人类il－12细胞因子家族的适体和其自体免疫疾病治疗中的应用的制作方法

专利名称：人类il－12细胞因子家族的适体和其自体免疫疾病治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明通常是关于核酸领域并更特别关于能够结合人白细胞介素-12(IL-12)细胞因子家族，更具体是关于人白细胞介素-12(IL-12)、人白细胞介素-23(IL-23)、或IL-12与IL-23，并且是关于其它的相关细胞因子(例如，IL-27和p40二聚体)的适体。这种适体作为自体免疫相关疾病和/或其它疾病或障碍中的治疗剂是有利的，这些疾病与IL-12家族的细胞因子，具体是IL-23和IL-12有关联。本发明进一步关于能够结合IL-23和/或IL-12的适体给药的材料和方法。
背景技术：
适体是通过与非标准Watson-Crick碱基配对相互作用来结合分子的具有特殊结合能力的核酸分子。适体，象由噬菌体展示或单克隆抗体(″mAbs″)产生的肽，能够特殊结合所选靶标和调节靶标活性，例如，通过结合适体可以阻滞其靶标发挥作用的能力。由随机序列寡核苷酸库的体外筛选过程产生，适体已经被制成超过100个蛋白，该蛋白包含生长因子、转录因子、酶、免疫球蛋白和受体。典型的适体尺寸是10-15kDa(30-45核苷酸)，使用亚纳摩尔亲和力结合其靶标，并且针对紧密相关靶标进行辨别(例如，适体一般不结合来自同一基因家族的其它蛋白)。一些列结构研究已经显示出适体能够使用相同类型结合作用(氢键、静电互补性、疏水接触、位阻排阻)，该结合作用使抗体-抗原复合体内的亲和性和特异性丧失活性。适体具有许多作为治疗和诊断使用的理想的特征，其包含高度特异性和亲和性、生物功效、和极好的药代动力学性质。此外，他们提供了对抗体和其它蛋白生物的特异性竞争优势，例如1)速度和控制。适体完全由体外制得，虑及初始通道包含治疗通道的快速生成。体外筛选使适体的特异性和亲和性被高度控制并且允许通道，包含抗毒性和非免疫原性靶的通道的生成。2)毒性和免疫原性。一类适体已经证明了很少或无毒性或免疫原性。在进行高水平适体的缓慢定量给药的老鼠或美洲旱獭体内，任何临床、细胞、或生物化学测试观察不到毒性。然而，许多单克隆抗体的效力能被抗体自己的免疫反应严重限制住，诱出适体的抗体是极其困难的，最可能因为适体不可能经过MHC由T-细胞递呈，并且免疫反应一般被训练为不认知核酸片断。3)给药。尽管目前大部分认可的抗体疗法通过静脉内灌输给药(一般在2-4小时内)，适体能通过皮下注射给药(在对猴子的研究中，适体通过皮下给药的生物利用度大于80％(Tucker et al，J.ChromatographyB.732203-212，1999))。此区别主要由于相对低的溶解度和最大治疗mAbs所必需的大量体积)。具有优良的溶解度和相对低的分子量(适体10-50kDa；抗体150kDa)，一周剂量的适体可经过注射小于0.5mL体积进行输送。此外，以抗体为基础疗法或预防的另一个优势为，小尺寸的适体使他们穿入构象狭窄部分，该部分不能使抗体或抗体片断穿透。4)可量测性和费用。治疗适体是经化学合成的，因此当需要满足生产需要时，容易测量出。然而测量产物的困难是目前限制一些生物的可用性和大规模蛋白生产商的投资性成本是巨大的，单一的大规模寡核苷酸合成能生产100千克/年以上并且需要相对适度的初期投资。对比高度最优化抗体的费用，千克等级的适体合成产物的目前费用估计是$500/g。生产工艺的不断改善预期在5年内降低货物的费用小于$100/g。5)稳定性。治疗适体是化学稳定的。它们适于在接触如加热和变性剂因素后恢复活性并且能在室温下以冻干粉末存储较长时间。
细胞因子和免疫反应哺乳动物的免疫反应以一系列复杂的称为“免疫网络”的细胞相互作用为基础。除了淋巴细胞、巨噬细胞、粒性白细胞、和其它细胞的网络样细胞相互作用、以淋巴因子、细胞因子、或单核因子闻名的可溶蛋白在控制这些细胞相互作用中起到关键作用。免疫系统细胞的细胞因子表达在免疫反应的调节中起到重要作用。大部分细胞因子是多向性的并且具有包含抗原呈递；活化、增殖、和CD4+细胞亚群分化；B细胞抗体反应；和超敏性表现的多重生物活性。细胞因子与宽范围退化或非正常条件相关，非正常条件直接或间接与免疫系统和/或造血细胞相关。细胞因子的重要家族是IL-12家族，其包含，如IL-12、IL-23、IL-27、和p40单体和p40二聚体。IL-23是由p19和p40亚基组成的共价键异二聚体分子，每一个由单独基因编码。IL-12也是由p35和p40亚基组成的共价键异二聚体分子。因此，IL-23和IL-12两者共同具有p40亚基(

图1)。人类和小鼠p19的氨基酸序列同源性达70％并且p35紧密相关(亚基相对IL-12是独一无二的)。转染试验显示类p35、p19蛋白当单独表达时分泌极少并且需要其具有高表达的异二聚体另一个成员p40的共同表达。p40和p19一起组成二硫键异二聚体。P19成分由活性巨噬细胞、树突状细胞(″DCs″)、内皮细胞、和T细胞大量制备出。ThI细胞表达p19mRNA的量大于表达Th2细胞的量；然而，在这些细胞类型中仅活性巨噬细胞、树突状细胞(″DCs″)自发表达p40，IL-23的另一成分。细菌产物，经由Toll-类受体-2的信号增加p19的表达，其暗示p19和IL-23可能对特定细菌感染的免疫反应中期作用。IL-12和IL-23的一个同源性是它们对T-细胞的增殖效果(Brombacher et al.，Trends in Immun.(2003))。然而，这些细胞因子作用的T-细胞亚群中存在明显差异。在小鼠体中，IL-12诱发原初小鼠T-细胞而不是记忆T-细胞的增殖，尽管IL-23增殖效果对记忆T-细胞受限。IL-23对IFN-γ生成的作用主要针对人体内记忆T-细胞。虽然IL-12能在原初T-细胞中诱发IFN-γ生成，并在更大程度上，记忆T-细胞、IL-23对原初T-细胞中IFN-γ生成具有非常小的影响。在IL-23刺激的记忆T-细胞中观察到IFN-γ生成的适度增加，但这种影响比IL-12刺激的结果稍微小些。因此，IL-23具有不同于IL-12的生物活性，然而两者被认为在自体免疫和炎性疾病如多重硬化症、风湿性关节炎、牛皮癣、全身性红斑狼疮、和肠易激综合症(包含克隆氏病(Crohn′s Disease)和溃疡性结肠炎)中起作用，除了如骨质酥松症中骨吸收、I型糖尿病、和癌症疾病。
自体免疫疾病治疗的IL-23和/或IL-12特异性适体虽然不受限于理论，应相信IL-12和IL-23与多重硬化症(″MS″)发病机理相关。例如，多重硬化症患者脑脊液中的p40水平上调(Fassbenderet al.，(1998)Neurology 51753)。此外，抗-p40 mAb已经显示出定位在脑损伤处(Brok et al.，JI(2002)1696554)。而且，较低水平p40 mRNA显示出对IFN-β治疗的预期临床反应(Van-Boxel-Dezaire et al.，1999)。因此，IL-12和IL-23经由p40的敲除可能改善多重硬化症的综合症。事实上，抗-p40抗体显示出显著性抑制老鼠的实验性自体免疫性脑脊髓炎(″EAE″)的发展和严重性(Constantinescu et al.，JI(1998)1615097)and in marmosets(Broket al，JI(2002)1696554)。IL-23和IL-12敲除对实验性自体免疫性脑脊髓炎小鼠模型的影响显示，尽管事实表明敲除IL-23和IL-12抑制了多重硬化症的发展和症状，事实更证明IL-23是这两者中在老鼠多重硬化症/实验性自体免疫性脑脊髓炎发病机理中更为重要的一员(Cua et al，(2003)Nature 421744)。例如，实验性自体免疫性脑脊髓炎能发生在p35敲除老鼠中，但不发生在p19或p40敲除老鼠中(Cua et al，(2003)。中枢神经系统中IL-23的表达而不是IL-12的表达补救p19/p40敲除老鼠的实验性自体免疫性脑脊髓炎，尽管IL-12的过度表达恶化了实验性自体免疫性脑脊髓炎，所以IL-12看起来在总TH1细胞发展和活化中起到一些作用(Cua et al)。在人体中，p40mRNA的过度表达而不是p35mRNA的过度表达在多重硬化症患者的中枢神经系统中观察到。除了在活化Th1细胞中起到一般性作用，IL-12可能对抗感染比IL-23更重要。在老鼠体内，p19敲除诱发标准的Th1细胞反应(高的IFN-γ，低的IL-4)，然而p35和p40敲除老鼠的反应受限于Th2细胞(低的IFN-γ，高的IL-4)(Cua et al)。此外，p19敲除免疫细胞产生强大的促炎细胞因子，然而p40敲除免疫细胞则不能。最后，p40、IL-12Rβ1和IL-12Rβ2敲除老鼠对多种感染敏感(Adorini，from Contemporary Immunology(2003)pg.253)。因此，通过适体治疗特异性抑制IL-23可有效地抗IL-23相关疾病而使患者更可能抵抗感染。IL-23和/或IL-12作为晚期关节炎的启动子与风湿性关节炎有关。虽然不受限于理论，应该相信IL-23影响记忆T-细胞的功能并通过协同这些细胞上的IL-23受体(IL-23R)影响炎性巨噬细胞。研究表明IL-23亚基p19和/或p40在老鼠胶原诱导性关节炎(″CIA″)中发挥作用，风湿性关节炎的老鼠模型。抗-p40抗体已经显示老鼠胶原诱导性关节炎症状的改善并且阻滞发生和发展并且联合抗-肿瘤坏死因子(抗-TNF)治疗(Malfaitet al，Clin.Exp.Immunol.(1998)111377，Matthys et al，Eur.J.Immunol.(1998)282143，and Butler et al，Eur.J.Immunol.(1999)292205)。此外，p19和p40敲除老鼠已经显示对胶原诱导性关节炎的发生完全抵御能力而胶原诱导性关节炎发生和严重性在p35敲除老鼠体内恶化(McIntyre et al，Eur.J.Immunol.(1996)262933，and Murphy et al，J.Exp.Med.(2003)1981951)。因此，本发明的适体和方法结合并抑制IL-23作为风湿性关节炎是有用的。IL-23和/或IL-12两者也被认为在Th-I相关疾病中炎性细胞的补充中发挥主要作用，Th-I相关疾病如寻常的牛皮癣、和肠易激综合症，包含但不限于克隆氏病和溃疡性结肠炎。例如，患有寻常牛皮癣患者的皮肤损害中的p19和p40mRNA增加水平由大量RT-PCR检测出，然而p35mRNA则不是(Lee et al.，J Exp Med(2004)199(1)125-30)。在2、4、6三硝基苯磺酸(″TNBS″)大肠炎中，老鼠的炎症性肠病实验性模型，采用抗-IL-12单克隆抗体治疗证实对完全改善和预防黏膜炎症是有效的(Neurath et al，JExp Med(1995)1821281-1290)。在另一个研究中，在三硝基苯磺酸大肠炎模型中评估几个不同的IL-12拮抗剂，抗-IL-12 p40抗体证实对预防黏膜炎症最有效，因此与IL-12和IL-23都相关(Schmidt et al.，Pathobiology(2002-03)；70177-183)。因此，本发明结合和抑制IL-12和/或IL-23的适体作为牛皮癣和炎症性肠病的治疗药剂是有效的。也应该相信，IL-12和/或IL-23在全身性红斑狼疮(″SLE″)中发挥作用。例如，患有全身性红斑狼疮患者得到的血清被发现含有作为单体的p40比作为二聚体(如IL-12(p35/p40)和IL-23(p19/p40))的p40血清水平显著性更高，表明不足的IL-23和/或IL-12生成可能在全身性红斑狼疮的发病机理中发挥作用。因此，本发明增强IL-23和/或IL-12生物功能的适体对治疗全身性红斑狼疮是有效的(Lauwerys et al.，Lupus(2002)11(6)384-7)。
肿瘤治疗的IL-23和/或IL-12特异性适体IL-12的抗肿瘤活性已经被表征，并且最近的研究已经显示IL-23也具有抗-肿瘤和抗-转移活性。例如，与对照组细胞株比较，IL-23逆转录转染克隆癌细胞显著性减少免疫活性老鼠的细胞株制备的克隆肿瘤的增长，表明肿瘤中IL-23的表达产生了抗-肿瘤效果(Wang et al.，Int.J.Cancer105，820-824(2003)。同样地，逆转录基因工程成释放单链IL-23(″scIL-23″)的肺癌细胞株显著性抑制BALB/c老鼠的肺内转移，因而发生几乎全部肿瘤排斥(Lo et al.，J.Immunol 2003，171600-607)。因此，结合IL-23和/或IL-12并提高它们的生物功能的适体对治疗克隆癌症、肺癌、特殊的肺癌转移、和其它的肿瘤疾病的肿瘤治疗是有效的，这些肿瘤的治疗中IL-23和/或IL-12具有抗-肿瘤功效。目前，还没有以人类IL-23为靶向的已知治疗药物。以IL-23为靶标得可利用药物包含经过R&D体系(Minneapolis，MN)研发仅做研究使用的抗-人类IL-23p19多克隆抗体、以IL-12和IL-23为靶标的抗-人类p40单克隆抗体，虽然两种细胞因子都具有p40亚基，和以小鼠IL-23而不是以人类IL-23为靶标的抗-小鼠IL-23 p19多克隆和单克隆抗体(Pirhonen，et ah，(2002)，J Immunology 1695673-5678)。像以前解释的那样，抑制IL-23和IL-12活性的药物可能使患者更易感染，并且从发展治疗药物角度看一般能比仅抑制IL-23药物引发更多并发症。虽然有证明IL-23在脑和关节的自体免疫炎症中比IL-12发挥更重要的作用，仅IL-23的治疗特异性可能比以两种细胞因子如抗-p40人类mAb为靶标的药物更有优势。就作为治疗药物的适体的特异性、小尺寸、和亲和性的优势而言，拥有适体治疗疾病的的原料和方法是有利的，在这些疾病中，细胞因子、特异性IL-23和IL-12在发病机理中发挥作用。本发明提供了满足这些或其它要求的原料和方法。
发明概述本发明提供了自体免疫和炎性疾病和其它相关疾病/障碍治疗的原料和方法，IL-23和/或IL-12与这些疾病的发病机理相关。在一个具体实施方案中，本发明的材料提供了特异性结合IL-23的适体。在一个具体实施方案中，本发明的适体结合的IL-23是人类IL-23而在另一个具体实施方案中，IL-23是IL-23的变异体。在一个具体实施方案中，IL-23的变异体履行生物功能，其生物功能基本与人类IL-23功能类似并具有与人类IL-23基本相同结构，具有结合上述适体的基本相同的能力。在一个实施方案中，人类IL-23或其变异体包括氨基酸序列，其与包括SEQ ID NOs 4和/或5有至少70％同源性、优选至少80％同源性、更优选至少90％同源性。在另一个实施方案中，人类IL-23或其变异体具有包括SEQ ID NOs 4和5的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的适体具有约100nM或更少、优选50nM或更少、更优选10nM或更少、甚至更优选1nM或更少的离解常数。在一个实施方案中，本发明的适体调节人类IL-23或其变异体的功能。在一个实施方案中，本发明的适体刺激人类IL-23的功能。在另一个实施方案中，本发明的适体抑制人类IL-23或其变异体的功能。而在另一个实施方案中，本发明的适体体内抑制人类IL-23或其变异体的功能。而在另一个实施方案中，本发明的适体阻止IL-23结合IL-23受体。在一些实施方案中，通过本发明适体调节的人类IL-23或其变异体的功能是介导人类IL-23相关疾病如自体免疫疾病(包含但不限于多重硬化症、风湿性关节炎、牛皮癣、全身性红斑狼疮、和肠易激综合症(如，包含克隆氏病(Crohn′s Disease)和溃疡性结肠炎))、炎性疾病、癌症(包含但不限于直肠癌、肺癌、和肺癌转移)、骨质疏松症的骨吸收、和I型糖尿病。在一个实施方案中，本发明的适体具有与包括选自由SEQ IDNOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ ID NOs 91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-130、SEQ ID NOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQIDNOs 164-172、SEQ IDNOs 176-178、SEQ IDNOs 181-196、和SEQ IDNOs203-314组成的组的核苷酸序列的适体结合人类IL-23基本相同的能力。在另一个实施方案中，本发明的适体具有与包括选自由SEQ ID NOs13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ ID NOs 91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-130、SEQ IDNOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ IDNOs 164-172、SEQ ID NOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs203-314组成的组的核苷酸序列的适体结合人类IL-23基本相同的能力。在一个实施方案中，本发明提供了结合人类IL-23的适体，该适体包括的核苷酸序列与选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ ID NOs 91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-130、SEQ IDNOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs 164-172、SEQ ID NOs176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs 203-314任一个序列至少80％、更优选至少90％的同源性。在另一个实施方案中，本发明提供了包括4个邻接核苷酸、优选8个邻接核苷酸、更优选20个邻接核苷酸的适体，该4、8、20个邻接核苷酸与选自由SEQ ID NOs 13-66，SEQ ID NOs71-88，SEQ ID NOs 91-96，SEQ ID NOs 103-118，SEQ ID NOs 124-130，SEQID NOs 135-159，SEQ ID NO 162，and SEQ ID NOs 164-172，SEQ ID NOs176-178，SEQ ID NOs 181-196，and SEQ ID NOs 203-314组成组的任一个序列的区别序列中4、8或20个邻接核苷酸的序列具有同源性。而在另一个实施方案中，本发明提供了能结合人类IL-23或其变异体的适体，其包括选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ ID NOs 91-96、SEQID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-130、SEQ ID NOs 135-159、SEQ ID NO162、和SEQ ID NOs 164-172、SEQ ID NOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs 203-314组成组的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了具有在SEQ ID NO 177中，优选在SEQ ID NO 224，更优选在SEQ ID NO 309，更优选在SEQ ID NO 310，更优选在SEQ ID NO 311中列出的序列。在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合小鼠IL-23的适体。在另一个实施方案中，本发明提供了结合小鼠IL-23变异体的适体，该小鼠IL-23变异体起到与小鼠IL-23的基本相同生物功能，并且具有基本相同的结构，和与小鼠IL-23基本相同的结合上述适体的能力。在一个实施方案中，本发明适体结合的小鼠IL-23或其变异体包括的氨基酸序列与包括SEQ ID NOs 315和/或316的序列至少80％、优选至少90％的同源性。在另一个实施方案中，小鼠IL-23或其变异体具有包括SEQ ID NOs 315和316的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的适体具有对于小鼠IL-23或其变异体为约100nM或更少、优选50nM或更少、更优选10nM或更少的离解常数。在一个实施方案中，本发明的适体调节小鼠IL-23或其变异体的功能。在一个实施方案中，本发明的适体刺激小鼠IL-23的功能。在另一个实施方案中，发明的适体抑制小鼠IL-23或其变异体的功能。而在另一个实施方案中，本发明的体内适体抑制小鼠IL-23或其变异的功能。而在另一个实施方案中，本发明的适体阻止小鼠IL-23结合小鼠IL-23受体。在一些实施方案中，本发明适体调节的小鼠IL-23的功能是介导小鼠IL-23相关模型如实验性自体免疫性脑脊髓炎、小鼠胶原诱导关节炎、TNBS结肠炎。在一个实施方案中，本发明的适体具有与包括选自由SEQ IDNOs 124-134和SEQ ID NOs 199-202组成组的核苷酸序列的适体结合小鼠IL-23的基本相同的能力。在另一个实施方案中，本发明的适体具有与包括选自由SEQID NOs 124-134和SEQ ID NOs 199-202组成组的核苷酸序列的适体基本相同的结构和结合小鼠IL-23基本相同的能力。在一个实施方案中，本发明提供了结合小鼠IL-23的适体，该适体包括核苷酸序列与选自由SEQ ID NOs 124-134和SEQ ID NOs199-202组成组的任一序列至少80％同源性、优选至少90％同源性。在另一个实施方案中，本发明提供了包括4个邻接核苷酸、优选8个邻接核苷酸、更优选20个邻接核苷酸的适体，该4、8、20个邻接核苷酸与选自由SEQ ID NOs 124-134和SEQ ID NOs 199-202组成组的任一序列的区别序列中4、8或20个邻接核苷酸的序列具有同源性。在另一个实施方案中，本发明提供了能结合小鼠IL-23或其变异体的适体，该适体包括选自由SEQ ID NOs 124-134和SEQ ID NOs 199-202组成组的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明的原料提供了特异性结合IL-12的适体。在一个实施方案中，本发明适体结合的IL-12是人类IL-12，而在另一个实施方案中，IL-12是人类IL-12的变异体。在一个实施方案中，IL-12的变异体履行生物功能，该生物功能与人类IL-12功能基本相同并且具有基本相同结构和与人类IL-12相比具有结合上述适体基本相同的能力。在一个实施方案中，人类IL-12或其变异体包括氨基酸序列，该氨基酸序列与包括SEQ ID NOs 4和/或6的序列具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性。在另一个实施方案中，人类IL-12或其变异体具有包括SEQ ID NOs 4和6的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的适体调节人类IL-12或其变异体的功能。在一个实施方案中，本发明的适体激发人类IL-12的功能。在另一个实施方案中，本发明的适体抑制人类IL-12或其变异体的功能。而在另一个实施方案中，本发明的适体体内抑制人类IL-12或其变异体的功能。而在另一个实施方案中，本发明的适体阻止IL-12结合IL-12受体。在一个实施方案中，通过本发明适体调节的人类IL-12或其变异体的功能是介导人类IL-12相关疾病如自体免疫疾病(包含但不限于多重硬化症、风湿性关节炎、牛皮癣、全身性红斑狼疮、和肠易激综合症(如，包含克隆氏病(Crohn′s Disease)和溃疡性结肠炎))、炎性疾病、癌症(包含但不限于直肠癌、肺癌、和肺癌转移)、骨质疏松症的骨吸收、和I型糖尿病。在一个实施方案中，本发明提供了或是核糖核酸或是脱氧核糖核酸的适体。在另一个实施方案中，这些核糖核酸或是脱氧核糖核酸适体是单链的。在另一个实施方案中，本发明提供了包括至少一个化学修饰的适体。在一个实施方案中，化学修饰选自由在糖位置上的化学取代；在磷酸位置上的化学取代；和在碱基位置、核酸上的化学取代；掺入修饰的核苷酸；3′加帽；与高分子量、非免疫原化合物结合；与亲脂性化合物结合；和磷酸骨架修饰组成的组。在一个实施方案中，与本发明的适体结合的非免疫原、高分子量的化合物是聚氧化烷撑，优选聚乙二醇。在一个实施方案中，骨架修饰包括向磷酸骨架中掺入一个或多个硫代磷酸。在另一个实施方案中，本发明的适体包括在磷酸骨架中掺入少于10个、小于6个、或小于3个硫代磷酸。在一个实施方案中，本发明的原料提供了药物组合物，其包括有效治疗剂量的选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ IDNOs 91-96、SEQ ID NOs 103-18、SEQ ID NOs 124-130、SEQ ID NOs135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs 164-172、SEQ ID NOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs 203-314组成组的核酸序列的适体、或其盐、和药物用载体或赋形剂。在另一个实施方案中，本发明的原料提供了药物组合物，其包括有效治疗剂量的选自由SEQ ID NO 14、SEQ IDNOs 17-19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NOs 27-32、SEQ ID NOs 34-40、SEQID NO 42、SEQ ID NO 49、SEQ ID NOs 60-61、SEQ ID NOs 91-92、SEQ IDNO 94、和SEQ ID NOs 103-118组成组的核酸序列的适体、或其盐、和药物用载体或赋形剂。