显示T1代的评估结果。每个表中显示转基因植物和对应失效合子之间的百分数差异。也显示了F检验的p值。
表7地上面积
F检验的p值显著，表明受这个启动子驱动的转基因表达显著减少地上面积。
表8种子总重量
结果显示，转基因植物的种子总重量低于相应失效合子的种子总重量。
表9饱满种子数
结果显示，转基因植物的饱满种子数低于相应失效合子的饱满种子数。
实施例5β-扩展蛋白启动子驱动的GUS表达使用“BP重组反应”将β-扩展蛋白启动子克隆入GatewayTM系统(Life Techologies)的pDONR201进入质粒。所克隆的插入片段的身份和碱基对组分通过测序得到确认，并额外地进行限制性消化来检测所得质粒。
为了将启动子克隆在报道基因的前面，随后将每个进入克隆与目的载体用于“LR重组反应”(Gateway TM)。这个目的载体设计为启动子与大肠杆菌(Escherichia coli)β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因有效连接，这通过替换在GUS基因前的Gateway重组盒实施。所得报道载体包含与GUS有效连接的启动子，随后用标准转化技术将其转化入农杆菌菌株LBA4044，并接下来转化入稻植物。
转基因稻植物从转化的细胞产生。植物在正常条件下生长。
用90％冰冷的丙酮覆盖待检测的植物或植物部分，并在4℃孵育30分钟。用Tris缓冲液[15.76g Trizma HCl(Sigma T3253)+2.922g NaCl溶于1升重蒸馏水，用NaOH调pH 7.0]洗涤3次、每次5分钟之后，用Tris/铁氰酸盐/X-Gluc溶液[9.8ml Tris缓冲液+0.2ml铁氰酸盐母液(0.33g铁氰酸钾(Sigma P3667)溶于10ml Tris缓冲液)+0.2ml X-Gluc母液(26.1mgX-Gluc(Europa Bioproducts ML 113A)溶于500μl DMSO)]。进行真空渗入15-30分钟。植物和植物部分在37℃孵育高达16小时，直至看见蓝色产生。用Tris缓冲液洗涤样品3次，每次5分钟。在50％、70％和90％一系列的乙醇(每种30分钟)中提取叶绿素。
序列表序列表<110>克罗普迪塞恩股份有限公司<120>产量增加的植物及制备其的方法<130>CD-111-PCT<150>EP 04100991.1<151>2004-03-10<150>US 60/553,418<151>2004-03-16<160>5<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>1086<212>DNA<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atggctttag aagaggagga agagagtcaa aacgcaccgt tttgtgttct tgatggtctt 60ttctgtgagg aagagagtga gtttcacgaa caagtagatt tgtgcgacga gagtgttgaa 120aagtttcctt ttttaaatct gggtttgtct gatcatgata tgttgtggga tgatgatgag 180ttatcaactt tgatttcgaa acaagaaccg tgtctttatg acgaaatctt agatgatgag 240tttctggttt tgtgtcgtga aaaggctctt gattggattt ttaaagtgaa atctcattat 300gggtttaatt cattgacggc tcttttagct gttaattact tcgataggtt tattacaagc 360aggaagtttc agacagataa gccatggatg tctcagctta ctgctttggc ttgtctgtct 420ttagctgcta aggttgaaga gatccgtgtt ccttttctct tagattttca agtggaagaa 480gcaagatatg tctttgaagc taagactata cagagaatgg agcttcttgt tctgtctact 540cttgactgga ggatgcatcc tgtgactcca atctcgtttt tcgatcacat tattcgacga 600tacagcttta aatctcatca tcaattggag ttcttgagta gatgtgaatc tttattactc 660tccattattc ctgattcgag atttctgagt tttagtcctt ctgtgttagc cactgcaata 720atggtctctg ttattagaga tttgaagatg tgtgacgaag ctgtatacca atctcagctc 780