在一个优选实施方案中，本发明的原料提供了药物组合物，其包括有效治疗剂量的选自由EQ ID NO 177、SEQ ID NO 224、和SEQ ID NOs 309-312组成组的核酸序列的适体。在一个实施方案中，本发明提供了治疗、预防或改善由IL-23介导的疾病的方法，该方法包括对脊椎动物进行组合物给药，该组合物包括有效治疗剂量的选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ IDNOs 91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-130、SEQ ID NOs135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs 164-172、SEQ ID NOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs 203-314组成组的核酸序列的适体。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗、预防或改善IL-23和/或IL-12介导疾病的方法，该方法包括对脊椎动物进行组合物给药，该组合物包括有效治疗剂量的选自由SEQ ID NO 14、SEQ ID NOs 17-19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NOs 27-32、SEQ ID NOs 34-40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 49、SEQ ID NOs 60-61、SEQ ID NOs 91-92、SEQ ID NO 94、和SEQ ID NOs103-118组成组的核酸序列的适体。在一个优选实施方案中，对脊椎动物给药的包括有效治疗剂量适体的组合物包括选自由SEQ ID NO 177、SEQID NO 224、和SEQ ID NOs 309-312组成组的核酸序列。在一个实施方案中，进行药物组合物给药的脊椎动物是哺乳动物。在一个优选的实施方案中，哺乳动物是人类。在一个实施方案中，采用本发明方法进行治疗、预防、或改善的疾病选自由自体免疫疾病(包含，但不限于多重硬化症、风湿性关节炎、牛皮癣、全身性红斑狼疮、和肠易激综合症(如，(如，包含克隆氏病(Crohn′sDisease)和溃疡性结肠炎))、炎性疾病、癌症(包含但不限于直肠癌、肺癌、和肺癌转移)、骨质疏松症的骨吸收、和I型糖尿病组成的组。在一个实施方案中，本发明提供了诊断方法，其包括将包括具有选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ ID NOs 91-96、SEQID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-134、SEQ ID NOs 135-159、SEQ ID NO162、和SEQ ID NOs 164-172、SEQ IDNOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs 199-314组成组的核酸序列的适体，与可能包括IL-23和/或IL-12或其变异体的组合物接触，并且检测IL-23和/或IL-12或其变异体存在或不存在。在一个实施方案中，本发明提供了用于体外诊断使用的具有选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ ID NOs 91-96、SEQ IDNOs 103-118、SEQ ID NOs 124-134、SEQ ID NOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs l64-172、SEQ ID NOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs 199-314组成组的核酸序列的适体。在另一个实施方案中，本发明提供了用于体内诊断使用的具有选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ IDNOs 71-88、SEQ ID NOs 91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQ ID NOs124-134、SEQ ID NOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs 164-172、SEQ IDNOs 176-178、SEQ IDNOs 181-196、和SEQ ID NOs 199-314组成组的核酸序列的适体。而在另一个实施方案中，本发明提供了体内治疗、预防或改善疾病使用的具有选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs71-88、SEQ ID NOs 91-96、SEQ IDNOs 103-118、SEQ ID NOs 124-134、SEQ ID NOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs 164-172、SEQ IDNOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs 199-314组成组的核酸序列的适体。
附图的简要说明图1为白细胞间介素-12家族细胞因子的示意图。图2为从随机序列寡核苷酸库体外适体筛选(SELEXTM)方法的示意图。图3为用于选择对IL-23特异性的适体的体外筛选方案的示意图，该方案包含阴性筛选步骤从而去除认知p40、IL-12和IL-23中普通亚基的序列。图4为40kDa支链PEG的插图。图5为附着在适体5′端的40k1Da支链PEG的插图。图6为描述不同聚乙二醇化修饰方案的说明性插图，该方案代表标准的单一聚乙二醇化修饰、多种聚乙二醇化修饰、和通过聚乙二醇化产生二聚作用。图7显示了在多轮筛选之后rRmY和rGmH库与IL-23结合的曲线图。图8A为1型IL-23适体的序列和预测第二种结构构造的代表性示意图；图8B为几个2型IL-23适体的序列和预测第二种结构构造的代表性示意图。图9A为Type 1 IL-23适体的最小化适体序列和预测第二种结构构造的示意图；图9B为2型IL-23适体的最小化适体序列和预测第二种结构构造的示意图。图10描述了dRmY最小化片断ARC979(SEQ IDNO 177)的预测G-四级结构。图11为显示了ARC979(SEQ ID NO 177)内N-甲基中卟啉(NMM)荧光的增加，确定了ARC979采用了G-四级结构。图12为基于全部适体量，使用50nM IL-23分析ARC979(SEQID NO 177)竞争性结合曲线的曲线图。图13为基于全部适体量，使用250nM IL-12分析ARC979(SEQID NO 177)竞争性结合曲线的曲线图。图14为在两种不同结合反应条件下，ARC979(SEQ ID NO 177)直接结合曲线的曲线图(IX PBS(没有Ca++或Mg++)或IX Dulbeccos PBS(含Ca++和Mg++)。图15为ARC979(SEQ ID NO 177)硫代磷酸衍生物的直接结合曲线，该曲线图描述了硫代磷酸取代物增加了结合IL-23的比例。图16为描述了单硫代磷酸取代物ARC979高度亲和力竞争IL-23的ARC979(SEQ ID NO 177)硫代磷酸衍生物的竞争性结合曲线。图17为比较母系ARC979(SEQ ID NO 177)适体(ARC895为负向调控)，ARC979最佳衍生物ARC1624(SEQ ID NO 310)和ARC1625(SEQ ID NO 311)的直接结合曲线的曲线图。图18为描述对比最佳ARC979衍生物构建，ARC979(SEQ IDNO 177)的血浆稳定性的曲线图。图19为用于测量接触本发明适体的PHA原始细胞溶解产物中STAT3活性的TransAMTM测试示意图。图20为用于IL-23诱发的接触本发明适体的PHA原始细胞溶解产物中STAT3磷酸化的流程图。图21为与对IL-23诱发PHA原始细胞中STAT3磷酸化的各自最佳克隆进行比较，使用TransAMTM测试显示的rRfY组合物的母系IL-23适体的抑制功效的代表性曲线图。图22为通过TransAMTM测试中dRmY组合物的IL-23适体，IL-23诱发STAT3磷酸化的抑制百分比的曲线图(ARC793(SEQ ID NO 163)为非结合适体)。图23为通过TransAMTM测试中dRmY组合物的母系IL-23适体，IL-23诱发STAT3磷酸化的抑制百分比的曲线图((ARC621(SEQ IDNO 108)、ARC627(SEQ ID NO HO))与他们各自的最佳克隆(ARC979(SEQID NO 177)、ARC980(SEQ ID NO 178)、ARC982(SEQ ID NO 180))比较)。图24为通过Pathscan测试中ARC979(SEQ ID NO 177)和ARC979(ARC1624(SEQ ID NO 310)和ARC1625(SEQ ID NO311))的两个最佳衍生物克隆，IL-23诱发STAT3磷酸化的抑制百分比的曲线图。图25为通过TransAMTM测试进行测量，人类和小鼠IL-23诱发人类PHA原始细胞中STAT3活性的对比曲线图。
发明详述本发明的一个或多个实施方案的详述列在下面的描述中。尽管类似于或等同于在这里描述的方法和材料能在本发明的实施或测试中使用，现在对优选的方法和材料进行描述。本发明的其他特征、目标、和优势在该描述中清楚明了。在说明书中，如果上下文不进行其他的清楚规定，单数形式也包含复数形式。如果无其他定义，在这里使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员普遍可理解的含义。一旦发生冲突，将以本发明说明书为准。
SELEXTM方法制成适体的适宜方法是采用在图2中进行描述的称为″Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment″(″SELEXTM″)的方法。SELEXTM方法是高度特异性结合靶分子的核酸分子体外演变的方法，并在如1990年6月11日提出的美国专利申请序列号07/536,428，现在被放弃了，题目为″核酸配体″的美国专利第5,475,096号，和题目为″核酸配体″的美国专利第5,270,163号(也参见WO 91/19813)中进行了描述。每个SELEXTM-鉴别的核酸配体，如每个适体，是给定靶化合物或分子的特异性配体。SELEXTM方法是以独特的理解为基础，核酸具有形成二维结构和三维结构变异体的能力并且起到一些化学化合物配体作用的单体内充分可利用的化学多用性(例如，形成特异性结合对)，不管是单体化合物或聚合物。一些尺寸的分子或组合物能作为靶标。SELEXTM依赖于包括随机序列的单链寡核苷酸大文库或库的起始点。寡核苷酸可为修饰的或未修饰的DNA、RNA、或DNA/RNA混合物。在一些实施例中，该库包括100％随机或部分随机的寡核苷酸。在另一个实施例中，该库包括随机或部分随机的寡核苷酸，该寡核苷酸包含至少1个插在随机序列中的固定序列和/或保守序列。在另一个实施例中，该库包括随机或部分随机的在其5′和/或3′末端上至少一个固定序列和/或保守序列的寡核苷酸，该寡核苷酸包括寡核苷酸库的所有分子同源的序列。固定序列是寡核苷酸库中普遍的序列，寡核苷酸为预先设定的目的，如下面进一步描述的CpG基序、PCR引物的杂交位点、RNA聚合酶的启动子序列(例如，T3、T4、T7、和SP6)、限制性位点、或同聚物序列(如poly A或poly T tract)、催化核心、选择性结合亲合柱的位点、和便于克隆和/或主体寡核苷酸排序的序列而被掺入。保守序列是被许多结合相同靶标的适体共享的序列，而非先前表述的固定序列。该库的寡核苷酸优选包含随机化序列部分以及有效扩增必须的固定序列。一般地，起始库的寡核苷酸包含位于30-50个随机核苷酸内部序列侧面的固定5′和3′末端序列。随机化核苷酸能采用包含化学合成和通过随机切除细胞核酸进行尺寸选择的多种方式制备。在选择/扩增重复之前或期间，突变形成也能被导入或诱发测试核酸的序列变化。寡核苷酸的随机序列部分能具有任何长度并能包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，能包含修饰的或未修饰的固有核苷酸或核苷酸类似物。参见，如美国专利No.5,958,691；美国专利No.5,660,985；美国专利No.5,958,691；美国专利No.5,698,687；美国专利No.5,817,635；美国专利No.5,672,695，和PCT公开WO 92/07065。使用本领域周知的固相寡核苷酸合成技术利用磷酸二酯联合核苷酸合成随机寡核苷酸。参见，如Froehler et al，Nucl.Acid Res.145399-5467(1986)and Froehler et a1，Tet.Lett.275575-5578(1986)。也能使用液相方法如三酯合成法合成随机寡核苷酸。参见，如Sood et al，Nucl.Acid Res.42557(1977)and Hirose et al，Tet.Lett.，282449(1978)。一般在自动化DNA合成设备上实施的合成产生1014-1016个独立的分子，该数量足够大部分SELEXTM实验使用。序列设计中的充分大的随机序列增加了每个合成分子有可能代表唯一序列的可能性。寡核苷酸的起始文库可以通过DNA合成装置采用自动化化学合成而制得。为合成随机序列，合成过程期间，全部四个核苷酸的混合物在每个核苷酸加成阶段被加入，考虑随机掺入核苷酸。如同上面陈述的，在一个实施方案中，随机寡核苷酸包括全部随机序列；然而，在另一个实施方案中，随机寡核苷酸能包括非随机或部分随机寡核苷酸。部分随机序列能通过以不同的摩尔比在每个加成阶段加成4个核苷酸而制成。寡核苷酸的起始文库可能为RNA或DNA。在这些实例中，RNA文库用作起始文库的情况下，一般通过使用T7 RNA聚合酶或修饰的T7 RNA聚合酶或精制的T7 RNA聚合酶体外转录DNA文库而制成。在适于结合和经受逐步反复结合、分离纯化和扩增的条件下，使用总选择方案RNA或DNA文库与靶标混合以得到有效的预期标准的结合亲和力和选择性。更具体的，以包含起始文库核酸的混合物为起始。SELEXTM方法包含的步骤为(a)在适于结合的条件下混合物与靶标接触；(b)从那些具有特异性结合靶标分子的核酸中分离纯化游离核酸；(c)分离核酸-靶标配合物；(d)扩增从核酸-靶标配合物中分离的核酸以生成核酸的富集配体混合物；和(e)经由许多环重复结合、分离纯化、分离和扩增步骤预期生成靶分子的高度特异性、高度亲和性核酸配体。在那些实例中，选择RNA适体的情况下，SELEXTM进一步包括步骤为(i)在步骤(d)中的扩增之前逆转录从核酸-靶标配合物中分离的核酸；和(ii)在重新启动该过程之前转录从步骤(d)扩增的核酸。在包含大量可能序列和结构的核酸混合物中，具有给定靶标的宽范围的结合亲和性。核酸混合物包括，例如，20个随机片断能具有420个候选可能性。对靶标具有高度亲和常数的那些是最可能结合靶标的。在分离纯化、分离和扩增之后，第二个核酸混合物产生，富集较高结合亲和性候选。另一轮筛选渐渐偏向最好的配体直到得到的核酸混合物主要仅由一个或一些序列组成。然后，作为纯化的配体或适体，其能被克隆、排序和分别测试结合亲和性。选择和扩增的周期被重复直到达到预期的目标。在最普通的情况中，选择/扩增被重复直到在循环重复中达到结合强度没有显著性提高。这个方法一般用于约1014个不同核酸类型的样本然而可用于约1018之多个不同核酸类型的样本。一般来说，核酸适体选自5到20轮的过程。在一个实施方案中，异质性仅在最初的选择阶段被诱发，在整个复制过程没有发生。在SELEXTM的一个实施方案中，选择过程对隔离那些核酸配体是有效以至于最牢固的结合被选择的靶标，仅需要一个周期的选择和扩增。这种有效的选择可以发生在，例如，标准色谱方法中，其中核酸联合靶标的能力受制于以一定方式进行的柱操作，该方式使柱充分能分离和隔离最高亲和性核酸配体。在许多情况下，没有必要实施SELEXTM的重复步骤直到单一核酸配体被确定。特异性靶核酸配体溶液可包含，该核酸家族结构或基序具有一些保守序列和在无显著性影响核酸配体对靶标的亲和性的情况下被取代或被加入的一些序列。通过在完成之前终止SELEX方法，有可能确定许多核酸配体溶液家族成员的序列。多种核酸一级、二级和三级结构是周知的。已经最普遍地显示出与非-Watson-Crick型相互作用有关的结构或基序统称为发夹环、对称和非对称突出、假结和数种相同结合。这种基序的几乎所有已知情况提出了他们能在不超过30个核苷酸的核酸序列中形成。出于这种原因，经常优选带有邻接随机片断的SELEXTM方法从包含在约20个到50个核苷酸并且在一些实施方案中约30到40个核苷酸的随机片段的核酸序列开始。在一个实施例中，5′-固定随机3′-固定序列包括约30个到约50个核苷酸的随机序列。以SELEXTM为核心的方法已经进行修改以达到许多特殊目标。例如，美国专利No.5,707,796描述了使用SELEXTM联合凝胶电泳来选择具有特殊结构特征的核酸分子，例如弯曲DNA，美国专利No.5,763,177描述了以SELEXTM为基础的方法用于选择包含能结合和/或光致交联和/或光失活靶分子的反应基团的核酸配体。美国专利No.5,567,588和美国专利No.5,861,254描述了在具有对靶分子高亲和性和低亲和性的寡核苷酸之间达到高效分离纯化的以SELEXTM为基础的方法。美国专利No.5,496,938描述了在SELEXTM方法被采用之后，获得改良的核酸配体的方法。美国专利No.5,705,337描述了共价键合靶标配体的方法。SELEXTM也能用于获得结合靶标分子上多于一个位点的核酸配体，并获得包含非核酸类型的结合靶标上特殊位点的核酸配体。SELEXTM提供了隔离和鉴别结合一些预测靶标的核酸配体的装置，其预测靶标包含大的和小的生物分子如核酸结合蛋白和结合作为其生物功能部分以及辅助因子和其他小分子核酸的未知蛋白。例如，美国专利No.5,580,737公开了通过SELEX方法鉴定的核酸序列，该核酸序列能高亲和力结合咖啡因和紧密相关的类似物，茶碱。Counter-SELEXTM是通过除去对一个或多个非靶分子有交叉反应的核酸配体序列来改进核酸配体对靶分子的特异性的方法。Counter-SELEXTM由以下步骤组成(a)制备核酸的候选混合物；(b)用靶标接触候选混合物，其中与候选混合物比较对靶标有增强亲和力的核酸可从候选混合物的剩余物中分离纯化出；(c)从候选混合物的剩余物中分离增强亲和力的核酸；(d)从靶标中分离增强亲和力的核酸；(e)用一个或多个非靶分子接触增强了亲和力的核酸使得对非靶分子有特殊亲和力的核酸配体被除去；和(f)扩增仅对靶分子有特殊亲和力的核酸来生成富集对结合靶分子具有相对较高亲和力和特异性核酸序列的核酸混合物。像上面描述的SELEXTM，选择和扩增周期进行必要的重复直到达到预期目标。用于治疗和疫苗的核酸使用中遇到的一个潜在问题是磷酸二酯形式中的寡核苷酸在显示出预期功效之间可在体液中被细胞内酶和细胞外酶如核酸内切酶和核酸外切酶迅速降解。因此，SELEXTM方法围绕着高亲和力核酸配体的鉴定，该核酸配体包含改善配体特征(如体内改善稳定性或改善输送特征)的修饰核苷酸。这种改进的实施例包含在核糖和/或磷酸和/或碱基位点处的化学取代。包含改良核苷酸的SELEX-鉴定核酸配体在如美国专利No.5,660,985中进行了描述，该专利描述了包含核苷酸衍生物的寡核苷酸在核糖的2′位点、嘧啶的5位点、和嘌呤的8位点进行了化学修饰，美国专利No.5,756,703描述了包含不同2′-修饰的嘧啶的寡核苷酸，并且美国专利No.5,580,737描述了包含采用2′-氨基(2′-NH2)，2’-氟(2′-F)，和/或2′-O-甲基(2′-OMe)取代物修饰一个或多个核苷酸的特异性核酸配体。本发明中预期的核酸配体的修饰包含，但不限于，提供给核酸配体碱基或全部核酸配体的合并其它电荷的另外化学基团、极化效应、疏水性、氢键合、静电相互作用、和流变性。抗核酸酶的为生成寡核苷酸群的修饰也能包含一个或多个取代核苷酸间键合、改变的糖、改变的碱基、或其联合。这种修饰包含，但不限于，2′-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-嘌呤修饰、环外胺上的修饰、4-硫代尿苷的取代、5-溴或5-碘尿嘧啶的取代；骨架修饰、硫代磷酸或烷基磷酸修饰、甲基化作用、和异常碱基对联合如等基线异胞嘧啶核苷和异鸟嘌呤核苷。修饰也能包含3′和5′修饰如封堵剂。在一个实施方案中，寡核苷酸被提供，其中P(O)O基由P(O)S(″硫代″)取代，P(S)S(″二硫代″)，P(O)NR2(″酰胺化″)，P(O)R，P(O)OR′，CO或CH2(″缩醛型″)或3′-胺(-NH-CH2-CH2-)，其中每个R或R′为独立的H或取代的或未取代的烷基。连接基团能通过--、-N-、或-S-连接在邻近的核苷酸上。并不要求寡核苷酸中所有的连接是同样的。如在这里使用的，术语硫代磷酸化修饰包括在由一个或多个硫原子取代的磷酸二酯键中的一个或多个非桥氧原子。在另一个实施方案中，寡核苷酸包括修饰的糖基，例如，一个或多个羟基由卤素、脂肪基取代，或功能化为酯或胺。在一个实施方案中，呋喃糖基的2′-位由O-甲基、O-烷基、O-烯丙基、S-烷基、S-烯丙基、或卤基中的一些取代。2′-位修饰的糖的合成方法在如，Sproat，et al，Nucl.AcidRes.19733-738(1991)；Gotten，et al.，Nucl.Acid Res.192629-2635(1991)；和Hobbs，et al，Biochemistry 125138-5145(1973)中进行了描述。其他的修饰是本领域周知的一种技术。这种修饰可为pre-SELEXTM方法修饰或post-SELEXTM方法修饰(先前确定的未修饰配体的修饰)或可结合SELEXTM方法而进行。Pre-SELEXTM方法修饰或结合SELEXTM方法而进行的修饰生成具有SELEXTM靶标特异性和提高的稳定性如体内稳定性的核酸配体。post-SELEXTM方法修饰制成的核酸配体可使稳定性提高，如，没有不利影响核酸配体的结合能力的体内稳定性。SELEXTM方法包括使用美国专利No.5,637,459和美国专利No.5,683,867中进行描述的其他经选择的寡核苷酸和非寡核苷酸功能基结合经选择的寡核苷酸。SELEXTM进一步包括使用诊断或治疗合成物中亲脂的或非免疫原性的高分子量化合物结合经选择的核酸配体，依照在如美国专利No.6,011,020、美国专利No.6,051,698、和PCT公开号WO 98/18480中描述的。这些专利和申请讲述了较宽系列形状的结合和其它的性质，具有有效的扩增和复制性质的寡核苷酸，并具有预期性质的其他分子。经SELEXTM方法鉴定小型柔性肽的核酸配体也被研究了。小型肽具有可柔性结构并经常存在于多种构象平衡的溶液中，因此它最初被认为结合亲和力可被经结合柔性肽而减少构象熵所限制。然而，确定溶液中小分子肽的核酸配体的可能性在美国专利No.5,648,214中进行了论证。在该专利中，P物质和11个氨基酸肽的高亲合力RNA核酸配体被确定。对本发明的靶标具有特异性和结合亲和力的适体一般可由在这里进行描述的SELEXTM方法选出。依据SELEXTM方法部分，经选择的结合靶标的序列非必须地最小化来确定具有预期结合亲和力的最小序列。经选择的序列和/或最小化序列非必须地通过实施序列的随机的或定向的突变发生来提高结合亲和力或确定序列中的哪个位置对结合亲和力是绝对必要的而被优化。此外，通过序列中掺入修饰核苷酸来稳定适体分子抗体内的退化作用来实施选择。
2’改进的SELEXTM为了适于作为治疗剂使用的适体，优选合成便宜的、体内安全和稳定的。由于敏感野生型RNA和DNA适体对核酸酶的降解作用，它们一般在体内不稳定。抗核酸酶降解能通过在2′-位掺入修饰基团而很大程度提高。氟代和氨基已经成功的掺入到寡核苷酸文库中，适体随后被选出。然而，这些修饰大大提到了得到的适体的合成成本，并且由于通过修饰寡核苷酸的降解修饰核苷酸能再循环进入宿主DNA中的可能性和作为DNA合成用基物的核苷酸后续使用而可能在一些病例中引入安全问题。在这里提供的含有2′-O-甲基(″2′-OMe″)核苷酸克服了许多缺陷。含有2′-OMe核苷酸的寡核苷酸具有抗核酸酶并合成便宜的。虽然2′-OMe在生物体系中是普遍存在的，天然聚合酶不接受作为生理条件酶作用物的2′-OMe NTPs，因此在2′-OMe核苷酸再循环进入宿主DNA中无安全问题。用于生成2′-修饰适体的SELEXTM方法在如2002年12月3日提出的美国临时专利申请No.60/430,761、2003年7月15日提出的美国临时专利申请No.60/487,474、2003年11月4日提出的美国临时专利申请No.60/517,039、2003年12月3日提出的美国专利申请No.10/729,581、和2004年6月21日提出的美国专利申请No.10/873,856名为2′-O-甲基取代核酸的体外选择方法中进行了描述，每个全部内容通过在此引述合并于本文中。本发明包括结合和调整IL-23和/或IL-12功能而生成比未修饰的寡核苷酸的酶降解和化学降解以及热降解和物理降解更稳定的寡核苷酸的适体，该IL-23和/或IL-12包含修饰的核苷酸(例如，具有在2′位修饰的核苷酸)。虽然在文库中有一些含有适体的2′-OMe的实施例(参见，如Green et ah，Current Biology 2，683-695，1995)，这些是由文库的修饰转录的体外选择而生成，其中C和U残基为2′-氟代(2′-F)取代的并且A和G残基为2′-OH。一旦功能序列被确定，每个A和G片断被检测对2′-OMe取代物的耐受性，具有A和G片断的适体被再合成，A和G片断耐作为2′-OMe片段的2′-OMe取代物。大部分适体的A和G片断在两步方式耐2′-OMe片段的取代物中生成，约20％不这样。因此，使用这种方法生成的适体易于包含2个到4个2′-OH片断，结果稳定性变差和合成的成本提高。通过加入修饰的核苷酸到生成用在寡核苷酸文库中的稳定寡核苷酸的转录反应中，适体采用SELEXTM方法(和/或一些它的变异和改善，包含在这里描述的那些)被选择和浓集，本发明的方法消除了稳定经选择适体寡核苷酸的需要(例如，通过用修饰的核苷酸再合成适体寡核苷酸)。在一个实施方案中，本发明提供了包括联合ATP、GTP、CTP、TTP、和UTP核苷酸的2′-OH、2′-F，、2′-脱氧、和2′-OMe修饰的适体。在另一个实施方案中，本发明提供了包括联合ATP9GTP、CTP、TTP、和UTP核苷酸的2′-OH、2′-F、2′-脱氧、2′-OMe、2′-NH2、和2′-甲氧基乙基修饰的适体。在另一个实施方案中，本发明提供了包括56联合ATP、GTP、CTP、TTP、和UTP核苷酸的2′-OH、2′-F、2′-脱氧、2′-OMe、2′-NH2、和2′-甲氧基乙基修饰的适体。本发明的2′修饰的适体使用修饰的聚合酶制得，例如，修饰的T7聚合酶制得，具有在呋喃糖2′位大体积取代的修饰聚合酶的加入率高于野生型聚合酶的加入率。例如，单一的突变体T7聚合酶(Y639F)容易利用作为酶作用物的2′脱氧、2′氨基、和2′氟代三磷酸核苷酸(NTPs)并且已经广泛地用于合成有许多用途的修饰RNAs，其中酪氨酸片断在639位已经改变为苯基丙氨酸。然而，被报道的这个突变体T7聚合酶易于利用大体积T-取代的三磷酸核苷酸(NTPs)如2′-OMe或2′-叠氮(2′-N3)取代。为加入大体积2′取代物，在位点784上具有组氨酸的双T7聚合酶突变体(Y639F/H784A)转变为丙氨酸片断，此外Y639F突变体已经进行了描述并且用在掺入修饰嘧啶NTPs的限制环境中，参见Padilla，R.and Sousa，R.，Nucleic Acids Res.，2002，30(24)138。在位点784上具有组氨酸的单突变体T7聚合酶(H784A)转变为丙氨酸片断也已经进行了描述。参见Padillaetα/.，Nucleic Acids Research，2002，30138。在Y639F/H784A双突变体和H784A单突变体T7聚合酶中，小氨基酸片断如丙氨酸的改变考虑到大体积核苷酸酶底物的加入如2′-OMe取代核苷酸。总的来说，已经发现在这里公开的条件下，Y693F单突变体能用于除了GTP外所有2′-OMe取代三磷酸核苷酸(NTPs)的加入并且Y639F/H784A双突变体能用于包含有GTP的所有2′-OMe取代三磷酸核苷酸(NTPs)的加入。期望在这里公开的条件下被使用时，H784A单突变体拥有类似于Y639F和Y639F/H784A类似的性质。2′-修饰寡核苷酸可完全由修饰核苷酸合成，或修饰核苷酸群合成。修饰可能是相同的或不同的。所有核苷酸可被修饰，并可包含相同修饰。所有的核苷酸可被修饰，但包含不同的修饰，例如，所有包含相同碱基的核苷酸可具有一种类型的修饰，而包含其他碱基的核苷酸可具有不同类型的修饰。所有嘌呤核苷酸可具有一种类型的修饰(或不修饰)，而所有嘧啶核苷酸具有另外的、不同类型的修饰(或不修饰)。这样，转录、或转录库使用任何组合的修饰来生成，包含如核糖核苷酸(2′-OH)、脱氧核糖核苷酸(2′-脱氧)、2′-F、和2′-OMe核苷酸。包含2′-OMe C和U以及2′-OHA和G的转录混合物统称″rRmY″混合物，并且从而所选择出的适体称为″rRmY″适体。含有脱氧A和G以及2′-OMe U和C的转录混合物统称″dRmY″混合物，并且从而选择出的适体统称″dRmY″适体。含有2′-OMeA、C、和U、以及2′-OH G的混合物统称指″rGmH″混合物，并且从而选择出的适体统称″rGmH″适体。可选其一的含有2′-OMe A、C、U和G和2′-OMe A、U和C和2′-FG的转录混合物统指“交替混合物”并且从此选择的适体统指“交替混合物”适体。含有2′-OMe A、U、C、和G的转录混合物统指″r/mGmH″，这里达到10％的G′是核糖核苷酸，从此选择的适体统指″r/mGmH″适体。含有2′-OMe A、U、和C、和2′-F G的转录混合物统指″fGmH″混合物并且从此选择的适体统指″fGmH″适体。含有2′-OMeA、U、和C、和脱氧G的转录混合物统指″dGmH″混合物并且在此选择的适体统指″dGmH″适体。含有脱氧A、和2′-OMe C、G和U的转录混合物统指″dAmB″混合物并且在此选择的适体统指″dAmB″适体，含有所有2′-OH核苷酸的转录混合物统指″rN″混合物并且在此选择的适体统指″rN″或″rRrY″适体。″mRmY″适体是含有所有2′-O-甲基核苷酸的适体并且通常来自，当可能时，用2′-OMe Gs经post--SELEXTM取代一些2′-OH Gs生成的r/mGmH寡核苷酸。优选的实施方案包括任何2′-OH、2′-脱氧和T-OMe的组合。一个更优选的实施方案包括任何2′-脱氧和2′-OMe的组合。甚至更优选的实施方案为2′-脱氧和2′-OMe的组合，其中嘧啶为2′-OMe嘧啶(如dRmY，mRmY或dGmH)。在筛选前(如，pre-SELEXTM修饰)，先向本发明的适体中掺入修饰的核苷酸。非必须地，本发明的适体能进一步采用post-SELEXTM修饰进行修饰，其中修饰核苷酸采用pre-SELEXTM修饰而被加入(例如在pre-SELEXTM修饰之后的post-SELEXTM修饰)。pre-SELEXTM修饰生成对SELEXTM靶标具有特异性的核酸配体并且也提高了体内稳定性。post-SELEXTM修饰，例如，修饰(如，切断、删除、取代或以前确定配体的附加的核苷酸修饰，该配体具有通过pre-SELEXTM修饰而被加入核苷酸)能在对核酸配体结合能力无不利影响情况下进一步导致体内稳定性的提高，该核酸配体具有通过pre-SELEXTM修饰而加入核苷酸。为在聚合酶接受2′-修饰三磷酸核苷酸(NTPs)的环境中生成2′-修饰(例如2′-OMe)RNA转录文库，优选的聚合酶为Y693F/H784A双突变体或Y693F单突变体。其他的聚合酶，特别显示出对大体积2′-取代物高度耐受性的那些聚合酶，也可在本发明中使用。这种聚合酶能通过测定它们在这里公开的转录条件下掺入修饰核苷酸的能力而进行筛选。许多因素已经被确定对这里公开的方法中的有效转录条件是重要的。例如，在前导序列被掺入到DNA转录5′端固定序列的5′端时观察到了生成修饰转录的提高，使得至少约合成转录前部的6个片断都是嘌呤。掺入修饰核苷酸的转录中另一个重要因素是2′-OH GTP的存在和浓度。转录能分为两阶段第一个阶段为开始，在NTP被加到GTP(或另一个取代的鸟嘌呤核苷)3’-羟基端而生成二核苷酸，然后二核苷酸被约10-12个核苷酸扩展；第二个阶段为延长，转录在加入约10-12个核苷酸之外进行。已经发现加入到含有过量2′-OMe GTP中的小量的2′-OHGTP足够使聚合酶使用2′-OH GTP开始转录，但一旦转录进入延长阶段，减少了2′-OMe和2′-OH GTP间的差异，并且超过2′-OH GTP的过量2′-OMe GTP允许2′-OMe GTP的主要加入。2′-OMe取代核苷酸加入到转录中的另一个重要因素为转录混合物中二价镁和锰的使用。氯化镁和氯化锰的浓度的不同组合已经发现影响2′-O-甲基化转录的生成，氯化镁和氯化锰的最佳浓度依靠NTPs的转录反应混合物的浓度，复合二价金属离子。为得到最大量的最大2′取代O-甲基化转录(例如，所有的A、C、和U和约90％的G核苷酸)，当每个NTP以0.5mM浓度存在时约5mM氯化镁和1.5mM氯化锰的浓度的优选的。当每个NTP浓度为1.0mM时，浓度约6.5mM氯化镁和2.0mM的氯化锰是优选的。当每个NTP浓度为2.0mM时，浓度为约9.6mM氯化镁和2.9mM氯化锰是优选的。在一些情况下，偏离这些浓度达到2倍仍给出显著数量的修饰转录。用GMP或鸟嘌呤核苷启动转录也是重要的。这种影响由聚合酶对启动核苷酸的特异性而产生。结果，在这种形式中生成的一些转录的5′-末端核苷酸可能为2′-OH G。GMP(或鸟嘌呤核苷)的优选浓度为0.5mM并且甚至更优选1mM。已经发现，在转录反应中含有PEG，优选含有PEG-8000对最大化修饰核苷酸的加入有利。为了2′-OMe ATP(100％)、UTP(100％)、CTP(100％)和GTP(-90％)(″r/mGmH″)最大加入到转录中，下面的条件是优选的200mMHEPES缓冲液、40mM DDT、2mM亚精胺、10％(w/v)PEG-8000、0.01％(w/v)Triton X-100，5mM MgCl2(在每个2′-OMe NTP的浓度是1.0mM情况下为6.5mM)、1.5mM MnCl2(在每个2′-OMe NTP的浓度为1.0mM情况下为2.0mM )、500μM 2′-OMe NTP(每个)(更优选1.0mM)、30μM2′-OH GTP、500μM 2′-OH GMP、pH7.5、Y639F/H784A T7 RNA聚合酶15units/mL、无机焦磷酸酶5units/mL和至少8个核苷酸长度的所有嘌呤前导序列。依据在这里使用的，一个单位的Y639F/H784A突变体T7 RNA聚合酶(或这里指定的一些其他的突变体T7 RNA聚合酶)被定义为酶的量，在r/mGmH条件下酶需要加入1nmole 2′-OMe NTPs到转录中。依据在这里使用的，一个单位的无机焦磷酸酶定义为酶的量，酶在pH值为7.2和在25℃时每分钟将释放1.0摩尔的无机正磷酸盐。为了2′-OMeATP、UTP和CTP最大量加入到转录中，下面条件是优选的200mM HEPES缓冲液、40mM DDT、2mM亚精胺、10％(w/v)PEG-8000、0.01％(w/v)Triton X-100，5mM MgCl2(在每个2′-OMeNTP的浓度是2.0mM情况下为9.6mM)、1.5mM MnCl2(在每个2′-OMeNTP的浓度为2.0mM情况下为2.9mM)、500μM2′-OMe NTP(每个)(更优选2.0mM)、pH值7.5、Y639F T7RNA聚合酶15units/mL、无机焦磷酸酶5units/mL和至少8个核苷酸长度的全嘌呤前导序列。为了2′-OMe UTP和CTP(″rRmY″)最大量加入到转录中，下面的条件是优选的200mM HEPES缓冲液、40mM DDT、2mM亚精胺、10％(w/v)PEG-8000、0.01％(w/v)Triton X-100，5mM MgCl2(在每个2′-OMeNTP的浓度是2.0mM情况下为9.6mM)、1.5mM MnCl2(在每个2′-OMeNTP的浓度为2.0mM情况下为2.9mM)、500μM2′-OMe NTP(每个)(更优选2.0mM)、pH7.5、Y639F/H784A T7 RNA聚合酶15units/mL、无机焦磷酸酶5units/mL和至少8个核苷酸长度的全嘌呤前导序列。为了脱氧ATP和GTP和2′-OMe UTP和CTP(″dRniY″)最大量的加入到转录中，下面的条件是优选的200mM HEPES缓冲液、40mMDDT、2mM亚精胺、10％(w/v)PEG-8000、0.01％(w/v)Triton X-100，9.6mMMgCl2、2.9mM MnCl2、2.0mM 2′-0OMe NTP(每个)、pH值7.5、Y639FT7RNA聚合酶15units/mL、无机焦磷酸酶5units/mL和至少8个核苷酸长度的全嘌呤前导序列。为了2′-OMe ATP、UTP和CTP和2′-F GTP(″fGmH″)最大量的加入到转录中，下面的条件是优选的200mM HEPES缓冲液、40mMDDT、2mM亚精胺、10％(w/v)PEG-8000、0.01％(w/v)Triton X-100，9.6mMMgCl2、2.9mM MnCl2、2.0mM 2′-OMe NTP (每个)、pH值7.5、Y639FT7RNA聚合酶15units/mL、无机焦磷酸酶5units/mL和至少8个核苷酸长度的全嘌呤前导序列。为了脱氧ATP和2′-OMe UTP、GTP和CTP(″dAmB″)最大量的加入到转录中，下面的条件是优选的200mM HEPES缓冲液、40mMDDT、2mM亚精胺、10％(w/v)PEG-8000、0.01％(w/v)Triton X-100，9.6mMMgCl2、2.9mM MnCl2、2.0mM 2′-OMe NTP(每个)、pH 7.5、Y639F T7RNA聚合酶15units/mL、无机焦磷酸酶5units/mL和至少8个核苷酸长度的全嘌呤前导序列。为了上面(a)转录中的每一个在约20℃到约50℃的温度下，优选约30℃到45℃下，更优选在约37℃下优选实施至少2个小时时间并(b)使用50-300nM的双链DNA转录模板(200nM模板用在孔板1中来提高多样性(300nM模板用在dRmY转录中))，为随后孔板为20nM，使用优化的PCR反应的1/10稀释液，使用这里描述的条件)。优选的DNA转录模板在下面进行了描述(ARC254和ARC256在所有2′-OMe环境下转录并且ARC255在rRmY环境下转录)。
SEQ ID NO 1(ARC254)5’-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’SEQ ID NO 2(ARC255)5’-CATGCATCGCGACTGACTAGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’SEQ ID NO 3(ARC256)5’-CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’
在本发明的rN转录环境下，转录反应混合物包括2′-OH腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、2′-OH鸟苷三磷酸(GTP)、2′-OH胞苷三磷酸(CTP)、和2′-OH尿苷三磷酸(UTP)。使用本发明的rN转录混合物生成的修饰寡核苷酸包括充分地所有2′-OH腺苷、2′-OH鸟苷、2′-OH胞啶、和2′-OH尿苷。在rN转录的优选实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列至少所有腺苷核苷酸的80％为2′-OH腺苷，至少所有鸟苷核苷酸的80％为2′-OH鸟苷，至少所有胞啶核苷酸的80％为2′-OH胞啶，并且所有尿苷核苷酸的至少80％为2′-OH尿苷。在rN转录的一个更优选的实施方案中，得到的本发明的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列至少所有腺苷核苷酸的90％为2′-OH腺苷，至少所有鸟苷核苷酸的90％为2′-OH鸟苷，至少所有胞啶核苷酸的90％为2′-OH胞啶，并且所有尿苷核苷酸的至少90％为2′-OH尿苷。在rN转录的一个最优选的实施方案中，得到的本发明的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列至少所有腺苷核苷酸的100％为2′-OH腺苷，至少所有鸟苷核苷酸的100％为2′-OH鸟苷，至少所有胞啶核苷酸的100％为2′-OH胞啶，并且所有尿苷核苷酸的至少100％为2′-OH尿苷。在本发明的rRmY转录环境下，转录反应混合物包括2′-OH腺嘌呤核苷三磷酸、2′-OH鸟苷三磷酸、2′-O-甲基胞苷三磷酸、和2′-O-甲基尿苷三磷酸。使用本发明的rRmY转录混合物生成的修饰寡核苷酸包括充分的所有2′-OH腺苷、2′-OH鸟苷、2′-O-甲基胞啶、和2′-O-甲基尿苷。在一个优选实施方案中，得到修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列包括至少所有腺苷核苷酸的80％为2′-OH腺苷，至少所有鸟苷核苷酸的80％为2′-OH鸟苷，至少所有胞啶核苷酸的80％为2′-O-甲基胞啶，并且所有尿苷核苷酸的至少80％为2′-O-甲基尿苷。在一个更优选的实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列至少所有腺苷核苷酸的90％为2′-OH腺苷，至少所有鸟苷核苷酸的90％为2′-OH鸟苷，至少所有胞啶核苷酸的90％为2′-O-甲基胞啶，并且所有尿苷核苷酸的至少90％为2′-O-甲基尿苷。在一个最优选的实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，至少所有腺苷核苷酸的100％为2′-OH腺苷，至少所有鸟苷核苷酸的100％为2′-OH鸟苷，至少所有胞啶核苷酸的100％为2′-O-甲基胞啶，并且所有尿苷核苷酸的至少100％为2′-O-甲基尿苷。在本发明的dRmY转录环境下，转录反应混合物包括2′-脱氧腺嘌呤核苷三磷酸、2′-脱氧鸟苷三磷酸、2′-O-甲基胞苷三磷酸、和2′-O-甲基尿苷三磷酸。使用本发明的dRmY转录环境生成的修饰寡核苷酸包括充分的所有2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、2′-O-甲基胞啶、和2′-O-甲基尿苷。在一个优选实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列至少所有腺苷核苷酸的80％为2′脱氧腺苷，至少所有鸟苷核苷酸的80％为2′-脱氧鸟苷，至少所有胞啶核苷酸的80％为2′-O-甲基胞啶，并且所有尿苷核苷酸的至少80％为2′-O-甲基尿苷。在一个更优选的实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列至少所有腺苷核苷酸的90％为2′-脱氧腺苷，至少所有鸟苷核苷酸的90％为2′-脱氧鸟苷，该序列中至少所有胞啶核苷酸的90％为2′-O-甲基胞啶，并且所有尿苷核苷酸的至少90％为2′-O-甲基尿苷。在一个最优选的实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列中至少所有腺苷核苷酸的100％为2′-脱氧腺苷，至少所有鸟苷核苷酸的100％为2′-脱氧鸟苷，至少所有胞啶核苷酸的100％为2′-O-甲基胞啶，并且所有尿苷核苷酸的至少100％为2′-O-甲基尿苷。在本发明的rGmH转录环境下，转录反应混合物包括2′-OH鸟苷三磷酸、2′-O-甲基胞苷三磷酸、2′-O-甲基尿苷三磷酸、和2′-O-甲基腺嘌呤核苷三磷酸。使用本发明的rGmH转录环境生成的修饰寡核苷酸包括充分的所有2′OH鸟苷、2′-O-甲基胞啶、2′-O-甲基尿苷、和2′-O-甲基腺苷。在一个优选实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列该序列中至少所有鸟苷核苷酸的80％为2′OH鸟苷，至少所有胞啶核苷酸的80％为2′-O-甲基胞啶，并且所有尿苷核苷酸的至少80％为2′-O-甲基尿苷，和至少所有腺苷核苷酸的80％为2′-O-甲基腺苷。在一个更优选的实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列至少所有鸟苷核苷酸的90％为2′-OH鸟苷，至少所有胞啶核苷酸的90％为2′-O-甲基胞啶，至少所有尿苷核苷酸的至少90％为2′-O-甲基尿苷，并且至少所有腺苷核苷酸的90％为2′-O-甲基腺苷。在一个最优选的实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列中至少所有鸟苷核苷酸的100％为2′-OH鸟苷，至少所有胞啶核苷酸的100％为2′-O-甲基胞啶，至少所有尿苷核苷酸的100％为2′-O-甲基尿苷，并且至少所有腺苷核苷酸的100％为2′-O-甲基腺苷。在本发明的r/mGmH转录环境下，转录反应混合物包括2′-O-甲基腺嘌呤核苷三磷酸、2′-O-甲基胞苷三磷酸、2′-O-甲基鸟苷三磷酸、和2′-O-甲基尿苷三磷酸和T-OH鸟苷三磷酸。使用本发明的r/mGmH转录混合物生成的修饰寡核苷酸包括充分的所有2′-O-甲基腺苷、2′-O-甲基胞啶、2′-O-甲基鸟苷、和2′-O-甲基尿苷，其中鸟苷核苷酸总量有约10％2′-OH鸟苷的最大量。在一个优选实施方案中，得到的本发明修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列至少所有腺苷核苷酸的80％为2′-O-甲基腺苷，至少所有胞啶核苷酸的80％为2′-O-甲基胞啶，至少所有鸟苷核苷酸的80％为2′-O-甲基鸟苷，并且所有尿苷核苷酸的至少80％为2′-O-甲基尿苷，并且只是所有约鸟苷核苷酸的10％为2′-OH鸟苷。在一个更优选的实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列至少所有腺苷核苷酸的90％为2′-O-甲基腺苷，至少所有胞啶核苷酸的90％为2′-O-甲基胞啶，至少所有鸟苷核苷酸的90％为2′-O-甲基鸟苷，所有尿苷核苷酸的至少90％为2′-O-甲基尿苷，并且只是所有约鸟苷核苷酸的10％为2′-OH鸟苷。在一个最优选的实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列中至少所有腺苷核苷酸的100％为2′-O-甲基腺苷，至少所有胞啶核苷酸的100％为2′-O-甲基胞啶，至少所有鸟苷核苷酸的100％为2′-O-甲基鸟苷，并且所有尿苷核苷酸的至少100％为2′-O-甲基尿苷，并且只是所有约鸟苷核苷酸的10％为2′-OH鸟苷。在本发明的fGmH转录环境下，转录反应混合物包括2′-O-甲基腺嘌呤核苷三磷酸、2′-O-甲基尿苷三磷酸、2′-O-甲基胞苷三磷酸、和2′-F鸟苷三磷酸。使用本发明的fGmH转录环境生成的修饰寡核苷酸包括充分的所有2′-O-甲基腺苷、2′-O-甲基尿苷、2′-O-甲基胞啶、和2′-F鸟苷。在一个优选实施方案中，得到的本发明修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列至少所有腺苷核苷酸的80％为2′-O-甲基腺苷，至少所有尿苷核苷酸的80％为2′-O-甲基尿苷，至少所有胞啶核苷酸的80％为2′-O-甲基胞啶，并且至少所有鸟苷核苷酸的80％为2′-F鸟苷。在一个更优选的实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列至少所有腺苷核苷酸的90％为2′-O-甲基腺苷，至少所有尿苷核苷酸的90％为2′-O-甲基尿苷，至少所有胞啶核苷酸的90％为2′-O-甲基胞啶，并且至少所有鸟苷核苷酸的90％为2′-O-甲基鸟苷，并且只是所有约鸟苷核苷酸的10％为2′-F鸟苷。在一个最优选的实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列中至少所有腺苷核苷酸的100％为2′-O-甲基腺苷，至少所有尿苷核苷酸的100％为2′-O-甲基尿苷，至少所有胞啶核苷酸的100％为2′-O-甲基胞啶，至少所有鸟苷核苷酸的100％为2′-F鸟苷。在本发明的dAmB转录环境下，转录反应混合物包括2′-脱氧腺嘌呤核苷三磷酸、2′-O-甲基胞苷三磷酸、2′-O-甲基鸟苷三磷酸、和2′-O-甲基尿苷三磷酸和T-OH鸟苷三磷酸。使用本发明的dAmB转录混合物生成的修饰寡核苷酸包括充分的所有2′-脱氧腺苷、2′-O-甲基胞啶、2′-O-甲基鸟苷、和2′-O-甲基尿苷。在一个优选实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列至少所有腺苷核苷酸的80％为2′-脱氧腺苷，至少所有胞啶核苷酸的80％为2′-O-甲基胞啶，至少所有鸟苷核苷酸的80％为2′-O-甲基鸟苷，并且所有尿苷核苷酸的至少80％为2′-O-甲基尿苷。在一个更优选的实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列至少所有腺苷核苷酸的90％为2′-脱氧腺苷，至少所有胞啶核苷酸的90％为2′-O-甲基胞啶，至少所有鸟苷核苷酸的90％为2′-O-甲基鸟苷，并且至少所有尿苷核苷酸的90％为2′-O-甲基尿苷。在一个最优选的实施方案中，得到的修饰寡核苷酸包括一种序列，该序列中至少所有腺苷核苷酸的100％为2′-脱氧腺苷，至少所有胞啶核苷酸的100％为2′-O-甲基胞啶，至少所有鸟苷核苷酸的100％为2′-F鸟苷，至少所有尿苷核苷酸的100％为2′-O-甲基尿苷。在一些情况下，转录产物能用于SELEXTTM法中的文库来鉴定适体和/或确定对给定靶标具有特异性的序列的保守序列。得到的序列部分稳定，从该方法中除去了这个步骤而到达最佳适体序列，结果给出更加高度稳定适体。2′-OMe SELEXTM法的另一个优势为得到的序列可能具有较少的序列中必需的2′-OH核苷酸，可能一个也没有。为了保持2′OH核苷酸的范围，通过实施post-SELEXTM修饰而除去2′OH核苷酸。依据下面描述的，较低但仍有效的充分加入2′取代核苷酸的转录的生成量在该环境下而非上面描述的最佳环境下得到。例如，上面转录环境的变化包含
HEPES缓冲液浓度在0到1M。本发明也考虑其他缓冲剂的使用，这种其他缓冲剂具有pKa值在5到10之间，例如，三羟甲基氨基甲烷。DTT浓度在0到400mM范围内变化。本发明的方法也提供了其他还原剂包含，如巯基乙醇。亚精胺和/或精胺浓度在0到20mM间变化。PEG-8000浓度范围在0到50％(w/v)之间。本发明的方法也提供了其他亲水性聚合物的使用，其包含，例如，其他的分子量的PEG或其他的聚乙二醇。TritonX-100浓度范围在0到0.1％(w/v)之间。本发明的方法也提供了其他非离子去污剂的使用包含，如其他去污剂，包含其他的Triton-X去污剂。MgCl2浓度范围在0.5mM到50mM之间。MnCl2浓度范围在0.15mM到15mM之间。MgCl2和MnCl2必须在描述的范围内，并且在一个优选实施方案中MgCl2∶MnCl2以约10到约3的比值存在，优选，比值为约3-5∶1，更优选，比值为约3-4∶1。2′-OMe NTP浓度(每个NTP)范围在5μM到5mM之间。2′-OH GTP浓度范围在0μM到300μM之间。2′-OH GMP浓度范围在0到5mM之间。pH值范围在pH 6到pH 9之间。本发明的方法能在聚合酶加入修饰核苷酸的最活跃pH范围内进行。此外，本发明的方法提供了在转录反应环境中非必需的螯合剂的使用，该螯合剂包含，如EDTA、EGTA、和DTT。
IL-23和/或IL-12适体筛选方法
技术领域：
本发明提供了结合人类IL-23和/或IL-12的适体，在一些实施方案中，抑制结合其受体和/或另外调节其功能。人类IL-23和IL-12都是具有一个相同亚基和一个区别亚基的杂二聚体。相同的亚基为p40亚基，其包括下面氨基酸序列(登录号#AF 180563)(SEQ ID NO 4)MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS.