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Trp Met Ser Gln Leu Thr Ala Leu Ala Cys Leu Ser Leu Ala Ala Lys130 135 140Val Glu Glu Ile Arg Val Pro Phe Leu Leu Asp Phe Gln Val Glu Glu145 150 155 160Ala Arg Tyr Val Phe Glu Ala Lys Thr Ile Gln Arg Met Glu Leu Leu165 170 175Val Leu Ser Thr Leu Asp Trp Arg Met His Pro Val Thr Pro Ile Ser180 185 190Phe Phe Asp Hi s IleIle Arg Arg Tyr Ser Phe Lys Ser His His Gln195 200 205Leu Glu Phe Leu Ser Arg Cys Glu Ser Leu Leu Leu Ser Ile Ile Pro210 215 220Asp Ser Arg Phe Leu Ser Phe Ser Pro Ser Val Leu Ala Thr Ala Ile225 230 235 240Met Val Ser Val Ile Arg Asp Leu Lys Met Cys Asp Glu Ala Val Tyr245 250 255Gln Ser Gln Leu Met Thr Leu Leu Lys Val Asp Ser Glu Lys Val Asn260 265 270Lys Cys Tyr Glu Leu Val Leu Asp His Ser Pro Ser Lys Lys Arg Met275 280 285Met Asn Trp Met Gln Gln Pro Ala Ser Pro Ile Gly Val Phe Asp Ala290 295 300Ser Phe Ser Ser Asp Ser Ser Asn Glu Ser Trp Val Val Ser Ala Ser305 310 315 320
Ala Ser Val Ser Ser Ser Pro Ser Ser Glu Pro Leu Leu Lys Arg Arg325 330 335Arg Val Gln Glu Gln Gln Met Arg Leu Ser Ser Ile Asn Arg Met Phe340 345 350Phe Asp Val Leu Ser Ser Ser Pro Arg355 360<210>3<211>1243<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>3aaaaccaccg agggacctga tctgcaccgg ttttgatagt tgagggaccc gttgtgtctg 60gttttccgat cgagggacga aaatcggatt cggtgtaaag ttaagggacc tcagatgaac 120ttattccgga gcatgattgg gaagggagga cataaggccc atgtcgcatg tgtttggacg 180gtccagatct ccagatcact cagcaggatc ggccgcgttc gcgtagcacc cgcggtttga 240ttcggcttcc cgcaaggcgg cggccggtgg ccgtgccgcc gtagcttccg ccggaagcga 300gcacgccgcc gccgccgacc cggctctgcg tttgcaccgc cttgcacgcg atacatcggg 360atagatagct actactctct ccgtttcaca atgtaaatca ttctactatt ttccacattc 420atattgatgt taatgaatat agacatatat atctatttag attcattaac atcaatatga 480atgtaggaaa tgctagaatg acttacattg tgaattgtga aatggacgaa gtacctacga 540tggatggatg caggatcatg aaagaattaa tgcaagatcg tatctgccgc atgcaaaatc 600ttactaattg cgctgcatat atgcatgaca gcctgcatgc gggcgtgtaa gcgtgttcat 660ccattaggaa gtaaccttgt cattacttat accagtacta catactatat agtattgatt 720tcatgagcaa atctacaaaa ctggaaagca ataaggaata cgggactgga aaagactcaa 780cattaatcac caaatatttc gccttctcca gcagaatata tatctctcca tcttgatcac 840tgtacacact gacagtgtac gcataaacgc agcagccagc ttaactgtcg tctcaccgtc 900gcacactggc cttccatctc aggctagctt tctcagccac ccatcgtaca tgtcaactcg 960
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<223>引物prm0360<400>4ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggct ttagaagagg agga 54<210>5<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物prm0361<400>5ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tagcgaggac tactataagc a 5权利要求
1.增加植物产量的方法，其包括向植物中引入于能在枝条中优选表达编码细胞周期蛋白D3的核酸的启动子控制之下的编码细胞周期蛋白D3的核酸。