p19亚基对IL-23是区别的并且包含下面氨基酸序列(登录号#BC067511)(SEQ ID NO 5)MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS.p35亚基对IL-12是区别的并且包含下面氨基酸序列(登录号#AF 180562)(SEQ ID NO 6)MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS.本发明也提供了结合小鼠IL-23和/或IL-12的适体并且在一些实施方案中，抑制结合其受体和/或另外调节其功能。像人类、小鼠IL-23和IL-12都是杂二聚体，该杂二聚体共享小鼠p40亚基，然而小鼠p19亚基对小鼠IL-23具有特异性并且小鼠p35亚基对小鼠IL-12是独一无二的。小鼠p40亚基包含下面氨基酸序列(登录号#P43432)(SEQ ID NO315)
MCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS
小鼠p19亚基包含下面氨基酸序列(登录号#NP1 12542)(SEQ ID NO 316)MLDCRAVIMLWLLPWVTQGLAVPRSSSPDWAQCQQLSRNLCMLAWNAHAPAGHMNLLREEEDEETKNNVPRIQCEDGCDPQGLKDNSQFCLQRIRQGLAFYKHLLDSDIFKGEPALLPDSPMEQLHTSLLGLSQLLQPEDHPRETQQMPSLSSSQQWQRPLLRSKILRSLQAFLAIAARVFAHGAATLTEPLVPTA
小鼠p35亚基包含下面氨基酸序列(登录号#P43431)(SEQID NO 317)MCQSRYLLFLATLALLNHLSLARVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSA
一些SELEXTM方案能用于生成对IL-23和IL-12具有多种特异性的适体。一种设计通过使IL-12包含在负向选择步骤中而生成对IL-23比IL-12更具有特异性的适体。这去除了认知普通亚基p40(SEQ ID NO 4)的序列，并选择对IL-23或p19亚基具有特异性的适体，如在图3中显示出的。一种设计通过使IL-23包含在阴性筛选步骤中而生成对IL-12比IL-23更具有特异性的适体。这去除了认知普通亚基p40(SEQ ID NO 4)的序列，并选择对IL-12或p35亚基(SEQ ID NO 6)具有特异性的适体。分离筛选得到认知普通亚基p40(SEQ ID NO 4)的适体，并因此认知两种蛋白，分离筛选中IL-23和IL-12交替进行。已经发现具有预期结合特异性的序列，这些序列的最小化能系统减少序列尺寸并伴有结合能力的提高。依据下面实施例中描述的生物测定证实的具有最高亲和性和特异性粘结性的经筛选的适体是适宜治疗条件的治疗剂，其中IL-23和/或IL-12与发病机理有关。
IL-23/IL-12特异性结合适体
本发明的材料包括一系列具有25-90个核苷酸长度的核酸适体，该适体特异性结合人类IL-12细胞因子家族的细胞因子，该人类IL-12细胞因子家族包含IL-12、IL-23、和IL-27；p19、p35、和p40亚基单体；和p40亚基二聚体；并且该适体功能性调节，如，阻塞、体内和/或细胞试验中的IL-23和/或IL-12活性。能特异性结合和调节IL-23和/或IL-12的适体在这里进行了阐述。这些适体提供了低毒性、安全、和治疗和/或预防自体免疫和炎性相关疾病和紊乱。在一个实施方案中，本发明的适体用于治疗和/或预防炎性和自体免疫疾病，包含但不限于，多重硬化症、风湿性关节炎、寻常性银屑病、和肠易激综合征，包含但不限于克隆氏症、和溃疡性结肠炎，周知每一个能由IL-23和/或IL-12细胞因子引发或与其相关。在另一个实施方案中，本发明的适体用于治疗和/或预防I型糖尿病、周知其由IL-23和/或IL-12细胞因子引发或与其相关。在另一个实施方案中，本发明的适体用于治疗和/或预防其他的细胞因子受体结合性活化的迹象，其包含，如全身红斑性狼疮、结肠癌、肺癌、和骨质疏松症中的骨吸收。用作治疗剂和/或诊断学的IL-23和/或IL-12特异性结合适体的实施例包括下面列出的序列。如非另外指出，ARC489(SEQ ID NO 91)、ARC491(SEQ IDNO 94)、ARC621(SEQ ID NO 108)、ARC627(SEQ ID NO 110)、ARC527(SEQ IDNO 159)、ARC792(SEQ ID NO 162)、ARC794(SEQ ID NO 164)、ARC795(SEQ ID NO 165)、ARC979(SEQ ID NO 177)、ARC1386(SEQ IDNO 224)、和ARC1623-ARC1625(SEQ ID NOs 309-311)代表结合IL-23和/或IL-12的适体的序列，该适体经SELEXTM条件下选出，其中嘌呤(A和G)为脱氧，和嘧啶(C和U)为2′-OMe。ARC489(SEQ ID NO 91)和ARC491(SEQ ID NO 94)独一无二序列区在23位核苷酸处开始，紧接序列GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(SEQ ID NO 69)，并且一直到遇到3′固定核酸序列GCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG(SEQ ID NO 90)时为止。ARC621(SEQ ID NO 108)和ARC627(SEQ ID NO 110)独一无二序列区在23位核苷酸处开始，紧接序列GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(SEQ ID NO 101)，并且直到遇到3′固定核酸序列GUCGAUCGAUCGAUCA UC GAUG(SEQ ID NO 102)时为止。
SEQ ID NO 91(ARC489)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGCGCCGGUGGGCGGGCAUUGGGUGGAUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 94(ARC491)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGCGCCGGUGGGUGGGCAUAGGGUGGAUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 108(ARC621)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCGGUUACGGGGGAUGCGGGUGGGACAGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 110(ARC627)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCAAGUAAUUGGGGAGUGCGGGCGGGGUGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 159(ARC527)ACAGCGCCGGUGGGCGGGCAUUGGGUGGAUGCGCUGUSEQ ID NO 162(ARC792)GGCAAGUAAUUGGGGAGUGCGGGCGGGGSEQ ID NO 164(ARC794)GGCGGUACGGGGAGUGUGGGUUGGGGCCGGSEQ ID NO 165(ARC795)CGAUAUAGGCGGUACGGGGGGAGUGGGCUGGGGUCGSEQ ID NO 177(ARC979)ACAGGCAAGUAAUUGGGGAGUGCGGGCGGGGUGU
ARC1623(SEQ ID NO 309)、ARC1624(SEQ ID NO 310)和ARC1625(SEQ ID NO 311)代表基于ARC979(SEQ ID NO 177)的最佳序列，此情况下″d″代表脱氧，″m″代表2′-O-甲基，″s″表明硫代磷酸核苷酸内键合，并且″3T″代表3′-倒位脱氧胸苷。
SEQ ID NO 309(ARC1623)dAmCdAdGdGmCdAdAdGmUdAdAmUmUdGmGmG-s-dG-s-dA-s-dGmU-s-dGmCmGmGdGmCdGdGmGmGmUdGmU-3TSEQ ID NO 310(ARC1624)dAmCdAdGdGmCdAdAdGmUdAdAmUmUdGmGmGdGdAdGmUdGmCmGmG-s-dGmC-s-dG-s-dGmGmGmUdGmU-3TSEQ ID NO 311(ARC1625)dAmCdAdGdGmCdAdAdGmUdAdAmUmUdGmGmGdGdAdGmUdGmCmGmGdGmCdGdGmGmGmU-s-dGmU-3TSEQ ID NOS 139-140、SEQ ID NOS 144-145、SEQ ID NO 147、和SEQ ID NOS 151-152代表结合IL-23和/或IL-12的适体的序列，该序列在SELEXTM条件下筛选出，其中嘌呤(A和G)为2′-OH(核糖)并且嘧啶(C和U)为2’-氟。
SEQ ID NO 139(A10.min5)GGAGCAUACACAAGAAGUUUUUUGUGCUCUGAGUACUCAGCGUCCGUAAGGGAUAUGCUCCSEQ ID NO 140(A10.min6)GGAGUACGCCGAAAGGCGCUCUGAGUACUCAGCGUCCGUAAGGGAUACUCCSEQ ID NO 144(B10.min4)GGAGCAUACACAAGAAGUGCUUCAUGCGGCAAACUGCAUGACGUCGAAUAGAUAUGCUCCSEQ ID NO 145(B10.min5)GGAGUACACAAGAAGUGCUUCCGAAAGGACGUCGAAUAGAUACUCCSEQ ID NO 147(F11.min2)GGACAUACACAAGAUGUGCUUGAGUUAAAUCUCAUCGUCCCCGUUUGGGGAUAUGUCSEQ ID NO 151GGGUACGCCGAAAGGCGCUUCCGAAAGGACGUCCGUAAGGGAUACCCSEQ ID NO 152GGAGUACGCCGAAAGGCGCUUCCGAAAGGACGUCCGUAAGGGAUACUCC
结合IL-23和/或IL-12的其他的适体在下面的实施例1-3进行了描述。这些适体可包括这里描述的修饰，如与亲脂性或高分子量化合物结合(如，PEG)，加入CpG基序，加入封堵基，加入修饰核苷酸，并且在骨架磷酸基团加入硫代磷酸。在一个实施方案中，提供了结合IL-23和/或IL-12独立的、非天然生成的适体。在一些实施方案中，独立的、非天然生成的适体具有IL-23和/或IL-12的离解常数(″KD″)小于100μM、小于1μM、小于500nM、小于100nM、小于50nM、小于1nM、小于500pM、小于100pM并小于50pM。在本发明的一些实施方案中，通过下面实施例1中描述的dot-blot滴定法确定离解常数。在另一个实施方案中，本发明的适体调节IL-23和/或IL-12的功能。在另一个实施方案中，本发明的适体抑制IL-23和/或IL-12功能而在另一个实施方案中，适体激发靶标的功能。在本发明的另一个实施方案中，适体结合和/或调解IL-23或IL-12变异体的功能。在这里使用的IL-23或IL-12变异体包括执行与IL-23或IL-12功能基本相同的功能，优选包括大体上相同的功能并且在一些实施方案中，包括至少70％同源序列，优选至少80％同源序列，更优选至少90％同源序列，并且更优选至少95％序列与IL-23或IL-12氨基酸序列同源。在本发明的一些实施方案中，靶标变异体的等同序列使用按照下面描述的BLAST进行确定。两个或多个核酸或蛋白序列的术语″同源序列″，统指两个或多个序列或子序列相同或具有确定百分比氨基酸片断或核苷酸是相同的，当比较和校准最大化的一致性时，依据使用下面序列比对演算法或通过目测检查进行测量。为序列比对，一般一个序列起到作为进行比对的测试序列的参照序列作用。当使用序列比对演算法时，测试和参照序列输入电脑中，如果必要时设计序列坐标，并且设计序列演算法程序参数。最佳的比对序列演算法能进行实施，例如，通过Smith & Waterman提出的局部同源演算法实施，Adv.Appl.Math.2482(1981)，通过Pearson & Lipman提出的类似方法的探索进行实施Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 852444(1988)，通过计算机执行这些演算法(Wisconsin遗传学分析软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，或通过目测检查(一般参见，Ausubel et al.，下文介绍)。适于确定序列同源性的百分比的演算法的一个实施例是用在基本局部演算法搜索库中的演算法(下文中的″BLAST″)，参见，如Altschulet a1，J Mol.Biol.215403-410(1990)and Altschul et al.，Nucleic Acids Res.，153389-3402(1997)。执行BLAST分析法的软件能从国家生物技术情报中心获得(下文中的″NCBI″)。用在确定的同源序列中的默认参数使用软件从NCBI中获得，例如，BLASTN(用于核苷酸序列)和BLASTP(用于氨基酸序列)在McGinnis et a1.，Nucleic Acids Res.，32W20-W25(2004)中进行了描述。在本发明的一个实施方案中，适体具有与包括了SEQ ID NOs13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ ID NOs 91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQID NOs 124-134、SEQ ID NOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs164-172、SEQ ID NOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs199-314中任何一个的适体基本相同的结合IL-23的能力。在本发明的另一个实施方案中，适体具有与包括了SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs71-88、SEQ ID NOs 91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-134、SEQ ID NOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs 164-172、SEQ IDNOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs 199-314中的任何一个适体基本相同的结构和结合IL-23的能力。在本发明的一个实施方案中，适体具有与包括了SEQ ID NO14、SEQ ID NOs 17-19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NOs 27-32、SEQ ID NOs34-40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 49、SEQ ID NOs 60-61、SEQ ID NOs91-92、SEQ ID NO 94、和SEQ ID NOs 103-118中的任何一个的适体基本相同的结合IL-23和/或IL-12的能力。在本发明的另一个实施方案中，适体具有与包括了SEQ ID NO 14、SEQ ID NOs 17-19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NOs 27-32、SEQ ID NOs 34-40、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 49、SEQ ID NOs 60-61、SEQ ID NOs 91-92、SEQ ID NO 94、和SEQ ID NOs103-118中的任何一个基本相同的结构和结合IL-23和/或IL-12的能力。在另一个实施方案中，本发明的适体用作制药组合物中的活性成分。在另一个实施方案中，包括本发明适体的适体或组合物用于治疗炎性和自体免疫疾病(包含但不限于，多重硬化症、风湿性关节炎、寻常性银屑病、全身红斑性狼疮，包括含但不限于克隆氏症、和溃疡性结肠炎)、I型糖尿病、结肠癌、肺癌、和骨质疏松症中的骨吸收。在一些实施方案中，本发明的适体治疗剂具有对其靶标巨大的亲和力和特异性，如果适体治疗剂破坏了患者或主体的身体而其减少了来自非天然生成的核苷酸取代物的有害不良反应。在一些实施方案中，包含本发明适体治疗剂的治疗组合物无氟化核苷酸或已经减少了氟化核苷酸的用量。本发明的适体能使用一些本领域周知的寡核苷酸合成技术来合成制得，包含固相寡核苷酸合成技术(参见，如Froehler et ah，Nucl.AcidRes.145399-5467(1986)and Froehler et ah，Tet.Lett.275575-5578(1986))和本领域中周知的液相法如三酯合成法(参见，如Sood et ah，Nucl.AcidRes.42557(1977)and Hirose et ah，Tet.Lett.，282449(1978))。
具有免疫刺激基序的适体
本发明提供了结合IL-23和/或IL-12的适体并调节其生物功能。更具体地，本发明提供了提高IL-23和/或IL-12对IL-23和/或IL-12受体的结合能力从而增强IL-23和/或IL-12生物功能的适体。通过筛选结合IL-23和/或IL-12并包含免疫刺激基序的适体，或通过采用结合IL-23和/或IL-12的适体联合已知结合免疫刺激序列的靶标的适体来进一步增强这种适体的竞争作用
通过脊椎动物免疫体系来认知细菌DNA是以具有特殊序列关系的未甲基化CG二核苷酸(″CpG基序″)的认知为基础的。认知这种基序的受体之一是Toll样受体9(″TLR 9″)，Toll样受体家族66成员(-10members)通过不同微生物组分参与先天性免疫反应。TLR 9结合特异性序列方式的未甲基化寡核苷酸(″ODN″)CpG序列。CpG基序的认知启动导致先天性和最终需要的免疫反应的防御机制。例如，老鼠TLR 9的活化诱发抗原呈递细胞的活化，上调MHC一类和二类和重要的共刺激分子的表达和含有IL-12和IL-23的细胞因子。这种活化直接和间接提高了B和T细胞反应，包含TH1细胞因子γ-IFN的鲁棒上调。同样地，CpG序列的反应导致传染疾病防御、提高对疫苗的免疫反应，抗哮喘的有效反应和提高抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。因此，CpG ODNs能提供抗传染疾病的保护，作为免疫佐剂或癌症疗法剂(单一治疗或与mAb或其他治疗联合)功能，并且能减少哮喘和过敏反应。包括一个或多个CpG或其他免疫激活序列的本发明适体能通过多种方案进行鉴定或生成，例如，使用这里描述的SELEXTM法。加入的免疫激活序列可为DNA、RNA和/或DNA/RNA的联合。总的来说，方案能分为两组。在第一组中，方案能直接鉴定或生成包括CpG基序或其他免疫激活序列以及靶标结合位点的适体，此情况下靶标(下文中“非-CpG靶标”)为一个靶而非周知的认知CpG基序或其他免疫激活序列的靶标和周知的一结合CpG基序就激活免疫反应的靶标。在本发明的一些实施方案中，非-CpG靶标为IL-23和/或IL 12靶标。这个组的第一个方案包括实施SELEXTM利用寡核苷酸库来获得特异性非-CpG靶标，优选靶标，如IL-23和/或IL-12的适体，被抑制的免疫反应与疾病的发展有关，其中CpG基序已经加进库的每个成员中作为固定域，或部分固定域，例如在一些实施方案中，库成员的随机区域包括具有加入CpG基序的固定域。这个组的第二个方案包括实施SELEXTM来获得特异性非-CpG靶标优选如IL-23和/或IL-12靶的适体，在此情况下抑制免疫反应与疾病发展相关，并且随后选择在5′和/或3′末端添加CpG基序或将CpG基序工程加入到适体区域中，优选适体的非必需区。这个组的第三个方案包括实施SELEXTM来获得特异性非-CpG靶标优选如IL-23和/或IL-12靶的适体，其中在库合成期间，不同核苷酸的摩尔比值在一个或多个核苷酸附加步骤中有偏差使得每个库成员的随机区域在CpG基序富集，并鉴定出包括CpG基序的适体。这个组的第四个方案包括实施SELEXTM来获得特异性非-CpG靶标优选如IL-23和/或IL-12靶的适体，此情况下被移植的免疫反应与疾病的发展有关，并包括鉴定包括CpG基序适体。这个组的第五个方案包括实施SELEXTM来获得特异性非-CpG靶标优选如IL-23和/或IL-12靶的适体，此情况下被抑制的免疫反应与疾病的发展有关，并包括鉴定适体，该适体一经结合，刺激免疫反应但不包括CpG基序。在第二组中，方案直接鉴定或生成包括CpG基序和/或其他序列的适体，该适体与CpG基序受体结合(例如，TLR9或其他toll样受体)并一经结合刺激免疫反应。这个组的第一个方案包括实施SELEXTM来获得周知结合CpG基序或其他免疫激活序列的靶标的适体并且是使用寡核苷酸库一经结合就刺激免疫反应，其中CpG基序已经被加入到每个库成员中作为固定区域，或部分固定区域，例如，在一些实施方案中，库成员的随机区域包括具有加入CpG基序的固定区域，并鉴定包括CpG基序的适体。这个组的第二个方案包括实施SELEXTM来获得周知的结合CpG基序或其他免疫激活序列的靶标的适体并且一经结合就刺激免疫反应的适体，然后在5′和/或3′末端添加CpG基序或将CpG基序工程加入到适体区域中，优选适体的非必需区。这个组的第三个方案包括实施SELEXTM来获得周知结合CpG基序或其他免疫激活序列的靶标的适体并且一经结合就刺激免疫反应的适体，其中在库合成期间，不同核苷酸的摩尔比值在一个或多个核苷酸附加步骤中有偏差使得每个库成员的随机区域在CpG基序富集，并鉴定出包括CpG基序的适体。这个组的第四个方案包括实施SELEXTM来获得周知的结合CpG基序或其他免疫激活序列的靶标的适体并且一经结合就刺激免疫反应的适体，并鉴定包括CpG基序的适体。这个组的第五个方案包括实施SELEXTM来获得周知的结合CpG基序或其他免疫激活序列的靶标的适体，并鉴定一经结合就刺激免疫反应但不包括CpG基序的适体。许多不同类的CpG基序已经被鉴定，每个结果经过不同级联事件中认知，释放细胞因子和其他分子，并活化某些细胞类型。参见，如，CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects，Annu.Rev.Immunol.2002，20709-760，通过引述合并于本文中。附加的免疫激活基序在下面的美国专利中进行了公开，每个专利通过引述合并于本文中美国专利No.6,207,646；美国专利No.6,239,116；美国专利No.6,429,199；美国专利No.6,214,806；美国专利No.6,653,292；美国专利No.6,426,434；美国专利No.6,514,948和美国专利No.6,498,148。一些CpG或其他免疫激活基序能被加入到适体中。适体的选择根据治疗的疾病或病症而定。优选的免疫刺激基序如下(显示为5′到3′左到右)其中″r″指定为嘌呤，″y″指定为嘧啶，并且″X″指定为一些核苷酸AACGTTCGAG(SEQ ID NO 7)；AACGTT；ACGT，rCGy；rrCGyy，XCGX，XXCGXX，和X1X2CGY1Y2其中X1为G或A，X2非C，Y1非G并且Y2优选为T。在这些例子中，CpG基序被加入到结合特异性靶标而非结合CpG基序的周知的靶标和一经结合就刺激免疫反应的(a″非CpG靶标″)靶标的适体，CpG优选定位在适体的非必需区。适体的非必需区能通过定点突变技术、删除分析和/或取代分析鉴定出来。然而，不显著性干扰适体结合非CpG靶标能力的一些部位可被使用。除了CpG基序包埋在适体序列内，它可被附加在5′和3′端的任何一端或者两端或附着在适体上。附着的一些部位或方式只要适体结合非CpG靶标的能力不被显著性干扰可被使用。依据在这里使用的，″免疫反应的刺激″能意味着(1)特异性反应的诱发(如，Th1反应的诱发)或某些分子的生成或(2)特异性反应或某些分子的阻止或抑制(如，Th2反应的阻止或抑制)的任何一种。
药用组合物
本发明也包含了药用组合物，该药用组合物包含结合IL-23和/或IL-12的适体分子。在一些实施方案中，该组合物适于体内使用，并且包括有效用量的本发明的药理学活性化合物，其单独使用，或者还包括一个或多个药物用载体，与其联合使用。该化合物尤其有效，因为即使存在一些毒性，也是非常低的毒性。本发明的组合物能用于治疗或预防病理，如疾病或病症，或缓解这种患者的这种疾病或病症的症状。例如，本发明的组合物能用于治疗或预防与IL-23和/或IL-12细胞因子相关的病理，包含炎性和自体免疫相关疾病，I型糖尿病、骨质疏松症中的骨吸收和癌症。本发明的组合物有助于对遭受，或易于患有疾病或病症的患者进行给药，这些疾病或病症与本发明适体特异性结合的靶标有关或源自于它们。本发明的组合物能用在治疗患者或具有病理个体的方法中。该方法含有对患者或个体进行适体或包括结合与病理有关的IL-23和/或IL-12的适体的组合物，使得适体对IL-23和/或IL-12的结合改变了靶标的生物功能，从而治疗病理。具有病理的患者或个体，例如通过本发明的方法治疗的患者或个体，可为脊椎动物、更尤其为哺乳动物，或更尤其为人类。实际上，适体或其药物用盐以一定剂量进行给药，该剂量将足够发挥其生物活性，如阻止IL-23和/或IL-12与其受体的结合。本发明的一个方面包括与其他的对炎性和自体免疫疾病、癌症和其他相关病症的治疗相结合的适体组合物。本发明的适体组合物可包含，如，多于一个适体。在一些实施方案中，本发明的适体组合物，包含一个或多个本发明化合物，与另一个有效组合物如抗炎药、免疫抑制剂、抗病毒药物、或类似药物联合给药。此外，本发明的化合物可联合细胞毒性药物、细胞抑制剂、或化疗药如烷化剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂或细胞毒性抗生素进行给药，依据上面公开的。总的来说，目前用在这种联合用药中的周知治疗药物的可用剂型将是适宜的。“联合治疗”(或“协同治疗”)包含本发明适体组合物的给药并且至少为提供来自这些治疗药物共同作用的有利功效的特异性治疗方案部分的第二药剂。联合的有利功效包含，但不限于，因治疗药物联用所致药代动力学或药物效力共同作用。这些治疗药物的典型联合给药在规定时间内实施(经常依据选择的联用确定几分钟内、几小时内、几天内或几个星期内)。“联合治疗”可能，但一般不，为包括作为单独治疗方法的一部分的两种或多种治疗药物的给药，该方法附带并任意导致本发明的联用。“联合治疗”包括这些治疗药物以特殊方式进行给药，也就是，其中每个治疗药物在不同的时间进行给药，以及这些治疗药物的给药，或至少这些治疗药物中的两种以大体上同时给药的方式进行给药。大体同时给药能成功实施，例如，通过对主体进行每个治疗药物具有固定比例或每个治疗药物的多个、单个胶囊单一胶囊给药。每个治疗药物的连续或大体同时给药受到任何适当路线的影响，该适当的路线包含，但不限于，局部给药、或口服给药、静脉内给药、肌肉注射给药、和通过黏膜组织直接吸收。治疗药物能通过同一路线或通过不同路线进行给药。例如，被选择的联合给药的第一个治疗药物可通过注射给药而联合给药的其他治疗药物可局部给药。可供选择地，例如，所有治疗药物可局部给药或所有治疗药物可通过注射给药。治疗药物进行给药的顺序并不狭义上的严格除非另外指出。“联合治疗”也能包括上面描述的治疗药物与其他生物活性成分联合给药。联合治疗另外包括非药物治疗，非药物治疗可在任何适宜的时间进行只要得到来自治疗药物和非药物治疗联合作用的有利功效。例如，在适当的情况下，当进行治疗药物给药不需要非药物治疗时，或许经过几天或甚至几个星期仍得到有利功效。本发明的治疗或药理学组合物一般将包括有效剂量的治疗活性成分，在药物用介质中溶解或分散。药物用介质或载体包含一些或所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌和抗真菌药物、等张和吸收延迟剂以及类似物。这种介质和治疗活性物质的使用在本领域中众所周知。辅助活性成分也能被加入到本发明的治疗组合物中。制药或药理学组合物的制备依据本公开将被本领域技术人员所周知。一般，这种组合物可制为注射液、液体溶液或悬浮液的任一种；适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式；口服给药的药片或其他固体；缓释胶囊；或目前使用的任何形式，包含滴眼剂、乳膏剂、洗液、吸入剂和类似药剂。外科医生、内科医生或医务人员使用消毒制剂，如含盐洗涤剂来治疗手术部位的特殊面积也可能具有显著功效的。组合物也可通过微装置、微粒或海绵进行输送。对制剂，治疗法将以与配药制剂相容的方式并以药理学有效的剂量进行给药。制剂可便于以多种剂型进行给药，如上面描述得注射液剂型，除了药物释放胶囊和能被采用的类似剂型。在本文中，活性成分的数量和被给药的组合物体积依据进行治疗的宿主动物而定。给药用活性成分的精确剂量依据专业人员的判断而定并且每个个体不同。典型地利用在活性化合物中分散的最小量组合物。给药的适宜方案也是改变的，但以最初给药化合物和监测结果然后以更长间隔给出受控剂量为代表。例如，药片或胶囊(例如，凝胶胶囊)的口服给药，活性药物成分能与口服、非毒性、药物用惰性载体如乙醇、丙三醇、水和类似物联合使用。此外，当预期或必要的、适当粘合剂、润滑剂、分裂剂、和着色剂也能加入到混合物中。适宜的粘合剂包含淀粉、硅酸镁铝、淀粉糨糊、凝胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮、天然糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成橡胶如阿拉伯橡胶、黄芪胶或海藻酸钠、聚乙二醇、石蜡、和类似物。在这些剂型中使用的润滑剂包含油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠、二氧化硅、滑石、硬脂酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇、和类似物。分裂剂包含，但不限于，淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄胶原淀粉、琼脂、褐藻酸或其盐、或起泡剂和类似物。稀释液包含，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或糖胶。本发明的化合物也能以这种随时间释放口服剂型和缓释药片或胶囊、药丸、粉末、颗粒、酏剂、酊剂、悬浮液、糖浆和乳液进行给药。栓剂优选从脂肪乳液或悬浮液制得。制药组合物可被进行消毒和/或包含佐剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲液。此外，他们也可包含其他的具有治疗价值物质。依据传统混合、粒化、或涂敷方法制备而成，并典型性包含约0.1％到75％，优选约1％到50％的活性成分。液体，特别注射液组合物能，如，通过溶解、分散等制备而成。活性化合物溶解在或与配药纯溶剂如水、盐水、含水葡萄糖、丙三醇、乙醇、和类似物混合从而形成注射溶液或注射悬浮液。此外，适于在注射前溶解在液体中的固体剂型能被配制成。本发明的化合物能以静脉内(大药丸和灌输)、腹膜内、皮下或肌注形式进行给药，所有使用剂型对制药领域的技术人员是众所周知的。注射液能以传统剂型制成，如液体溶液或悬浮液。肠胃外注射液给药一般用于皮下注射、肌肉注射或静脉内注射和灌输。此外，依据美国专利No.3,710,795，肠胃外给药的方法采用缓释或缓释系统的灌输，其确保了保持恒定水平的剂量，此专利通过引述并合并于本文中。此外，本发明优选的化合物能通过使用适宜的鼻内载体、吸入器的鼻内给药形式进行给药、或使用本领域的技术人员周知的透皮贴片形式通过透皮路线进行给药。以透皮输送体系进行给药，当然贯穿给药方案，药剂给药将是持续给药胜于间接给药。其他优选的局部制剂包含乳膏、药膏、洗液、气溶胶喷雾和凝胶，其中活性成分的浓度将典型地在以重量比或重量体积比为0.01％到15％之间变化。固体组合物，赋形剂包含制药级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁、和类似物。上面定义的活性化合物也可制为栓剂，使用如聚烃基乙二醇如丙二醇为载体。在一些实施方案中，栓剂优先从脂肪乳液或悬浮液制得。本发明的化合物也能以脂质体输送体系，如单层小微脂粒、单层大微脂粒和多层微脂粒形式进行给药。脂质体能从多种含有胆固醇的磷脂、天然碱性脂或卵磷脂中加工成。在一些实施方案中，脂质成分薄膜与药物的水溶液化合来形成封装药物的脂质层，依据在美国专利No.5,262,564中多描述的内容。例如，这里描述的适体分子能被提供为使用本领域众所周知方法构建的亲脂性化合物或非免疫原性、高分子量化合物的复合物。使用本领域众所周知方法构建的核酸相关复合物的实施例在美国专利No.6,011,020中进行了阐述。本发明的化合物也可与作为靶向药物载体的可溶聚合物联用。这种聚合物可能包含聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、多羟丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、或棕榈酰片断取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸。此外，本发明的化合物可与有助于获得药物可控释放的一类生物可降解聚合物联用，例如，聚乳酸、polyepsilon caprolactone、多羟基丁酸、聚原酸酯、聚醛树脂、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯、和水凝胶的交联或两性嵌段共聚物。如果需要，被给药的制药组合物也可包含较小剂量的无毒辅助物如润湿剂或乳化剂、pH缓冲液、和其他如醋酸钠和三乙醇胺油酸酯物质。使用适体的配药方案依据包含类型、种类、患者的年龄、体重、性别和医疗状况；治疗病症的严重性；给药路线；患者的肾脏和肝脏功能；和采用的特殊的适体和其盐的多种因素进行选择。熟练的内科医生或兽医能轻易确定和开出用于阻止、对抗或抑制病症发展的有效剂量药物。当用于本发明的口服剂量将在每天0.05mg到7500mg之间变化。组合物优选以含有0.5、1.0、2.5、10.0、15.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0、和1000.0mg活性成分的刻痕片形式。注入用药量、经鼻用药量和透皮用药量将在每天0.05mg到7500mg之间变化。皮下用药量、静脉内用药量和腹膜内用药量将在每天0.05mg到3800mg之间变化。本发明化合物的有效血浆水平从0.002mg/mL到50mg/mL范围内变化。本发明的化合物可每天一次给药，或每天全部剂量可以两次、三次或四次分开剂量给药。