2.根据权利要求1的方法，其中所述增加的产量是增加的种子产量。
3.根据权利要求1的方法，其中所述增加的产量是增加的地上面积。
4.根据权利要求2的方法，其中所述增加的种子产量选自(i)增加的种子生物量；(ii)增加的(饱满)种子数量；(iii)增加的种子大小；(iv)增加的种子体积；(v)增加的收获指数；和(vi)增加的千粒核重量。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中编码细胞周期蛋白D3的所述核酸从植物中获得。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其包括向植物中引入编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体，其中所述核酸或其功能性变体选自(i)编码细胞周期蛋白D3的核酸的部分；(ii)编码细胞周期蛋白D3的核酸的备选剪接变体；(iii)编码细胞周期蛋白D3的核酸的等位变体；和(iv)细胞周期蛋白D3氨基酸的同源物、衍生物和活性片段，其中所述功能性变体(i)-(iv)能够结合并激活植物CDK。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中能在枝条中优选表达所述核酸的所述启动子具有与β-扩展蛋白启动子相当的表达谱。
8.产生相比对应的野生型植物具有增加产量的转基因植物的方法，其中所述方法包括(i)向植物或植物细胞中引入编码细胞周期蛋白D3的核酸或其变体，优选SEQ ID NO1代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体，其中所述核酸或其功能性变体编码细胞周期蛋白D3多肽或其功能性变体，其中所述多肽优选如SEQ ID NO2所示、或者是其功能性变体，并且所述核酸或其功能性变体与能在枝条尤其是营养性(地上)枝条的细胞膨胀带中优选表达所述核酸的启动子有效连接；(ii)在促进再生和成熟植物生长的条件下培养植物细胞。
9.根据权利要求8的方法，其中所述增加的产量是增加的种子产量。
10.根据权利要求8或9的方法，其中所述增加的产量包含增加的地上面积，并且其中所述增加的种子产量选自(i)增加的种子生物量；(ii)增加的(饱满)种子数量；(iii)增加的种子大小；(iv)增加的种子体积；(v)增加的收获指数；和(vi)增加的千粒核重量。
11.增加植物产量尤其是种子产量的方法，其包括向植物中编码细胞周期蛋白D3多肽或其功能性变体的基因的基因座中引入遗传修饰，以允许基因在枝条中优选表达。
12.根据权利要求11的方法，其中所述遗传修饰通过诱变、同源重组、TILLING和T-DNA激活中的任意一种或多种实施。
13.通过根据权利要求1-12中任意一项所述的方法可以获得的植物。
14.构建体，其包含(i)编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体、优选SEQ ID NO1代表的编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体，其中所述核酸编码细胞周期蛋白D3多肽或其功能性变体、优选编码SEQ ID NO2代表的细胞周期蛋白D3多肽或其功能性变体；(ii)能在枝条尤其是营养性(地上)枝条的细胞膨胀带中优选表达(i)的核酸的启动子；和任选地(iii)转录终止序列。
15.根据权利要求14的构建体，其中所述启动子具有与β-扩展蛋白启动子相当的表达谱。
16.用根据权利要求14或15的构建体转化的植物。
17.相比对应的野生型植物具有增加的产量的转基因植物，其特征在于所述植物包含编码细胞周期蛋白D3的核酸或其功能性变体，位于能在枝条中优选表达所述核酸的启动子控制下。
18.根据权利要求13、16或16的转基因植物，其中所述植物为单子叶植物例如甘蔗，或者其中所述植物是谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、小米、黑麦属、燕麦属或高粱属。
19.根据权利要求13或16-18中任意一项所述的转基因植物的可收获部分。
20.根据权利要求19的可收获部分，其中所述可收获部分是种子。
21.与能在枝条中优选表达编码细胞周期蛋白D3的核酸的启动子有效连接的编码细胞周期蛋白D3的经分离核酸的用途，用于增加产量尤其是增加种子产量。
22.根据权利要求21的用途，其中所述种子产量包括(i)增加的种子生物量、(ii)增加的(饱满)种子数量、(iii)增加的种子大小、(iv)增加的种子体积、(v)增加的收获指数和(vi)增加的千粒核重量中的任意一种或多种。
23.根据权利要求21或22的用途，其中所述编码细胞周期蛋白D3的核酸是SEQ ID NO1代表的核酸或其功能性变体，或者其中所述细胞周期蛋白D3是SEQ ID NO2代表的氨基酸或其功能性变体。
全文摘要
本发明涉及通过向植物引入编码细胞周期蛋白D3蛋白质的核酸来增加植物产量的方法，其中所述核酸于能在枝条中优选表达该核酸的启动子控制之下。本发明也涉及包含编码细胞周期蛋白D3蛋白质的核酸的转基因植物，其中所述核酸于能在枝条中优选表达该核酸的启动子控制之下，并且其中所述植物相比对应的野生型植物具有增加的产量。本发明也涉及在本发明方法中有用的构建体。
文档编号C07K14/415GK1950511SQ200580014746
公开日2007年4月18日 申请日期2005年3月8日 优先权日2004年3月10日
发明者V·弗兰卡德 申请人:克罗普迪塞恩股份有限公司