适体疗法的药代动力学调控和生物分布
很重要的是，所有寡核苷酸疗法的药代动力学性质，包括适体的，被按照所需的药学应用来安排。虽然定向抗细胞外靶标的适体没有遇到细胞内输送的难题(如反义和RNA干涉(RNAi)疗法的情况)，但还是要求这种适体与预期的给药方案一致，要能能分布到靶标器官和组织，并在体内(未被更改)保存一段时间。因此，本发明提供了影响适体组合物的药代动力学，特别是调整适体药代动力学的材料和方法。适体药代动力学的可调性是通过联合适体修饰基(如，PEG聚合物)和/或加入修饰核苷酸(如，2’-氟或2′-O-甲基)来改变核酸的化学组合物而获得。调整适体药代动力学的能力用在现有的治疗应用的提高中，或可供选择地，用在新疗法应用的发展中。例如，在一些治疗应用中，如，抗肿瘤或急性监护设置中，快速药物清除率或断开可被期望的，令人想要的是减少循环中适体的停留时间。可选择地，在其他的治疗应用中，如维持治疗，希望得到治疗剂的全身循环，增加循环中适体的停留时间是想要得到的。此外，适体药代动力学的可调性用于修改主体中适体治疗剂的生物分布。例如，在一些治疗应用中，努力改变适体治疗剂的生物分布来靶向特殊类型组织或特殊的器官(或成套器官)是想要得到的。在这些应用中，适体治疗剂优选在特殊组织或器官中积聚。在其他的治疗应用中，以显示细胞标志物或规定疾病相关症状、细胞损伤或其他异常病理的组织为靶标是想要得到的，使得适体治疗剂优选在受影响的组织中积聚。例如，如同在2004年3月5日提出的尚待批准的美国临时申请No.60/550790名为“适体治疗剂的药代动力学和生物分布的受控调节”和2005年3月7日提出的美国非临时申请No.10/—,—也名为“适体治疗剂的药代动力学和生物分布的受控调节”中描述的那样，适体治疗剂的聚乙二醇化修饰(如，用20kDa PEG聚合物进行的聚乙二醇化修饰)用于靶向发炎组织，使得聚乙二醇化修饰适体治疗剂优选在炎性组织中积聚。为确定适体治疗剂的药代动力学和生物分布性质(如，适体共轭体或已经改变化学性质的适体，如修饰的核苷酸)对多种参数进行监测。这种参数包含，如半衰期(t1/2)、血浆清除率(C1)、分布量(Vss)、浓度-时间曲线下面积(AUC)、最高的血清或血浆浓度(Cmax)、和适体组合物的平均停留时间(MRT)。如同在这里使用的，术语″AUC″统指适体给药后适体治疗剂相对于时间的血浆浓度图下的面积。AUC值用于估价给定适体的生物利用度(如，适体给药后循环中给药适体治疗剂的百分比)和/或总的清除率(Cl)(如，适体治疗剂从循环中清除的速率)。分布量与适体治疗剂的血浆浓度相对体内存在的适体量有关。Vss值越大，发现血浆外的适体越多(如，溢出物越多)。本发明提供了通过使适体结合调节基如小分子肽或聚合物末端基团上，或通过向适体中加入修饰核苷酸而以受控方式体内调节稳定组合物的药代动力学和生物分布。如同这里描述的，修饰适体和/或改变核苷酸化学组合物的结合改变了适体在组织循环中停留的时间和分布的基本特征。除了通过核酸酶清除外，寡核苷酸治疗剂通过肾脏过滤被除去。同样地，静脉内给药的耐寡核苷酸核酸酶典型显示出体内半衰期＜10min，除非过滤能被中止。这能通过或者促进血流快速分布进入组织或通过增强超过肾小球有效截流尺寸的寡核苷酸的表观分子量而成功完成。下面进行描述的小分子治疗剂与PEG聚合物(聚乙二醇化修饰)的结合能戏剧性延长适体在循环中的停留时间，从而减少了给药频率和增强了抗血管靶向的效力。适体能与多种修饰基团结合，该修饰基团如高分子量聚合物如聚乙二醇(PEG)；肽如Tat(HIV Tat蛋白的13个氨基酸片断(参见Vives，et al，(1997)，J.Biol.Chem.272(25)16010-7))，Ant(源自果蝇触角足同源蛋白的第三个螺旋的16个氨基酸序列(参见Pietersz，et al.，(2001)，Vaccine 19(11-12)1397-405))和Arg7(由聚精氨酸组成的短的、阳离子化的渗入细胞肽(Arg7)(参见Rothbard，et al.，(2000)，Nat.Med.6(11)1253-7；Rothbard，J et al，(2002)，J.Med.Chem.45(17)3612-8))；和小分子，如亲脂性化合物如胆固醇。在这里描述的多种结合中，适体的体内性质通过与PEG基络合被完全改变了。例如，混合的2′F和2′-OMe修饰适体治疗剂与20kDa PEG聚合物的络合阻滞了肾脏过滤并促进适体分布到健康和炎性组织中。此外，20kDa PEG聚合物-适体结合证明了与40kDa PEG聚合物在阻止适体的肾脏过滤是几乎同样有效的。而聚乙二醇化修饰的对适体清除的一个作用，在20kDa基团存在提供的延长的全面接触也促进了适体分布到组织中，尤其那些高度灌注器官和发炎部位。适体-20kDa PEG聚合物结合使得适体分布到发炎部位，使得聚乙二醇化修饰适体优选在炎性组织中聚积。在一些实例中，20kDa聚乙二醇化修饰适体结合能进入细胞内部，如肾脏细胞。修饰的核苷酸也能用于调节适体的血浆清除率。例如，当比较于未修饰适体时，非结合的适体显示出从血浆中快速流失{例如，快速血浆清除率}和快速分不到组织内，首先分不到肾脏内，该非结合的适体加入2′-F和2′-OMe稳定化学性，是目前生成适体的典型因为它显示出体外和体内核酸酶的高度稳定性。
核酸的PEG衍生物
如上所述，非免疫原性的高分子量核酸聚合物及其衍生物具有能够改变核酸的药代动力学及药效能力，从而使之成为更有效的治疗剂。对提高核酸活性的有益改变包括增强对核酸降解的限制性、降低肾脏的过滤作用、减少暴露于免疫系统得次数及改变治疗剂在人体内的分配。本发明中的适体组合物(一种能和凝血酶结合的核酸)是由聚氧化烷撑(PAG)衍生而来的，例如2003年11月21日申请的美国专利申请号为10/718,833的专利中，就可以发现由PAG衍生得到的核酸，在发明中用到的这种聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)和聚丙二醇(包括聚异丙二醇)。许多申请中都使用了不同烯化氧聚合物之间的随机共聚或自聚(例如环氧乙烷及环氧丙烷的共聚)，其中最常见的形式是一种以氢氧基团小为端点的链状聚醚类物质alpha-，omega-dihydroxylpolyethylene glycol。这种聚合物，α-Ω-聚乙二醇可以用HO-PEG-OH表示，在这里，PEG表示下边的结构-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，n的范围可以从4到10,000。正如所示，PEG分子是双官能基团，有时也用“PEG diol”表示，相比较而言，PEG分子的末端是无反应性羟基基团，羟基基团可以被激活或者转变成为反应型基团，使PEG在反应过程中与其他基团的反应位点相连。例如PEG分子末端双官能基团的相对无反应性的羟基被琥珀酰胺活性酯基团所取代，从而使其具有活性碳酸酯的性质，能够与氨基基团选择性的进行反应。在很多应用中，需要使PEG分子的一端是无活性的基团，从而此PEG分子只显示单一功能(单活性)。因为，在很多蛋白质治疗剂中，常常含有多个活性PEG位点，双官能团的PEG分子容易导致过多的交联产生功能较差的聚合体。双官能PEG分子的一个羟基末端用无反应型的甲氧基分子代替，就可以生产单活性的PEG分子，该分子另一个末端转变成具有活性的基团与蛋白分子或表面上的活性位点相结合。聚氧化烷撑(PAG)衍生物能够溶于水和许多有机溶剂，无毒，非免疫原性。将PAG与不溶物分子共价键和可改变所得分子的溶解性，例如，有实验证明，将PEG与水不溶药物paclitaxel键和可使该药物变成水可溶物质(Greenwald，et ah，J.Org.Chem.，60331-336(1995).)，结合PAG的方法不仅仅用于提高分子溶解性和稳定性方面，也用于延长分子在血液循环过程中的半衰期。本发明中的聚氧化烷撑化合物的分子量范围很广，从5到80KDa，其中很多型号的分子都可以使用，具体选择哪种要具体分析。本发明中的PAG组合物的大小从10到80KDa不等或从10到60KDa不等，例如，一个PAG聚合物的大小至少是10，20，30，40，50，60或80。这些聚合物可以是直链的，也可以是含有支链的。在很多实施例中，这种聚合物指得是PEG，在另一些实施例中，这种聚合物指得是支链PEG，还有很多实施例中，这种聚合物指得是40KDa的支链PEG，如图4所示；在很多实施例中，这种聚合物指得是40KDa的PEG与核酸的5’末端相结合，如图5所示。与生物表达的蛋白质治疗药物相反，核酸类药物是由活性单体核苷酸通过化学合成的方法合成的，可以用同样的合成方法将PEG与核酸聚合，得到PEG核酸聚合物，例如，将pEG活化为亚磷酰胺形式，这种形式可与固相低聚寡核苷酸发生合成反应，另外，低聚寡核苷酸的合成反应也可以通过与反应性PEG分子定点结合完成。通常，在反应中要加入一个5’末端的引物(通过固相合成反应中最后接合过程的一个经过修饰的低聚寡核苷酸制得)来完成整个合成过程。通过这个方法，具有反应性的PEG(例如，具有活性能够与氨基接合或发生反应的PEG)与纯化后的低聚寡核苷酸接合，这个接合反应在溶液中进行。PEG结合能力及改变药物生物分布的能力与很多因素有关，其中包括聚合物外观大小(依据流体动力学半径测量)，大的聚合物(＞10kDa)对于阻止肾脏的过滤作用更为有效，从而能够增加生物大分子(例如肽链、反义寡核苷酸)的血浆半衰期。PEG聚合物阻止过滤作用的能力随着其分子量上升到大约50KDa而有增加趋势，在此之后进一步增加其分子量没有起到什么效果，因为半衰期的定义是大分子物质的代谢而不是通过大分子通过肾脏之后是否消失。生产高分子量的PEG衍生物是一项困难、费时及造价昂贵的工作，其前期的准备工作主要集中在生产高分子量的活性PEG方面，生产高分子量的活性PEG可以通过形成一个有支链结构的活性PEG来实现，在这个支链结构中，两个或多个PEG相互依附形成一个中心结构，活性基团就存在于这个中心里。高分子量PEG分子的末端，例如相对无反应性的羟基基团可以通过与其他活性位点结合的方式被激活或成为功能基团，含支链的活性PEG拥有更多的末端，所以含支链的PEG分子中那里的末端被激活，高分子量的PEG分子就结合在那里，如果含支链的PEG分子有两个活性末端，高分子量PEG分子就分别与之结合成为具有双活性的高分子量PEG。在大多情况下，支链PEG分子只有一个末端被活化，与此结合而成的高分子量PEG就是单活性的PEG分子。例如，文献(Harriset al，Nature，vol.2214-221，2003)描述了活化PEG分子与两个一甲基PEG分子结合形成活性高分子PEG的方法在。本发明介绍了一种有效的合成高分子量PEG衍生核酸(优选，适体)聚合物的途径，其中也包括生产PEG接合的复合低寡核苷酸(例如二聚核酸)的方法。本发明还涉及到高分子量分子组合物，其中，PEG的稳定基团可作为酶结合适体的连接肽，将同一核酸的不同部分连接起来，例如，当高分子量的PEG分子与单一适体序列接合时，高分子量适体组合物的直线型排列为核酸-PEG-核酸(-PEG-核酸)n，这里n大于等于1。本发明中的高分子量组合物包括分子量至少为10KDa的分子，其分子量的范围从10到80KDa不等，即高分子量组合物的分子量至少为10，20，30，40，50，60或80KDa。分子的稳定基团是指一个分子或分子中的一部分，它能够改善本发明描述的高分子量适体组合物的药代动力学及药效，在有些情况下，稳定基团是指能够使两个或两个以上的适体或适体结构域变得较为相似的一个分子或者分子中的一部分，能够降低高分子量适体的旋转自由度，该基团可以是直链状的或含有支链的聚氧化烷撑类物质，可以是聚氧化烷撑类物质的均聚物，也可是杂聚物，其他稳定基团包括多肽核酸聚合物或低聚寡核苷酸(包括修饰后的核苷酸、连接肽如硫代磷酸)，稳定基团也可以是适体组合物的一部分，他们可以与适体共价结合。本发明中组合物包括由两个或两个以上适体组合物与一个聚氧化烷撑类物质共价接合所组成的高分子量适体组合物，其中聚氧化烷撑类物质起到了稳定基团的作用，在此组合物中聚氧化烷撑基团与适体的任意一端共价接合从而构成一个分子，在这里，聚氧化烷撑类物质起到了连接肽的作用，此共价键和物的结构可以表示为核酸-PAG-核酸，例如，核酸-PEG-核酸，核酸-PEG-核酸-PEG-核酸。为了生产核酸-PEG-核酸共价物，在合成核酸时要使之具有一个单一的活性位点(就是说此核酸是单一活性的)，如同前面提到的，该反应位点是在5’末端，在低聚寡核苷酸固相合成过程最后一步中，通过加入硫代磷酸修饰剂诱导的氨基基团，纯化修饰后的低聚寡核苷酸，去除其中蛋白质，放入其高浓度溶液中重组，减小PEG的水解反应。在这里，低聚寡核苷酸的浓度为1mM，重组液中含有200mM NaHCO3缓冲液，pH值为8.3。缓缓加入高纯度的含双官能团的PEG启动共价物合成反应，如前所述，该PEG的两个末端通过琥珀酰丙酸盐的消解作用而被激活，反应后，PEG-核酸共价物通过凝胶电泳或液相色谱的方法分离提纯，按照完全共价物、半共价物及未共价几种分类收集，多PAG分子的自聚物(随机共聚或空白共聚物)或较小的PAG分子可以连接成不同的长度(或分子量)，在此过程中，使用了不含PAG的连接肽。2’-O-甲基，2’-氟及其他核苷酸修饰剂的修饰作用使核酸片段变得更加稳定，提高了核酸在体内的半衰期，3’-3’-脱氧胸腺嘧啶同样增加了核酸外切酶的限制性。参见美国专利5,674,685；5,668,264；6,207,816；和6,229,002。
活性核酸的PAG-衍生物
高分子量的PAG-核酸-PAG共价物可以通过单一活性官能团的PEG与包含多个活性位点的核酸反应生成，在一个实施例中，核酸具有双反应性或双活性，拥有两个反应位点5’氨基基团和3’氨基基团通过亚磷酰胺聚合反应引入低聚寡核苷酸中，例如，图6表示了3’-5’双PEG化核苷酸组成。在另一实施例中，每隔一定位置即可以引入一个反应位点，例如位置5引入嘧啶的反应位点，位置8引入嘌呤的反应位点，或位置2引入核糖的反应位点。在此实施例中，核酸拥有多个活性位点或反应位点的情况叫做多活性。在随后的合成及纯化过程中，经修饰的低聚寡核苷酸与单活性PEG在促进选择性反应得条件下相结合，结合位点在寡核苷酸的活性位点上，几乎没有PEG的水解作用同时发生。在前面所提到的实施例中，单甲氧基PEG与琥珀酰丙烯盐反应激活，此反应的PH值为8.3。为了促进双取代的PEG合成反应，应向反应中加入按化学计量组成所需的过量的PEG，在反应之后，PEG-核酸共价物通过凝胶电泳或液相色谱的方法分离提纯，按照完全共价物、半共价物及未共价几种分类收集。连接区域也有一个或多个聚氧化烷撑基团，这些PAG的分子大小有所不同，可以通过合适的连接方法生产具有所需分子量的组合物。连接肽的化学组成及分子量大小可以影响其作用效果，过长、过短、其空间位置不合适或与IL-23及IL-12有离子间相互作用的连接肽会排出IL-23及IL-12与核酸形成复杂的产物的情况。超过需要长度的连接肽会使核酸之间的距离变大，减少适体的有效浓度从而降低结合稳定性。因此，有必要优化连接肽的组成及大小来增大核酸对靶标物质的亲和力。本文中引用的所有的出版物及专利文件通过引述合并于本文中，就如同将每一个文献都具体地和独自地引入了本申请中。这些出版物和专利文献的引证并不是承认任何其中的一篇是本申请的相关先有技术文献，也不是承认它们的内容或日期。本发明现在被本说明书所描述，本领域的技术人员将明白的是，本发明可以各种实施方案来实现，而且，前述的说明和随后的实施例都是为了说明本发明，而不是用于限制本发明的权利要求的。
实施例实施例1核酸片段的选择和测序IL-23核苷酸配体的选择
使用SELEXTM(核酸类抗体(适体)的筛选试验)的方法生产不同特异性的IL-23和IL-12配体，方案一，设计生产IL-23对IL-12的特异性适体，包括对IL-12进行阴性筛选，消除能够识别一般组群的适体，得到IL-23的特异性适体，再分别对IL-23和IL-12进行单独的SELEXTM试验得到这两种蛋白的特异性配体。在实施例1A和1E中，在含有2’-OH嘌呤和2’-F嘧啶(rRfY)RNA库上完成筛选过程，得到筛选株将其克隆，在克隆过程中根据IL-23在细胞中的活性对适体进行优化，增强其结合力及功效。另外，使用2’-甲氧基核苷RNA库的方法在实施例1B、1C和1D中进行了描述，其中2’-甲氧基核苷RNA库包括rRmY(2’-OHA或G，及2’-OMe C或U)、rGmH(2’-OH G，及2’-OMe C、A或U)及dRmY(脱氧腺嘌呤、鸟嘌呤及2’-甲氧基胞嘧啶及尿嘧啶)。
实施例1A2’-F-嘌呤RNA库中选择人类IL-23蛋白的核酸配体
通过含有2’-OH嘌呤(核糖核酸嘌呤)和2’-F-嘧啶核苷的RNA库(rRfY)针对人类IL-23蛋白的选择性适体进行了三个筛选，第一个筛选(h-IL-23)是直接针对h-IL-23的，其由p19及p40片段组成；第二个筛选(x-IL-23)是利用h-IL-23和h-IL-12交替筛选进行的，筛选出针对这两个蛋白所共有的亚基p40的适体；在第三个筛选(PN-IL-23)中，是通过在阴性筛选过程中加入h-1L-12来富集特异性结合h-IL-23区别亚基，即p19亚区域的适体。如同以下所述，这第三个筛选中的起始材料，即PN-IL-23筛选的起始材料，是h-IL-23筛选所得到的库的一部分，是经过对h-IL-23进行过两次特异性筛选之后的h-IL-23库的残留成分。上述三个筛选方法都产生了h-IL-23的适体。有些适体对h-IL-23的特异性较强，有些适体对h-IL-23及h-IL-12表现交叉的反应性，还有一些适体表现出更多的对h-IL-12的特异性。第一次的h-IL-23筛选和PN-IL-23筛选开始于对包含2×1014分子的2’F嘌呤修饰的ARC212RNA库的培养，SEQ ID NO8(5′gggaaaagcgaaucauacacaaga-N40-gcuccgcca gagaccaa ccgagaa3′)5，包含一部分α32P ATP标记的库，及100pmoles IL-23(R&D，Minneapolis，MN)，其最终体积为100μL，在室温条件下培养1小时。模板(SEQ ID NO8)中的一系列N，可以是任何的核酸的结合并产生最终所得到的适体的独特的序列区域。在第二轮筛选之后，库被分为两个相等的部分，一部分用于后续的h-IL-23的筛选(3-12轮)，另一部分用于PN-IL-23筛选的的后续循环(如循环3-11)。X-IL-23的第一轮筛选的操作过程与之相似，只是RNA库中加入50pmoles h-IL-23和50pmoles h-IL-12。所有的筛选都在1X SHMCK缓冲液中进行，此缓冲液的pH值为7.4，其组成为20mM Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，生物缓冲液)pH7.4，120mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，1mM CaCl2。RNAh-IL-23复合物及游离的RNA分子通过直径为0.45μm的硝化纤维柱(Schleicher &Schuell公司，Keene，NH)分离。先用1ml IX SHMCK缓冲液洗柱，然后加入RNA蛋白复合物，以1500rpm的速度离心2分钟，用缓冲液洗去无特异性结合体(第一、第二循环用500μL 1X SHMCK洗柱，在以后的循环里，要用更加严谨的和更大浓度及更多体积的缓冲液洗柱，来富集特异性结合体)，最后，用2×200μL洗脱液(最后一次循环用2×100μL洗脱液)将RNA蛋白复合物从分离住上洗脱下来，其中，洗脱液的组成是7M尿素、100mM醋酸钠、3mM EDTA，预热至95℃。洗脱的RNA用苯酚∶氯仿萃取，然后沉淀(40ūg肝糖及1体积的异丙醇)。再用ThermoscriptTM反转录PCR仪(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)按照操作说明进行反转录，引物为3’末端引物，序列为5′ttctcggttggtctctggcggagc3′(SEQ ID NO 10)，然后，用PCR技术进行扩增(20mM Tris溶液，pH为8.4，50mM KCl，2mM MgCl2，0.5μM of 5′末端引物5′taatacgactcactatagggaaaagcgaatcatacacaaga 3′(SEQ ID NO 9)，0.5μM的3′引物(SEQ ID NO10)，每种脱氧核糖核酸各0.5mM，0.05units/μL Taq聚合酶(New England Biolabs公司，Beverly，MA)。PCR反应在下列循环条件下进行a)94℃，变性30秒；b)55℃退火30秒；c)72℃延伸30秒，此循环重复进行，直到获得足够的PCR产品，获得足够PCR产品的最少循环次数在表1-3中进行了报道，即“PCR阈限”。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen公司，Valencia，CA)纯化PCR模板，并在37℃下用α32P ATP标记转录，过夜，使用试剂包括4％的PEG-8000，40mM Tris试剂，pH为8.0，12mM MgCl2，1mM亚精胺，0.002％Triton X-100，3mM 2′OH嘌呤，3mM 2′F嘧啶，25mM DTT，0.0025units/μL无机磷酸酶，2μg/mL T7Y639F单突变的RNA聚合酶，5μCi Ct32P ATP，并按照使用说明指示，用Bio Spin columns(Bio-Rad公司，Hercules，CA)除盐。三个筛选中后续循环所使用的方法与第一次循环所使用的方法基本相同，除了表1-3列出的区别之外。在与靶标蛋白一起培养之前，RNA要经过直径为0.45微米的硝化纤维管过滤，除去与过滤器结合的序列，收集滤出液进行阳性筛选步骤。在另外的过程中，用凝胶电泳纯化RNA库。加入50mM EDTA灭火，终止转录反应，用乙醇沉淀，沉淀物经15mm的变性聚丙烯酰胺凝胶(8M尿素，10％丙烯酰胺；19∶1丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺)，用电洗脱的方法将RNA从凝胶中移出，具体方法是使用Elutrap仪(Schleicher and Schuell公司，Keene，NH)在电压为225V条件下加入1X TBE试剂(90mM Tris，90mM硼酸，0.2mM EDTA)洗脱一小时，向洗脱液中加入300mM醋酸钠和2.5倍体积的乙醇溶液，可将洗脱物质沉淀下来。筛选之后，RNA的残余量要多于蛋白质，约为1-2μM，而蛋白质的浓度在两次循环实验后大约为1μM，并随着筛选的进行，此浓度进一步降低。根据筛选的情况，在进行3-4次循环时，加入0.1mg/ml的竞争性抑制剂tRNA。一般进行约11-12循环，在选定的循环时进行结合检测。表1-3表示了使用h-IL-23，X-IL-23，和PN-IL-23进行rRfY筛选的一些细节，例如每次循环的RNA浓度、蛋白质浓度及tRNA浓度等等。可以通过洗提率(通过洗提得到的结合了蛋白质的RNA占经过过滤柱的总的RNA的比率)及定点杂交试验来监控筛选的进行。表1.h-IL-23筛选条件 表2.X-IL-23筛选条件 表3.PN-IL-23筛选条件 rRfY″筛选过程的监控。在筛选过程中用定点杂交试验检测蛋白与RNA的结合力度，痕量32P-标记的RNA与稀释后的h-IL-23结合，在室温条件下放入1X SHMCK(20mM Hepes，120mMNaCl，5mM KCl，1■mM MgCl2，1mM CaCl2，pH 7.4)中反应30分钟，加入0.1mg/mL tRNA，最终溶液体积为20μL，杂交试验的结果用96孔带真空罩的硝化纤维过滤器(Schleicher & Schuell，Keene，NH)分析，在这里一共用到了3层过滤介质，从顶部到底部分别为Protean硝化纤维柱(Schleicher & Schuell公司)，Hybond-P尼龙(Amersham Biosciences公司)和GB002凝胶印记纸(Schleicher & Schuell)。在硝化纤维层，可以得到与蛋白连接的RNA，在尼龙过滤层，可以得到未与蛋白连接的RNA，凝胶印记纸的加入起到了协助作用。过滤之后，将各滤层分开，干燥后置于荧光屏(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)下用Phosphorimager印记图像分析系统(Amersham Biosciences)定量。当含有h-IL-23条件下RNA的阳性结合率与不含有h-IL-23条件下RNA的阳性结合率相比有显著的提高时，用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)克隆RNA库。对于h-IL-23和X-IL-23筛选，克隆的是第8次循环所得RNA模板，每个筛选的32个克隆体进行1点定点杂交筛选分析(+/-75nM h-IL-23或另外用+/-75nM h-IL-12)。对于PN-IL-23筛选，克隆的是第10次循环的RNA并测序，得到8株克隆体，并对这些克隆体进行1点定点杂交筛选分析(+/-200nM h-IL-23或另外用+/-200nM h-IL-12)是否与蛋白结合，之后，将第10次循环所得的RNA继续克隆，在进行12轮循环后，对所得克隆体进行1点定点杂交筛选分析(+/-100nM h-IL-23或+/-200nM h-IL-12)是否与蛋白结合。对所得克隆体进行检测可知，克隆体的5’末端被γ32PATP所标记，KD值可以用定点杂交实验中h-IL-23的稀释系统确定(R&D Systems，Minneapolis，MN)，对于所有能够得到较高h-IL-23蛋白结合率的特征序列，当混合物中RNA与蛋白的比为1∶1时，其结果可通过下列公式计算得出，片段结合率＝幅度*([IL-23]/(KD+[IL-23])(KaleidaGraph v.3.51，Synergy Software)。表4表示了蛋白质的结合情况。下面的实施例3介绍了对h-IL-23具有较强亲和力的克隆体的制备和筛选方法，这些克隆体对以细胞为基础的分析试验有较强的功能性。表4.rRfY克隆体的结合活性(下列所有数据都是在有0.1mg/mL tRNA存在的条件下测定的)
N.B.＝没有观察到明显的结合
表5表示了rRfY片段的核酸序列，下面每一个适体片段的特征序列都开始于第25位核苷，紧接着序列GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGA(SEQ ID NO 11)之后，当遇到3’端固定的核酸序列GCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAA(SEQ ID NO 12)时停止。除非另有说明，下面列出的序列是按照从5’端到3’端的方向书写的，表示了在rRfY SELEXTM条件下筛选的能够与IL-23及IL-12结合的序列，在此条件下加入的是2’-OH-嘌呤(A或G)和2’-F-嘧啶(U或C)。表5所表示的核酸序列可以是这些核酸的PAG衍生物，其3’末端可以含有或者不含有加帽(如3’-反向dT)
表5.分别针对h-IL-23(循环8次)、X-IL-23(循环8次)和PN-IL-23(循环10/12次)筛选的rRfY克隆序列h-IL-23(循环8次)筛选的rRfY克隆序列SEQ ID NO 13(AMX(86)-D5)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGAGGUAUGUGGUUUUGCGGAGCAACUCGUGUCAGCGGUCAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 14(AMX(86)-B7)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAAUGAAUUCCGUCCACGGGCGCCCGAUGAUGUCAGUUUUCGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 15(MX(86)-B5)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUUAGUGCGUGUGUUGAAAGGGCUCAUAAUGUCAGUAUCGAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 16(AMX(86)-D6)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUUAGGCGUCGUGACAAUAACUGGUCCACGAGCAUGUCAGUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 17(AMX(86)-G8)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUGGAAGGCGAUCGUAGCAGUAACCCAAUGAUUGGGACCUAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 18(AMX(86)-A7)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUCUCUUUGGCCGACGCAACAAUGCUCUUUUCCGACCUUGCGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 19(AMX(86)-E7)GGGAAAAGCGAAUCCUACCCAAGAUGUUGUUGGCGUUGAUCGUAUGAUUNAUGGAGNGUGUCNGUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 20(AMX(86)-C7)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUGCGCUAUGUUUGGCUGGGAAUUGUAGCAUUGCUCAAGUGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 21(AMX(86)-F7)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUGUUGAACCUCUUGUGCGUCCCGAUGUUUNGCAAUGUGGAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 22(AMX(86)-F6)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAAUGUAUACAAUGCCCUAUCGUCAGUUAGGCAUGUGUGGAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAA
SEQ ID NO 23(AMX(86)-D8)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACAGAGGCAAUGAGAGCCUGGCGAUGUCAGUCGCAUCUUGCUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 24(AMX(86)-E6)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUCGCAAAAGGAGUUUGUCUCUGCUCUCGGAGUGUGUCAGUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 25(AMX(86)-H7)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGAUGACUACACGCCAGUGUGCGCUUUUUGCGGAGUUAGCGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 26(AMX(86)-C8)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUCGUGAUGAUUUGGGUUAUGUCAGUUCCCUGUAUGGUUUCGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 27(AMX(86)-C5)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUUUUAUGUGGGUCCCGAUGAUUAACUUUAUUGGCGCAUUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAAX-IL-23筛选(循环8)SEQ ID NO 28(AMX(86)-B10)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGAACGAGUAUAUUUGCGCUGGCGGAGAAGUCUCUCGAAGGGAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 29(AMX(86)-B11)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUAUCAUUCGGCUGGUGGGAGAAAUCUCUGUAGAUAUAGAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 30(AMX(86)-D11)GGGAAAAGGGAAUCAUACACAAGAUAGCGUCUAUGAUGGCGGAGAAGCAAGUGUAGCAUAACAGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 31(AMX(86)-F12)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUGUUGAAUGAGCGCUGGUGGACAGAUCUUUGGUUACAGAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 32(AMX(86)-C9)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACUCAUGGAUAUGGCCUAGCAGCCGUGGAAGCGGUCAUUCUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 33(AMX(86)-G9)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUCCCAGCGGUACGUGAGUCUGUUAAAGGCCACCUAAUGUCGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 34(AMX(86)-A10)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUAAUGUGGGUCCCGAUGAUUCGCUGUGCGGCGUUUGUAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 35(AMX(86)-B9)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGGUUGAGUACGACGGAGUCNUGGCUAACACGGAAACUAGAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAA
SEQ ID NO 36(AMX(86)-G10)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUCAUGGCUUACAAUUGAAACAAGAGCUCGCGUGACACAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 37(AMX(86)-A11)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAACGGCUAGGCAUCAAUGGCCAGCAAAAAUAGUCGUGUAAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 38(AMX(86)-F11)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACCAUCGGACGAGGCGGGUCACCUUUUACGCUUUCGAGCUGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 39(AMX(86)-H9)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUGGUUCCCACGUGAAAGUGGCUAGCGAGUACCCCACUUAUGCUCCGCCAGAGACCAACCAAGGGSEQ ID NO 40(AMX(86)-H11)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGCGCUUUAGCGGGUAUAGCACUUUUCAUCUAAUGAANCCGUAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 41(AMX(86)-A9)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUCUACGAUUGUUCAGGUUUUUUGUACUCAACUAAAGGCGAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 42(AMX(86)-E10)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUUGUCUCGGAUUGGUCACUCCCAUUUUUGUUCGCUUAACGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAAPN-IL-23筛选(循环10和12)SEQ ID NO 43(AMX(84)-A10)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAAGUUUUUUGUGCUCUGAGUACUCAGCGUCCGUAAGGGAUAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 44(AMX(84)-B10)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAAGUGCUUCAUGCGGCAAACUGCAUGACGUCGAAUAGAUAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 45(AMX(84)-A11)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGAGGUAUGUGGUUUUGCGGAGCAACUCGUGUCAGCGGUCAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 46(AMX(84)-F11)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUGUGCUUGAGUUAAAUCUCAUCGUCCCCGUUUGGGGAUAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 47(AMX(84)-E12)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAAGUUUUUGUGCUCUGAGUACUCAGCGUCCGUAAGGGAUAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 48(AMX(84)-C10)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGAUGUAUUCAGGCGGUCCGCAUUGAUGUCAGUUAUGCGUAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAA
SEQ ID NO 49(AMX(84)-C11)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAAUGGUCGGAAUCUCUGGCGCCACGCUGAGUAUAGACGGAAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 50(AMX(84)-G11)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUGCUUCGUAUGUUGAAUACGACGUUCGCAGGACGAAUAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 51(ARX33-plate1-H01)AGGGAAAAGGAAUCAUACACAAGAUGUAUCAUCCGGUCGUACAAAAGCGCCACGGAACCAUUCGCUCCGCCAGANACCAACCGAGAASEQ ID NO 52(AMX(91)-F11)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACGCGUCAGGUCCACGCUGAAAUUUAUUUUCGGCAGUGUAAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 53(AMX(91)-G1)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUAUGUGCCUGGGAUGGACGACAUCCCCUGUCUAAGGAUAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 54(AMX(91)-E3)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUUACUCCGUUAGUGUCAGUUGACGGAGGGAGCGUACUAUUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 55(AMX(91)-H3)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACAUUGUGCUUUAUCACGUGGGUGAUAACGACGAAAGUUAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 56(AMX(91)-B5)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACAGUGUAUGAGGAAGAUUACUUCCAUUCCUGAGCGGUUUUCGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 57(AMX(91)-A6)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUUGGCAAUGUGACCUUCAACCCUUUUCCCGAUGAACAGUGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 58(AMX(91)-G7)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACAUGACUGCAUGCUUCGGGAGUAUCUCGGUCCCGACGUUCGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 59(AMX(91)-H7)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACUUAUCGCCUCAAGGGGGGUAAUAAACCCAGCGUGUGCAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 60(AMX(91)-B8)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAAUCCUGGCUUCGCAUAGUGUAUGGGUAGUACGACAGCGCGUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 61(AMX(91)-H8)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAACGCAUAGUCGGAUUUACCGAUCAUUCUGUGCCUUCGUGACGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 62(AMX(91)-G9)
GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAAUUGUGCUUACAACUUUCGUUGUACCGACGUGUCAGUUAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 63(AMX(91)-D9)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUGUAUUACCCCCAACCCAGGGGGACCAUUCGCGUAACAAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 64(AMX(91)-G11)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACUUAACAGUGCGGGGCGCAGUGUAUAGAUCCGCAAUGUGUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 65(AMX(91)-C12)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACGAUAGUAUGACCUUUUGAAAGGCUUCCCGAGCGGUGUUCGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 66(AMX(91)-H12)GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACGUGUGCUUUAUGUAAACCAUAACGUUCCAUAAGGAAUAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAA
以上描述的经定点杂交检测确定的对靶标蛋白IL-23具有结合活性的序列，以及对以细胞为基础的分析试验有较强的功能性(见实施例3)的序列，都被最小化(见实施例2)。
实施例1B对于人类IL-23蛋白的筛选株，库中含有ribo/2’-O-甲基-核苷酸
为确定含有ribo/2’-O-CH3-核苷酸的适体，共进行了两种筛选。一种方法使用了2’-O-CH3-A，C，U及2’-OH-G(rGmH)，另一种方法使用了2’-O-CH3-C，U及2’-OH-G，A(rRmY)。这两种选择方法都是针对固定于疏水板上的h-IL-23的直接筛选，且在选择过程中没有针对p19或p40子域有选择偏向的步骤。通过这两种筛选方法所得的产品与未经筛选的序列相比有更强的接合性，能够明显的与h-IL-23蛋白相结合。这里提供了每一个克隆的序列，以及关于h-IL-23结合的数据。库的制备。用ABI EXPEDITETMDNA序列合成仪合成5’末端序列为GGGAGAGGAGAG AACGTTCTACNsoCGCTGTCGATCGATCGATCGATG-S′(ARC256)(SEQ ID NO3)的DNA模板，并用标准方法使其脱保护。DNA模板中的一系列N可为任意的核苷酸的结合，并最终生成适体的特征序列区域。加入5’末端引物5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-3′(SEQ ID NO 67)和3′末端引物5′-CATCGATCGATCGATCGACAGC-S′(SEQ ID NO68)，然后用作体外转录的模板，使用了Y639F单突变T7 RNA聚合酶。转录在37摄氏度下过夜进行，加入200mM Hepes，40mM DTT，2mM亚精胺，.01％TritonX-100，10％PEG-8000，5mM MgCl2，1.5mM MnCl2，500μM NTPs，500μMGMP，0.01units/μL无机磷酸酶，和2μg/mL Y639F单突变T7聚合酶。得到两种不同的转录产物，分别为rGmH和rRmY。筛选。将20pmole h-IL-23固定于疏水性酶标板Nunc上，加入100μl IX Dulbecco′s PBS缓冲液(DPBS(+Ca2+，Mg2+))于室温条件下开始筛选。当表面物质被移出后，用120μL缓冲液(1X DPBS，0.2％BSA，and 0.05％Tween-20)清洗小孔4次，加热RNA到90℃，维持3分钟，然后冷却到室温并维持10分钟使之复性，在第一次循环中，进行了一个阳性筛选步骤，简单的说，在每个小孔中加入100μL连接缓冲液(1X DPBS及0.05％Tween-20)和1×1014分子(0.2nmoles)的RNA，与固定化靶标蛋白共同培养1小时，直到表面物质被移出后，用120μL清洗液清洗孔板4次。在随后的循环中，包括一个阴性筛选。在阳性筛选之前，室温条件下将RNA在空孔板中培养30分以除去其中的塑性结合片断，并且在第4次循环之后，要增加清洗孔板的次数。加入RT mix(3′引物，(SEQ ID NO 68)，和ThermoscriptTMRT，(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)在65℃条件下培养1小时，会引起与固定化h-IL-23结合的RNA的反转录。将反转录所得的cDNA用作PCR反应的模板，加入Taq聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)。“热启动”PCR条件结合了60℃的退火温度，将引物-二聚体形式最小化。扩增的库模板DNA用Centrisep柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)按照制造商推荐的条件脱盐，然后用来转录库RNA作为后续循环的模板。后续试验中每一次循环所得的RNA都要用10％的聚丙烯酰胺凝胶柱纯化。表6表示出每次循环所用的RNA的浓度。表6.每次循环的RNA的浓度 如实施例1A所述，筛选的进展可以通过定点印记杂交的方法来监控。将5’-末端用32P标记的RNA加热到90℃，维持3分钟，再冷却至室温，复性10分钟，然后，与h-IL-23 DPBS和0.1mg/mL tRNA一起在室温条件下培养30分钟，在此过程中要检测RNA浓度，然后用夹有定点印记纸的硝化纤维及尼龙过滤层(Schleicher and Schuell)过滤，计算出连接在硝化纤维层的RNA，并在单点筛选过程中每3次循环监控一次(+/-250nM h-IL-23)。用滴定h-IL-23蛋白(R&D，Minneapolis，MN)的方法测定RNA的KD值，定点印记纸的作用在上面已经作了介绍。经过4轮筛选后，与未经筛选的相比，rRmY h-IL-23筛选株中已经富集了h-IL-23的连接体(数据未给出)。提高筛选的严谨度，再进行8次的循环筛选。在第9轮时，RNA的KD值大约是500nM或更高。经过10轮后，与未经筛选的相比，rGmH筛选株中已经富集了h-IL-23的结合体，它的KD值也在约是500Nm或500nM以上。图7中的曲线表示了rRmY及rGmH筛选株对h-IL-23的结合能力。用TOPO TA克隆系统(Invitrogen，Carisbad，CA)对RNA进行克隆，并测定所得单个序列的结合能力。对于所有粗rRmY克隆转录，采用1∶200的倍率稀释，加入+/-200nM IL-23和0.1mg/mL竞争tRNA起始单点结合筛选。对24株表现出最好单点结合能力的序列进行10点筛选。10点筛选使用0-480nM IL-23，3倍稀释。通过下列公式绘制结合能力曲线并计算KD值结合的RNA部分＝扩增的*[h-IL-23]/KD+[h-IL-23])。表7表示了对h-IL-23有很好连接能力的针对rRmY筛选的适体，其中含有一组6拷贝序列和4对双拷贝序列，表8表示了rRmY克隆物的结合特点，对48粗rGmH克隆转录进行克隆检测，按1∶200倍稀释，以0.1mg/mL tRNA作为竞争物。与背景的平均结合率只有14％，然而经过rRmY筛选的序列用同样的方法测得的结合率达到了30％，10个克隆的结合率高于40％。RGmH克隆的结合特点和序列并未给出。表7表示的是rRmY适体的核苷酸序列。其特征序列开始于第23位的核苷，紧随着片段GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(SEQ IDNO 69)，当遇到3’末端的GCUGUCGAU CGAUCGAUCGAUG(SEQ IDNO 70)序列时止。除非另有说明，下面列出的序列是按照从5’端到3’端的方向书写的，表示了在rRmY SELEXTM条件下筛选的能够与IL-23及IL-12结合的序列，其中，嘌呤(A或G)是2’-OH和嘧啶(U或C)是2’-OMe。表7所表示的序列可以是其PAG衍生物，其3’末端可以含有或者不含有加帽(如3’-反转dT)表7rRmY序列(循环10)
SEQ ID NO 71GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAAAUGAGAGCAGGCCGAAGAGGAGUCGCUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 72GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAAAUGAGAGCAGGCCGAAAAGGAGUCGCUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 73GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAAAUGAGAGCAGGCCGAAAAGGAGUCGCUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 74GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGUAAAGCAGGCUGACUGAAAGGUUGAAGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 75GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGUUAAGAGCAGGCUCAGGAAUGGAAGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 76GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAACAAAGCAGGCUCAUAGUAAUAUGGAAGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 77GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAACAAAGCAGGCUCAUAGUAAUAUGGAAGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 78GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAAAAGAGAGCAGGCCGAAAAGGAGUCGCUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 79GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAAAAGGCAGGCUCAGGGGAUCACUGGAAGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 80GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAAGAUAUAAUUAAGGAUAAGUGCAAAGGAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 81GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAUGAGAGCAGGCCGAAAAGGAGUCGCUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 82GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAGAGGCAAGAGAGAGUCGCAUAAAAAAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 83GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGCAGGCUGUCGUAGACAAACGAUGAAGUCGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 84GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGAAAAAGAUAUGAAAGAAAGGAUUAAGAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 85GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGAAGGNAACAANAGCACUGUUUGUGCAGGCGCUGUCGAUCNAUCNAUCNAUGSEQ ID NO 86GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUAAUGCAGGCUCAGUUACUACUGGAAGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 87AGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUAGAAGCAGGCUCGAAUACAAUUCGGAAGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG 表8rRmY IL-23克隆体结合数据
**试验条件为1X DPBS(+Ca2+，Mg2+)，30分钟反转录培养**IL-23(不含载体的蛋白)实施例1C筛选人类IL-23蛋白与脱氧/2’O-甲基-核苷酸的结合体
用脱氧嘌呤(A或G)和2’-O-甲基嘧啶(C或U)及h-IL-23蛋白进行选择性筛选以获得具有IL-23特异性稳定的适体。RNA库的制备。含有序列5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN3OCGCTGTCGATCGATCGATCGATG-S′(ARC256，SEQ ID NO 3)的DNA模板用ABI EXPEDITETMDNA合成器合成，并用标准方法使其脱保护。此模板(SEQ ID NO3)中的一系列N可为任意的核苷酸的组合并产生所得适体的区别序列区域。以5′-TAATACGACTCACTATAGGGA GAGGAGAGAACGTTCTAC-S′(SEQ IDNO 67)和5′-CATCGATCGATCGATCGACAGC-S′(SEQ ID NO 89)为引物扩增DNA模板，然后用作单突变Y639F T7 RNA聚合酶体外转录的模板。反应时各试剂的加入量为200mM Hepes，40mM DTT，2niM亚精胺0.01％Triton X-100，10％PEG-8000，9.6mM MgCl2，2.9mM MnCl2，2mMNTPs，2mM GMP，2mM精胺，0.01units/μL无机磷酸酶，和2μg/mLY639F单突变T7聚合酶，在37℃条件下反应过夜。筛选室温下，将20pmole h-IL-23固定在Nunc Maxisorp培养板的表面，加入100μL of IX PBS缓冲液开始每一循环的筛选。去除上清后，用120μL清洗缓冲液(1X PBS，0.1mg/mL tRNA及0.1mg/mL鲑鱼精DNA(″ssDNA″))清洗孔板5次。在第一次循环过程中有一个阳性筛选步骤在含有固定化蛋白的孔板中加入100pmoles RNA和100μL连接缓冲液(1X PBS，0.1mg/mL tRNA及0.1mg/mL ssDNA)共同培养1小时，去除上清后，用120μL清洗缓冲液洗涤孔板5次。在随后的循环中包含一个阴性筛选。在阳性筛选之前先将RNA在空白孔板中室温条件下培养1小时移除其中的塑性连接序列。从第三次循环开始，要再次引人一个阴性筛选。在阳性筛选之前，室温条件下用100μL封闭液(1X PBS，0.1mg/mL tRNA，0.1mg/mL ssDNA及0.1mg/mL BSA)封闭含有固定化靶标蛋白的孔板一小时。在所有情况下，与固定化h-IL-23蛋白连接的RNA要在ThermoscriptTM逆转录仪(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，以逆转录混合物(3′引物，(SEQ ID NO 89))为引物进行逆转录，之后，在65℃条件下培养1小时，并以所得cDNA为模板进行PCR(Taq聚合酶，New England Biolabs，Beverly，MA)。在“热启动”PCR结合68℃的退火温度条件用使引物-二聚体的形成最小化。所得扩增DNA用Micro Bio-Spin column(Bio-Rad，Hercules，CA)按照操作说明去盐，并将其转录为RNA进行后续循环。每次循环得到的RNA都要用10％的聚丙烯酰胺凝胶纯化。蛋白结合试验。用实施例1A中提到的三层滤膜过滤试验来监测筛选进程，在室温条件下将5′-32P标记的RNA与h-IL-23、1X PBS、0.1mg/mL tRNA、0.1mg/mL ssDNA及0.1mg/mL BSA共同培养30分钟，用夹有定点印记纸的硝化纤维及尼龙过滤层(Schleicher and Schuell)过滤，计算出七点筛选(h-IL-23浓度分别为0.25nM，0.5nM，1nM，4nM，16nM，64nM and 128nM)中6、7、8轮循环连接在硝化纤维层的RNA百分比，按照前面提到的方法计算RNA KD值。经过6轮筛选后，rRmY h-IL-23筛选株中已经富集了h-IL-23的结合体，第8轮筛选后RNA的KD值大约在54nM或更高，将6、7、8轮筛选所得的RNA用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)克隆产生独立的序列，表9中给出这些dRmY克隆的序列。对每一株克隆体进行蛋白结合试验分析，具体操作为在室温条件下，加入1X PBS+0.1mg/mL tRNA，0.1mg/mL鲑鱼精DNA，0.1mg/mL BSA，培养30分钟。表10表示了各个独立序列的结合特点。表9表示的是dRmY适体的核酸序列。每个适体的特征序列开始于第23位的核苷酸，紧随着前面的片段GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(SEQ ID NO 69)，当遇到3’末端的GCUGUCGAUCG AUCGAUCGAUG(SEQ ID NO 90)序列时止。除非另有说明，下面列出的序列是按照从5’端到3’端的方向书写的，表示了在dRmY SELEXTM条件下筛选的能够与IL-23及IL-12结合的适体的序列，其中嘌呤(A或G)是脱氧的，嘧啶(U或C)是2’-O-Me。表9所表示的核酸序列可以是这些核酸的PAG衍生物，其3’末端可以含有或者不含有加帽(如3’-反转dT)表9dRmY IL-23的克隆序列SEQ ID NO 91(ARC 489)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGCGCCGGUGGGCGGGCAUUGGGUGGAUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 92(ARC490)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGCCUUUUGGGUAAGGGGAGGGGUGCCGGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 93GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGUAACGGGGUGGGAGGGGCGAACAACUUGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 94(ARC491)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGCGCCGGUGGGUGGGCAUAGGGUGGAUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 95GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGGCUACGGGGAUGGAGGGUGGGUCCCAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 96GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACACGGGGUGGGAGGGGCGAGUCGCAUGGAUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 97(ARC492)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUCAAUGACCGCGCGAGGCUCUGGGAGAG GGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG
表10-dRniY IL-23适体结合数据
**试验条件为1X DPBS+0.1mg/mL tRNA ssDNA，0.1mg/mL BSA，30分钟反转录培养**R&D IL-23(不含载体的蛋白)NB＝没有发现结合现象实施例1D能与人类IL-23蛋白相连的脱氧/2’-O-甲基核苷酸序列的附加筛选
简介使用了三种方法检测能够与h-IL-23结合的适体，使用了含脱氧/2’-O-甲基核苷酸序列的库。在选择过程中，用到了2’-O-MeC或U及脱氧A或G。第一种选择方法(dRmY h-IL-23)是对h-IL-23的直接筛选，第二种筛选方法(dRmY h-IL-23/IL-12neg)中包含一个可以富集能够与p19序列结合的适体的阴性筛选，其中p19序列是h-IL-23序列的特征区域。第三种方法(dRmY h-IL-23-S)中，在阳性筛选步骤中提高了严谨度，使用长时间清洗使该筛选去筛选那些具有更强的结合力的适体。这三种筛选都得到对h-IL-23的适体。有的专门特异于h-IL-23，有的则对h-IL-23和h-IL-12表现出交叉特异性。dRmY筛选加入3×1014分子的2’-O-Me-C或U及脱氧A或G修饰的RNA序列文库，其中的序列是用ABI EXPEDITETMDNA合成器合成并脱蛋白的片段，带有5′-GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC-NSO-GGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG-S′(ARC520)(SEQ IDNO 98)，启动第一轮dRmY h-IL-23筛选循环。模板(SEQ ID NO98)中的一系列N可为任意的核苷酸的组合，且导致所得到的适体的独特序列。室温下，将20pmole h-IL-23固定在Nunc Maxisorp培养板的表面，加入100μL of IX PBS缓冲液反应一小时开始每一循环的筛选。当表面物质完全反应后，去除上清，用120μL清洗液(1X PBS，0.1mg/mLtRNA及0.1mg/mL鲑鱼精DNA(″ssDNA″))清洗孔板5次。在第一次循环过程中，在含有固定化蛋白的孔板中加入500pmoles(3×1014分子)RNA和100μL连接缓冲液(IX PBS，0.1mg/mL tRNA及0.1mg/mL ssDNA)共同培养1小时，当表面物质反应完全后用120μL清洗液洗涤孔板5次。在随后的循环中包含一个阴性筛选在阳性筛选之前先将RNA在空白孔板中室温条件下培养1小时移除其中的塑性连接序列。从第三次循环开始，要再次引人一个阴性筛选在阳性筛选之前，室温条件下用100μL封闭液(IX PBS，0.1mg/mL tRNA，0.1mg/mLssDNA及0.1mg/mL BSA)封闭含有固定化靶标蛋白的孔板一小时。第三次循环中，在h-IL-23阳性筛选前，室温下将RNA库在经过一小时封闭试验的孔板中多进行1小时的阴性培养，从而将dRmY h-IL-23筛选株与dRmY h-IL-23/IL-12neg筛选株区分开，进行了附加培养的筛选株在后续循环中表现出更好的亲和能力。(见表1IB)
另外一种能将h-IL-23结合体和h-IL-12结合体区别开来的方法是在阳性筛选过程中，在RNA的浓度较低的条件下加入h-IL-12，培养一小时以后，h-IL-23的特异性结合体能够与固定化h-IL-23相连，而h-IL-12结合体将被洗去。在阳性筛选过程中加入严谨清洗剂，与h-IL-23一起培养1小时后，dRmY h-IL-23-S筛选株将在第六轮循环之后，从dRmY h-IL-23序列中分离，然后加入100μL of IX PBS，0.1mg/niL tRNA及0.1mg/mL ssDNA，继续培养30分(表11C)。在本发明筛选具有高亲和性分子过程中多次用到了严谨洗涤过程。在所有情况下，与固定化h-IL-23蛋白结合的RNA要在ThermoscriptTM逆转录仪(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，以逆转录混合物(3′引物5′-C ATCGATGATCGATCGATCGAC-S′，(SEQ ID NO 100))为引物进行逆转录，之后，在65℃条件下培养1小时，并以所得cDNA为模板进行PCR((20mM Tris pH 8.4，50mM KCl，2mM MgCl2，0.5μM of 5′引物5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-S′(SEQ ID NO 99)，0.5μM of 3′引物(SEQ IDNO 100)，0.5mM各种脱氧核苷，0.05units/μL Taq聚合酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)，按照下列循环条件进行PCR反应a)94℃解链30s；b)55℃延长30s；c)72℃复性30s，直至生成足够的产物，表1IA-11C中“PCR阈限”表示了得到足够PCR产物的最少循环次数。用QIAquick PCR纯化仪(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR模板，并用此模板，加入00mM Hepes，40mM DTT，2mM亚精胺，0.01％Triton X-100，10％PEG-8000，9.6mM MgCl2，2.9mM MnCl2，2mM NTPs，2mM GMP，2mM精胺，0.01units/μL无机磷酸酶和2μg/mL Y639F单突变T7 RNA聚合酶，再37℃条件下转录RNA，反应过夜，加入50mMEDTA终止转录反应，然后用乙醇沉淀，经1.5mm变性聚丙烯酰胺凝胶柱(8M尿素，10％丙烯酰胺；19∶1丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺)纯化，然后在37℃条件下用300mM NaOAc，20mM EDTA洗提，再用乙醇沉淀。下表中列出了每轮筛选时的筛选条件。表11AdRmY hIL-23筛选条件IL-23 表11BdRmY IL-23/IL-12neg筛选条件IL-23/12阴性筛选 表11CdRmY hIL-23-s筛选条件IL-23S 蛋白结合能力分析按照实施例1A所述方法，在筛选过程中使用定点印记杂交实验检测所的筛选体的蛋白结合能力，当含有h-IL-23条件下RNA的阳性连接率与不含有h-IL-23条件下RNA的阳性结合率相比有显著的提高时，用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)克隆RNA库，6轮筛选过后，三种筛选方法得到的特征序列是相似的，选择其中45株独立的克隆系进行筛选先用ABI EXPEDITETMDNA合成器合成这45株克隆体并按照标准方法除蛋白，再用10％PAGE凝胶纯化，300mM NaOAc及20mM EDTA洗提，之后用乙醇沉淀。这些克隆体的5’-末端用γ-32P ATP标记，在3点印记屏(0nM，20nM，和100nM h-IL-23；0nM，20nM，和100nM h-IL-12)上检验他们对IL-23及IL-12的结合能力(没有表示数据)。在蛋白浓度为20nM和100nM时，对IL-23和IL-12都表示出良好的结合能力的克隆体进行进一步分析，按照前面描述的蛋白滴定方法测定克隆体的KD值，蛋白浓度从0nM到480nM(3倍稀释)。当混合物中RNA与蛋白的比为1∶1时，其结果可通过下列公式计算得出，片段结合率＝幅度*([IL-23]/(KD+[IL-23])+原有结合剂)(KaleidaGraph v.3.51，Synergy Software)。表13表示了有较高亲和能力的克隆体的蛋白结合特点，表12列出了相应的克隆序列。表12所列的是dRmY适体的核酸序列，各适体的特征序列开始于第23位的核苷酸，紧随片段GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(SEQ ID NO 101)，当遇到3’末端为GUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG(SEQ ID NO 102)的序列时止。除非另有说明，下面列出的序列是按照从5’端到3’端的方向书写的，表示了在dRmY SELEXTM条件下筛选的能够与IL-23和/或IL-12结合的适体的序列，其中是嘌呤(A和G)为2脱氧和嘧啶(U和C)为2’-O-甲基。表12中列出的每个酸序列可用PAG衍生而得，并可含有或者不含有加帽(如3’-反向dT)表12dRmY克隆序列SEQ ID NO 103(ARC611)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCAAGGCAAUUGGGGAGUGUGGGUGGGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 104(ARC612)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCAAGUAAUUGGGGAGUGCGGGCGGGGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 105(ARC614)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAAGGCGGUACGGGGAGUGUGGGUUGGGGCCGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 106(ARC616)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAUAUAGGCGGUACGGGGGGAGUGGGCUGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 107(ARC620)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGAAAGGCGCUUGCGGGGGGUGAGGGAGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 108(ARC621)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCGGUUACGGGGGAUGCGGGUGGGACAGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 109(ARC626)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCAAGUAAUUGGGGAGUGCGGGCGGGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 110(ARC627)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCAAGUAAUUGGGGAGUGCGGGCGGGGUGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 111(ARC628)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCAAGGCAAUUGGGGAGCGUGGGUGGGGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 112(ARC632)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAAUUGCAGGUGGUGCCGGGGGUUGGGGGCGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 113(ARC635)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCUCAAAAGAGGGGGAUGUGGGAGGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 114(ARC642)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCGCAGCCAGCGGGGAGUGAGGGUGGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 115(ARC643)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCCGAUGAGGGGGAGCAGUGGGUGGGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 116(ARC644)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUAGUGAGGCGGUAACGGGGGGUGAGGGUGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 117(ARC645)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGUAGGCAAGAUAUUGGGGGAAGCGGGUGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUGSEQ ID NO 118(ARC646)GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACACAUGGCUCGAAAGAGGGGCGUGAGGGUGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG表13dRmY克隆结合概括
*逆转录培养30分，用定点印记实验确定KD值*缓冲溶液体系为1X PBS+0.1mg/mL tRNA，ssDNA，BSA人类IL-23适体筛选概述
针对IL-23 SELEXTM来讲，不同的筛选条件和方法能够得到不同的适体，有的稳定性好有的长度较小，其结合特点也不同，rRfY筛选的适体大小在15-460nM之间具有亲和性，并且在优化post-SELEXTM试验条件之前，大小在50nM-5μM之间的序列对IC50S有很好的细胞保护作用。使用适当的方法可以进一步缩短此序列同时可以增强细胞基础实验中序列的细胞保护作用。此适体对IL-23表现出很好的辨别力，比对IL-12的辨别力高100倍以上。通过rRmY筛选所得适体有在8nM到3μM之间的亲和性，然而相对rRfY筛选的适体来讲，它的细胞作用较小，rGmH完成了一个单点筛选，但是没有继续下去，这是由于它与基质的结合能力不如rRmY克隆系，将48个粗rGmH克隆体稀释200倍之后，以0.1mg/mL tRNA作竞争剂进行结合反应，结果只有14％的结合率，而同样条件下rRmY单克隆系得结合率能够达到30％，10克隆系的结合率能高于40％。dRmY筛选的适体大小在3-200nM之间具有高度亲和性，并且在优化post-SELEXTM试验条件之前，大小在50nM-500nM之间的适体对IC50S有显著的细胞保护作用(在实施例3中会介绍到)。，这些适体中的一些对IL-23的鉴别能力比对IL-12的鉴别能力大4倍，且可被后续的优化过程所提高。
实施例1E针对小鼠的筛选(包含(“m”)-IL-23及2’-F-嘧啶的RNA库)(rRfY)
简介使用由2’-OH-嘌呤及2’-F-嘧啶(rRfY组合物)组成的文库，使用了两种筛选方法确定mIL-23适体。第一种选择方法(m-IL-23)是对m-IL-23的直接筛选，第二种筛选方法(mIL-23S)是一种更为严谨的筛选，其中在起始循环时，为了能够筛选出结合能力强结合体，RNA及蛋白质的浓度都比较低，这两种筛选都得到了mIL-23适体。筛选进行两个筛选(m-IL-23和mIL-23S)，以2×1014分子的2’-F-嘧啶修饰的RNA库，与5′GGAGCGCACUCAGCCAC-N40-UUUCGACCUCUCUGCUAG C 3′(ARC275)(SEQ ID NO 119)培养，包括一个5′末端用γ32P ATP标记的RNA库，以及小鼠IL-23蛋白(分离的)，开始筛选，此模板(SEQ ID NO 119)中的一系列N可为任意序列的核苷酸，只要其所获适体中的独特序列。在mIL-23第一轮筛选过程中，加入50pmoles的蛋白及RNA基因库，使其总体积达到100μL，在室温下培养1小时，在mIL-23S第一轮筛选过程中，加入65pmoles的mIL-23及RNA基因库，使其总体积达到1300μL，在室温下培养1小时，在1X PBS缓冲液中开始进行筛选，用0.45μm的硝化纤维管Schleicher & Schuell(Keene，NH)分离游离的RNA分子及RNA:mIL-23混合物，在分离之前先用1ml IX PBS缓冲液清洗柱子，然后加入含有RNA:蛋白质的溶液，在2000rpm条件下离心1分钟，用缓冲液洗去(在第一轮循环中用2×500μL 1X PBS洗柱，在以后的循环中，要用更严谨的洗剂清洗多次来富集特异性结合体)非特异性结合体，然后，用2×200μL(在以后的循环中用2×100μL)洗提液(7M尿素，100mM醋酸钠，3mM EDTA，预热至90℃)洗提结合在滤网上的RNA:蛋白复合物，再用40μg糖原，1体积的异丙醇沉淀洗提出来的RNA，用ThermoscriptTMRT-PCR系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)并根据该制造商的介绍将此RNA进行逆转录，加入20mM Tris pH 8.4，50mM KCl，2mM MgCl2，0.5μM 5′末端引物5′TAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCAC 3′(SEQ ID NO 120)，0.5μM of 3′末端引物5′GCTAGCAGAGAGGTCGAAA 3′(SEQ ID NO121)，0.5mM各种dNTP，0.05units/μL Taq聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)进行反转录PCR，按照下列循环条件进行PCR反应a)94℃解链30s；b)60℃延长30s；c)72℃复性30s，直至生成足够的产物，表14中“PCR阈限”表示了得到足够PCR产物的最少循环次数。用QIAquick PCR纯化盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物，将PCR所得DNA模板用α32P标记的GTP进行转录，加入4％PEG-8000，40mM Tris pH 8.0，12mM MgCl2，1mM亚精胺，0.002％TritonX-IOO，3mM 2′OH嘌呤，3mM 2′F嘧啶，25mM DTT，0.25units/100μL无机磷酸酶，2μg/mL T7 Y639F单突变RNA聚合酶，5uCiα32P标记的GTP，在37℃条件下反应过夜。后续循环的试验方法与第一轮循环相同，只是多了一个阴性筛选步骤，在与靶标蛋白培养前，RNA库要先经过0.45微米的硝化纤维膜除去能与膜结合的序列，再后续阳性筛选步骤中，使用滤出液。在循环筛选过程中使用的RNA要经过凝胶纯化，加入50mM EDTA终止转录反应，然后用乙醇沉淀，经1.5mm变性聚丙烯酰胺凝胶柱(8M尿素，10％丙烯酰胺；19∶1丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺)纯化，然后用300mM NaOAc，20mM EDTA洗提，再用300mM醋酸钠及2.5体积的乙醇沉淀。筛选之后相对蛋白质来讲RNA有所剩余(～1μM RNA)，在特异性筛选过后，根据不同的筛选，蛋白质的浓度降到不同的的低浓度，根据试验情况，从第二或第三轮筛选时加入0.1mg/ml的竞争剂tRNA。一共进行了7轮筛选，并在选定的循环中进行结合能力的检测。表14列出了所有的筛选细节，包括每轮筛选的RNA浓度、蛋白浓度和tRNA浓度。结合能力检测和洗提值(与蛋白结合的RNA占通过滤膜的总RNA的比率)可以用来监测筛选过程。表14rRfY mIL-23筛选条件1.rRfY mIL-23
2.rRfY mIL-23S筛选(严谨的) rRfY mIL-23蛋白结合能力分析实验如前所述，用定点印记杂交试验来监测RNA的蛋白结合能力。当观察含有m-IL-23条件下RNA的结合的显著性水平时，用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)克隆RNA库，对于m-IL-23的两种筛选系统来讲，克隆的是第7次循环所得RNA模板，用8点mIL-23滴定测试每个筛选得到16株克隆体。在总共32株筛选株中，有7株有特异性结合曲线，并在表16中列出，表15列出了对应的序列，其他筛选株的结合曲线与未筛选前相同，没有表现出特异性。随后，对mIL-23具有强结合能力的克隆，用同样的方式，筛选对小鼠IL-12、人类IL-23及人类IL-12有结合的蛋白。表15所列的是rRfY 适体的核酸序列。其每个适体的特征序列开始于第18位的核苷酸，紧随着片段GGAGCGCACUCAGCCAC(SEQID NO 122)，当遇到3’末端为UUUCGACCUCUCUGCUAGC(SEQ ID NO123)的序列时止。除非另有说明，下面列出的序列是按照从5’端到3’端的方向书写的，表示了在rRfY SELEXTM条件下筛选的能够与IL-23及IL-12结合的序列，其中嘌呤(A和G)为2’-OH并且嘧啶(C和D)为2’-氟，表15所表示的核酸序列可以是这些核酸的PAG衍生物，其3’末端可以含有或者不含有加帽(如3’-反向dT)
表15mIL-23 rRfY克隆序列SEQ ID NO 124(ARC1628)GGAGCGCACUCAGCCACAGGUGGCUUAAUACUGUAAAGACGUGCGCGCAGAGGGAUUUUCGACCUCUCUGCUAGCSEQ ID NO 125(ARC1629)GGAGCGCACUCAGCCACCGUAAUUCACAAGGUCCCUGAGUGCAGGGUUGUAUGUUUGUUUCGACCUCUCUGCUAGCSEQ ID NO 126(ARC1630)GGAGCGCACUCAGCCACUCUACUCGAUAUAGUUUAUCGAGCCGGUGGUAGAUUAUGAUUUCGACCUCUCUGCUAGCSEQ ID NO 127(ARC1631)GGAGCGCACUCAGCCACGCCUACAAUUCACUGUGAUAUAUCGAAUUAUAGCCCUGGUUUCGACCUCUCUGCUAGCSEQ ID NO 128(ARC1632)GGAGCGCACUCAGCCACCGGCUUAAUAUCCAAUAGGAACGUUCGCUCUGAGCAGGCGUUUGGACCUCUCUGCUAGCSEQ ID NO 129(ARC1633)GGAGCGCACUCAGCCACAGCUCGGUGGCUUAAUAUCUAUGUGAACGUGCGCAACAGCUUUCGACCUCUCUGCUAGCSEQ ID NO 130(ARC1634)GGAGCGCACUCAGCCACCUUGGGCUUAAUACCUAUCGGAUGUGCGCCUAGCACGGAAUUUCGACCUCUCUGCUAGC
表16mIL-23 rRfY克隆的蛋白结合能力
*逆转录培养30分，用定点印记实验确定KD值*缓冲溶液体系为1X PBS+0.1mg/mL BSA
实施例1F具有抗小鼠IL-12蛋白特异性的小鼠IL-23适体的筛选
简介用一种方法筛选了抗小鼠IL-12蛋白特异性(mIL-12)的小鼠IL-23(mIL-23)适体。此方法从第三轮筛选起与上面所描述的rRfYmIL-23S筛选方法区别开来，此方法筛选所得适体对mIL-23的结合能力比对mIL-12强3-5倍。
mIL-23S/mIL-12neg rRfY筛选为了获得抗小鼠IL-12蛋白特异性的小鼠IL-23适体，小鼠IL-12被包括在阴性筛选中，其与实施例1A所提到的阴性筛选试验(PN-IL-23)相似，。实施例1E中提到的mIL-23S筛选方法的第2循环产物RNA可以用来进行R3PN mIL-23/12neg筛选，同样，在此过程中也包括一个mIL-12的阴性筛选过程。总共进行了9轮实验，并在选定的轮次进行结合检测。表17总结了筛选条件，包括每轮筛选的RNA浓度、蛋白浓度和tRNA浓度。结合能力检测和洗提值(与蛋白结合的RNA占通过滤膜的总RNA的比率)可以用来监测筛选过程。表17rRfY mIL-23S/mIL-12neg过滤筛选总结
缓冲液1X PBS*阳性培养1Hr
rRfY mIL-23S/mIL-12neg蛋白结合能力分析。在筛选过程中，按前面所述，用定点印记杂交试验来监测RNA的蛋白结合能力。用以32P标记的RNA结合mIL-23或mIL-12，加入IX PBS和O.1mg/mL BSA使其最终体积为30μL，在室温条件下培养30分，在定点印记仪上(Schleicherand Schuell Minifold-1 Dot Blot，Acrylic)反应，按照前面所述方法就可以得到结合能力曲线，当观察含有m-IL-23条件下RNA的阳性结合的显著性水平时，按照厂家说明书使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)克隆RNA库。克隆的是第9次循环所得RNA模板，用8点mIL-23滴定测试从筛选中得到的10株克隆体。随后，筛选能够明显的结合mIL-23的克隆体对mIL-12的结合能力。表18概括了结合克隆的蛋白结合能力。在筛选所得的10株中，有4株对mIL-23和mIL-12表现出不同的特异性结合能力，其他克隆的结合曲线与未筛选前相同，没有表现出特异性。这四个结合克隆的序列在表19中表示出来。表18rRfY mIL-23S/mIL-12neg克隆的结合能力
*逆转录培养30分，用以确定KD值*缓冲溶液体系为1X PBS+0.1mg/mLBSA
表19所列的是rRfY适体的核酸序列，其特征序列开始于第18位的核苷酸，紧随着片段GGAGCGCACUCAGCCAC(SEQ ID NO 122)，当遇到3’末端的UUUCGACCUCUCUGCUAGC(SEQ ID NO 123)序列时止。除非另有说明，下面列出的序列是按照从5’端到3’端的方向书写的，表示了在rRfY SELEXTM条件下筛选的能够与IL-23结合的序列，其中嘌呤(A和G)为2’-OH嘌呤并且嘧啶(A或G)为2’-氟嘧啶。表19所表示的核酸序列可以是这些核酸的PAG衍生物，其3’末端可以含有或者不含有加帽(如3’-反向dT)表19.rRfY mIL-23S/mIL-12neg的序列顺序SEQ ID NO 131(AMX(369)_F1)GGAGCGCACUCAGCCACGGUUUACUUCCGUGGCAAUAUUGACCUCNCUCUAGACAGGUUUCGACCUCUCUGCUAGCSEQ ID NO 132(AMX(369)_H1)(ARC1914)GGAGCGCACUCAGCCACCUGGGAAAAUCUGGGUCCCUGAGUUCUAACAGCAGAGAUUUUUCGACCUCUCUGCUAGCSEQ ID NO 133(AMX(369)_B2)GGAGCGCACUCNGCCACUUCGGAAUAUCGUUGUCUUCUGGGUGAGCAUGCGUUGAGGUUUCNACCUCUCUGCUAGCSEQ ID NO 134(AMX(369)_G3)GGAGCGCACUCAGCCACUGGGGAACAUCUCAUGUCUCUGACCGCUCUUGCAGUAGAAUUUNGACCUCUCUGCUAGC实施例2组合物、序列优化及序列实施例2A最小化
在筛选成功并确定适体排列顺序之后，除了确定序列的体外功能性，还要将此序列进行最小化处理以获得一个较小的寡核苷酸序列，此序列保留了对靶标蛋白结合特异性但具有提高的结合特点，例如提高了KD值和/或IC50S值。
实施例2A.1rRfY克隆的最小化
将实施例1A中所得的rRfY克隆序列分成两个主要的适体部分，用Type1和Type2表示，图8A和8B显示了序列实施例并预测了Type1和Type2适体的二级结构构象。图9A和9B显示了最小化适体序列并预测了Type1和Type2的二级结构构象。在实施例1所描述的IL-23蛋白结合试验及实施例3所描述的以细胞为基础的分析试验的基础上，选择rRfY PN-IL-23筛选所得RNA的几个Type1克隆体，包括AMX84-A10(SEQ ID NO 43)，AMX84-B10(SEQ ID NO44)和AMX84-F11(SEQ ID NO46)进行进一步表征。最小化DNA所构建的寡核苷酸经过转录，凝胶纯化，用定点印记测试进行h-IL-23结合能力试验。A10min5(SEQ ID NO 139)和AlOminó(SEQ ID NO 140)是以AMX84-A10(SEQ ID NO43)为基础的最小化克隆系，B10min4(SEQ IDNO144)和B10min5(SEQ ID NO145)是以AMX84-B10(SEQ ID NO44)为基础的最小化克隆系，F11min2(SEQ ID NO147)是AMX84-F11(SEQ IDNO46)为基础的最小化克隆系(见图9)。这些克隆系的5’末端用γ-32P ATP标记，用与其母系相同的定点印记杂交试验方法测定KD值，所得的克隆系都有明显的蛋白结合能力(见表21)，如在实施例3中所讨论的，细胞分析试验结果证明，这些子系相对于他们的母系有更好的细胞水平的作用。另外，作为最小化序列例证的Type1和Type2适体制备及检测的方法是针对Type1和Type2组共有的序列进行的。Type1.4(SEQID NO 151)和Type1.5(SEQ ID NO152)是Type1组中具有此特点的两个子系，与Type1组其他最小化子系，它们显示了高的IL-23蛋白结合能力，以及最强的细胞检测活性。表20列出了rRfY的最小化序列，表21显示了这些最小化序列的结合数据。对于表20所表示的最小化rRfY适体，其嘌呤(A和G)为2’-OH嘌呤和嘧啶(U和C)为2’-F-嘧啶。除非另外指出，下面列出的序列是按照从5’端到3’端的方向书写的，表20所列出的核酸序列可以是这些核酸的PAG衍生物，其3’末端可以含有或者不含有加帽(如3’-反向dT)表20-PN-IL-232′F(rRfY)最小化适体序列SEQ ID NO 135(A10.min1)GGAGAUCAUACACAAGAAGUUUUUUGUGCUCUGAGUACUCAGCGUCCGUAAGGGAUCUCCSEQ ID NO 136(A10.min2)GGAGUCUGAGUACUCAGCGUCCGUAAGGGAUAUGCUCCGCCAGACUCCSEQ ID NO 137(A10.min3)GGAGUUACUCAGCGUCCGUAAGGGAUAUGCUCCGACUCCSEQ ID NO 138(A10.min4)GGAGUCUGAGUACUCAGCGUCCCGAGAGGGGAUAUGCUCCGCCAGACUCCSEQ ID NO 139(A10.min5)GGAGCAUACACAAGAAGUUUUUUGUGCUCUGAGUACUCAGCGUCCGUAAGGGAUAUGCUCCSEQ ID NO 140(A10.min6)GGAGUACGCCGAAAGGCGCUCUGAGUACUCAGCGUCCGUAAGGGAUACUCCSEQ ID NO 141(B10.min1)GGAGCGAAUCAUACACAAGAAGUGCUUCAUGCGGCAAACUGCAUGACGUCGAAUAGAUAUGCUCSEQ ID NO 142(B10.min2)GGAUCAUACACAAGAAGUGCUUCAUGCGGCAAACUGCAUGACGUCGAAUAGAUCCSEQ ID NO 143(B10.min3)GGAUCAUACACAAGAAGUGCUUCACGAAAGUGACGUCGAAUAGAUCCSEQ ID NO 144(B10.min4)GGAGCAUACACAAGAAGUGCUUCAUGCGGCAAACUGCAUGACGUCGAAUAGAUAUGCUCCSEQ ID NO 145(B10.MIN5)GGAGUACACAAGAAGUGCUUCCGAAAGGACGUCGAAUAGAUACUCCSEQ ID NO 146(F11.min1)GGUUAAAUCUCAUCGUCCCCGUUUGGGGAUSEQ ID NO 147(F11.min2)GGACAUACACAAGAUGUGCUUGAGUUAAAUCUCAUCGUCCCCGUUUGGGGAUAUGUCSEQ ID NO 148(Type1.1)GGCAUACACGAGAGUGCUGUCGAAAGACUCGGCCGAGAGGCUAUGCCSEQ ID NO 149(Type1.2)GGCAUACGCGAGAGCGCUGGCGAAAGCCUCGGCCGAGAGGCUAUGCC
SEQ ID NO 150(Type1.3)GGAUACCCGAGAGGGCUGGCGAAAGCCUCGGCGAGAGCUAUCCSEQ ID NO 151(Type1.4)GGGUACGCCGAAAGGCGCUUCCGAAAGGACGUCCGUAAGGGAUACCCSEQ ID NO 152(Type1.5)GGAGUACGCCGAAAGGCGCUUCCGAAAGGACGUCCGUAAGGGAUACUCCSEQ ID NO 153(Type2.1)GGAAUCAUACCGAGAGGUAUUACCCCGAAAGGGGACCAUUCCSEQ ID NO 154(D9.1)GGAAUCAUACACAAGAGUGUAUUACCCCCAACCCAGGGGGACCAUUCCSEQ ID NO 155(C11.1)GGAAGAAUGGUCGGAAUCUCUGGCGCCACGCUGAGUAUAGACGGAAGCUCCGCCAGASEQ ID NO 156(C11.2)GGAGGCGCCACGCUGAGUAUAGACGGAAGCUCCGCCUCCSEQ ID NO 157(C10.1)GGACACAAGAGAUGUAUUCAGGCGGUCCGCAUUGAUGUCAGUUAUGCGUAGCUCCGCCSEQ ID NO 158(C10.2)GGCGGUCCGCAUUGAUGUCAGUUAUGCGUAGCUCCGCC表21--PN-IL-23 rRfY最小化片段的结合数据
**逆转录培养30分，缓冲溶液体系为1X PBS+0.1mg/mL tRNA**R&D IL-23(纯蛋白)
实施例2A.2dRmY筛选1的最小化
经过dRmY筛选得到能够连接IL-23的适体，并确定该适体的寡核苷酸序列(如上面实施例1C)，将此序列系统的优化获得具有相同结合特性的更小的寡核苷酸序列，在实施例1所描述的IL-23蛋白结合试验及实施例3所描述的以细胞为基础的分析试验的基础上，选择ARC489(SEQ ID NO 91)(74mer)进行后续试验，设计并合成3个以ARC489(SEQID NO 91)为基础的最小化结构，用γ-32P ATP标记5’末端，加入1X PBS+0.1mg/mL tRNA，0.1mg/mL ssDNA，0.1mg/mL BSA在室温条件下培养30分钟进行定点印记杂交试验，测定KD值，表22表示了dRmY适体的最小化序列，表23包含这些最小化适体的结合能力数据。只有一个最小化克隆系ARC527(SEQ ID NO 159)能够与IL-23结合，在实施例3中，对此克隆系进行TransAMTMSTAT3活性分析试验，结果证明与其母系ARC489(SEQ ID NO 91)相比，它的结合能力较小。对于表22所描述的最小化dRmY适体，嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤和嘧啶(U和C)为2’-O-Me嘧啶。除非另外指出，下面列出的序列是按照从5’端到3’端的方向书写的，表22所表示的核酸序列可以是这些核酸的PAG衍生物，其3’末端可以含有或者不含有加帽(如3’-反向dT)
表22dRmY的最小化序列SEQ ID NO 159(ARC527)ACAGCGCCGGUGGGCGGGCAUUGGGUGGAUGCGCUGUSEQ ID NO 160(ARC528)GCGCCGGUGGGCGGGCACCGGGUGGAUGCGCCSEQ ID NO 161(ARC529)ACAGCGCCGGUGUUUUCAUUGGGUGGAUGCGCUGU表23dRmY的最小化序列的蛋白结合能力
**R&D IL-23(纯蛋白)NB＝没有发现结合现象实施例2A.3dRmY筛选2的最小化
经过dRmY筛选得到能够连接IL-23的适体(实施例1D中讲到的)，并确定该适体的寡核苷酸序列，将此序列系统的优化获得保留结合特性的更小的寡核苷酸序列。根据实施例1D中对dRmY片段的观察及序列分析试验可以假设dRmY h-IL-23的结合序列活性中心及其最小化序列的四级结构呈G型折叠(见图10)，对其功能性结合序列进行结构分析可以证实此序列呈双G结构与G四级结构构成一致(见表24)。将具有G折叠结构的序列分成两个子集，在第一子集中含有3个碱基对，在第二个子集中含有2个。多处文献(Arthanari et al，Nucleic Acids Research，26(16)3724(1996)；Marathais et al，Nucleic Acids Research，28(9)1969(2000)；Joyce et al，Applied Spectroscopy，58(7)831(2004))报道可以用溴乙非啶荧光性一结合RNA及DNA就被增强，N-甲基中卟啉荧光分析法(NMM)经结合G折叠结构就被增强(参见Arthanari et al，Nucleic Acids Research，26(16)3724(1996)；Marathais et al，Nucleic Acids Research，28(9)1969(2000)；Joyce etal，Applied Spectroscopy，58(7)831(2004))。如图11所示，NMM荧光证实ARC979(SEQ ID NO 177)具有G四级结构，根据守则，100mL反应液中包含约1mM的NMM、约2mM的适体及含有Mg2+和Ca2+的Dulbecco′s磷酸缓冲液，用SpectraMax Gemini XS荧光分析仪分析，检测波长为550-750nm，还有一个附加的检测波长405nm。在此试验中，使用抗凝血酶DNA适体ARC183(Macaya et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，903745(1993))的G型折叠结构作为本试验中的阳性对照。ARC1346适体的大小及核苷组合物与ARC979(SEQ ID NO 177)相似，但是ARC979不含有G折叠结构，其在本实验中用做阴性对照。由图11可知，在NMM荧光分析试验中，ARC183和ARC979有显著的增加，但作为阴性对照的ARC1346却没有。用ABI EXPEDITETMDNA合称仪合成最小化序列，并按照标准方法去保护，然后用10％PAGE凝胶纯化所得最小化克隆体，用300mM NaOAc和20mM EDTA做洗提液将RNA洗提出来，用乙醇沉淀回收。所得克隆体的5’末端用γ-32P ATP标记，在定点印记杂交的方法中使用直接结合测试来确定其KD值，其中对适体实施放射性标记并保持在痕量浓度(＜90pM)，而IL-23浓度则有变化，在试验过程中加入含有0.1mg/mL BSA的IX PBS，室温下培养30分使RNA与蛋白直接结合。适体结合分数相对于[IL-23]通过下面等式计算KD值适体结合分数＝振幅*([IL-23]/(KD+[IL-23]))+基质结合
dRmY筛选方法2的最小化序列也进行了竞争性分析，在试验中，将冷却后的适体滴定，再加入用32P ATP标记的适体作为竞争剂，反应过程中保持IL-23为常量，标记的痕量适体为常量，未标记的适体浓度是改变的，按照下面公司计算KD值适体结合分数＝振幅*([适体]/(KD+[适体]))+基质结合含有G折叠结构的最小化片段是功能性结合体，然而根据折叠理论推测具有茎环结构(RNAstructure；D.H.Mathews，et al，″ExpandedSequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction ofRNA Secondary Structure″.Journal of Molecular Biology，288，911-940，(1999))但不含有双G折叠结构的最小化片段(ARC793(SEQ ID NO 163))没有结合功能。表25列出了最小化序列及其母克隆，表26概括了直接结合试验(+/-tRNA)、竞争结合试验分析所得的最小化序列的结合特点。表24功能性克隆序列(只表示了含有G折叠结构的区域)
表12中能看到表24中列出的克隆体的SEQ ID NO。表25所描述的最小化dRmY适体，嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤和嘧啶(U和C)为2’-O-Me嘧啶。除非另外指出，下面列出的序列是按照从5’端到3’端的方向书写的，表25所表示的核酸序列可以是这些核酸的PAG衍生物，其3’末端可以含有或者不含有加帽(如3’-反向dT)表25dRmY最小化序列 表26dRmY最小化序列的蛋白结合能力 竞争性结合数据在饱和结合实验中进行再分析，试验中，配体(适体)的浓度是变化的，受体(IL-23)的浓度保持恒定，以总共加入的适体量为横坐标，以适体浓度范围为纵坐标绘制曲线。ARC979(SEQ IDNO 177)用在这个分析中。在浓度为～1.7nM时ARC979的结合达到饱和(见图12)，由此可知，能够结合这些适体的IL-23浓度为1nM，占有所IL-23的2％(1/50)，计算出KD值为8nM，此结果与按照竞争性结合公式计算所得值(8.7nM)相符。用同样的方法计算IL-12的竞争性结合数据(图13)，IL-12片段的活性较高(10％)，ARC979对IL-23的结合特异性比对IL-12的结合特异性高33倍，这一数据要远远大于通过直接结合公式所预计的值(2-5倍)。随后，使用先前描述的结合反应条件(加入含有0.1mg/mLBSA的IX PBS缓冲液培养30分)和不同的结合反应条件(加入含有Mg2+和Ca2+的Dulbecco′s磷酸缓冲液和0.1mg/mL BSA，在室温下培养30分)对ARC979重复进行直接结合试验。对两种试验条件下产生的适体用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，然后用γ-32P ATP标记其5’末端，与IL-23蛋白进行直接结合试验，在后来的定点印记杂交试验中用8点蛋白滴定(可以是{100nM，30nM，10nM，3nM，1nM，300pM，100pM，0pM}也可以是{10nM，3nM，1nM，300pM，100pM，30pM，10pM，0pM})。用KaleidaGraph(KaleidaGraph v.3.51，Synergy Software)通过下面公式计算KD值y＝(max/(1+K/protein))+yint。试验证明缓冲液条件能够影响结合能力，在IX PBS缓冲液中，ARC979的KD值为～10nM，然而在IX Dulbecco′sPBS条件下，ARC979的KD值为～1nM(见图14)，在后续试验中将进一步确定KD值，其结果应与实施例3D中描述的PHA原细胞试验IC50值(～6nM)相一致。
实施例2A.4小鼠IL-23 rRfY最小化
基于实施例1E中观测到的mIL-23 rRfY适体的RNA序列组成，用RNA折叠程序(RNAstructure)预测RNA的结构，设计7株mIL-23蛋白结合序列的最小化结构，在Integrated DNA Technologies(Coraville，IA)仪中加入最小化结构中所含的寡聚核苷并按照设计排序，然后进行PCR扩增、转录、凝胶纯化并按照前面描述的方法结合mIL-23进行定点印记杂交试验。加入含有0.1mg/mL BSA的IX PBS使反应液总体积为30μL，在室温条件下反应30分，使32P-标记的RNA与mIL-23结合。此反应在定点印记仪器(Schleicher and Schuell Minifold-1 Dot Blot，Acrylic)中进行，按照前面描述的方法得出连接曲线，表32列出了能与mIL-23结合结构的最小序列，表33概括了能够与mIL-23显著性结合的rRfY最小化序列的蛋白结合特点。除非另外指出，下面列出的序列是按照从5’端到3’端的方向书写的，表示了在rRfY SELEXTM条件下筛选的能够与小鼠IL-23结合的序列，其中嘌呤(A和G)为2’-OH和嘧啶(U和C)为2’-F。表32所表示的核酸序列可以是这些核酸的PAG衍生物，其3’末端可以含有或者不含有加帽(如3’-反向dT)
表32最小化小鼠rRfY克隆序列SEQ ID NO 199(ARC1739)GGGCACUCAGCCACAGGUGGCUUAAUACUGUAAAGACGUGCCCSEQ ID NO 200(ARC1918)GGAGCGCACUCAGCCACCGGCUUAAUAUCCAAUAGGAACGUUCGCUCUSEQ ID NO 201GGGCACUCAGCCACAGCUCGGUGGCUUAAUAUCUAUGUGAACGUGCCCSEQ ID NO 202GGGCACUCAGCCACCUUGGGCUUAAUACCUAUCGGAUGUGCCC
表33.mIL-23 rRfY克隆株的KD值
*逆转录培养30分确定KD值*缓冲溶液体系为1X PBS+0.1mg/mL BAS
实施例2B药物化学优化
适体的药物化学优化是一种适体改进技术，在此技术中，用化学合成变异体适体。可以在这些变异体中引入一个单替代体使其与母系区别开来，并根据引入的位点不同来区分不同的子系，这些变异体彼此比较并与母系比较，引入一个单取代物对改进RNA的特性上有深远的影响，可能只需在治疗剂中加入一个单取代物就能够使治疗达到一种精确的标准。可供选择地，收集一套单变异体的信息可用于进一步变异体，在这些变异体中可同时引入一个以上的取代。在一种设计方法中，将所有的单取代变异体分类，选择其中首要的4种及其所有可能的二倍体(6)、三倍体(4)和四倍体(1)，这4个单取代变异体的任何组合形式都被合成及进行分析试验。另一种分析方法是将最好的单取代变异体看作是新的母系并且对含有该最高级单取代变异体的所有可能双取代变异体进行合成及分析试验。也可以使用很多其他的方法，可以重复进行取代方法逐步生成多个取代，然后继续鉴定进一步改善的变异体。适体的药物化学优化是研究局部取代，而不是整体取代的最有价值的方法。由于文库内发现的适体是由DNA库转录得到的，在SELEXTM过程中引入的任何取代都是整体性的。例如，如果想在核酸中引入硫代连接的话，可以通过在每个A(或G，C，T，U等等)上引入硫代物即可实现。但是如果想在只在某个A(或G，C，T，U等等)上引入硫代物，这种方法就失效了。适体药物化学优化所使用的取代物不能用固相合成试剂合成并引入低聚物合成序列中。适体药物化学优化过程可以引入原子位空间、疏水基、亲水基、亲脂性、疏脂性、正电荷、负电荷、中性电荷、两性离子，极化性、核酸酶限制性、刚性结构、流型结构、蛋白结合能力及生物量等等多方面取代，而不仅仅限于核苷酸。适体的药物化学修饰包括碱基修饰、糖基修饰或硫化修饰作用。应该从治疗剂适体出发来考虑使用的取代物种类，可以将引入的取代作用分为一个或多个下面分类(1)片段体系中已有的取代，例如2’-脱氧、2’-核糖核酸、2’-O-CH3-嘌呤或嘧啶或5’-甲基胞嘧啶。
(2)取代物是已使用的治疗剂的一部分，例如硫代磷酸连接的寡核苷酸。
(3)取代物能够水解或降解为上述两种类型之一，例如甲基磷酸连接的寡核苷酸。
实施例2B.1用硫代磷酸化取代物优化ARC979序列
ARC979(SEQ ID NO177)是dRmY组合物的IL-23适体，该适体含有34个核苷酸。设计合成ARC979的21个硫代磷酸化衍生物，其中单一硫代取代发生在每个磷酸盐连接处(ARC1 149到ARC1 169)(SEQ ID NO203到SEQ ID NO223)(见表27)。将这些分子进行凝胶纯化并用定点印记试验测定与IL-23的结合能力，比较这些分子之间结合能力的强弱并与其母系ARC979相比较，在结合能力试验中进行8点蛋白滴定(0nM到300nM，连续稀释3倍)，表28总结了计算所得的KD值。与ARC979相比时，在ARC979内引入硫代磷酸化有较好的耐受力。能够很大比例的与IL-23结合并有较好的KD值(见图15)，在竞争性结合试验中结合能力也有类似提高(见图16)，这也进一步证明ARC979的硫代磷酸化衍生物与ARC979相比对IL-23具有更好的结合能力。除非另外指出，下面列出的序列是按照从5’端到3’端的方向书写的，表27所表示的核酸序列可以是这些核酸的PAG衍生物，其3’末端可以含有或者不含有加帽(如3’-反向dT)。表27ARC979的硫代磷酸化衍生物单硫代磷酸化取代 表28ARC979的硫代磷酸化衍生物的KD值
实施例2B.22’-OMe、硫代磷酸化和肌酐取代优化
对ARC979(SEQ ID NO177)进行系统修饰以增加其整体稳定性及对血浆核酸酶的抵抗力。通过含有适体合成、纯化及结合能力试验过程的四个阶段的系统合成过程，判断出ARC979最稳定、最有效的变异体。过程的第一个阶段是ARC1386(SEQ ID NO 224)(ARC979含有3’-反向dT的子系)的合成及结合能力试验，一旦ARC1386(SEQ ID NO 224)表现出与其母系ARC979(SEQ ID NO177)具有相似的结合能力，采用稳定化3’-反向dT合成随后所有的ARC979衍生物。用定点杂交印记试验来确定大部分合成适体的有效性，为了确定KD值，将化学合成的序列用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，用γ-32PATP标记5’末端，与h-IL-23蛋白进行直接结合试验，在定点杂交印记试验中使用8点蛋白滴定(可以是{100nM，30nM，10nM，3nM，1nM，300pM，100pM，0pM}也可以是{10nM，3nM，1nM，300pM，100pM，30pM，10pM，0pM})的方法，在含有Mg2+和Ca2+和0.1mg/mL BSA的Dulbecco′s磷酸缓冲液反应。KD值通过下面公式计算KD值y＝(max/(1+K/protein))+yint KaleidaGraph(KaleidaGraph v.3.51，SynergySoftware)。表29和30列出了ARC979序列衍生物的合成、纯化、蛋白结合能力及结合特点。从表30中可以看出，如实施例2A.3所述，ARC1386(SEQ ID NO 224)(ARC979含有3’-dT的子系)在此条件下的KD值为1nM。在优化反应的第一阶段，包括了ARC1427-ARC1471(SEQ IDNO225-269)，ARC1386(SEQ ID NO 224)的所有嘌呤都被相应的2’-O-CH3-嘌呤取代，另外，在该第一阶段中，在证明前面的取代对核酸酶具有稳定性的基础上，进行了一系列硫代磷酸化的单个或组合的取代实验，其基础是先前的结果，该结果建议这种取代提供了核酸酶的稳定性，还提高了ARC979衍生物的蛋白结合能力。最后，在第一阶段的末尾，对一系列的适体进行了试验，证明ARC979/ARC1386的功能性关系中茎1的作用。从表30中所见的结合数据来讲，片段中可以发生很多2’-O-CH3对脱氧碱基的取代。加入一些特定的硫代磷酸化物没有能够显著提高适体对蛋白的亲和能力，有趣的是，从ARC1465-1471(SEQ ID NO263-269)的比较中看出，茎1对保持蛋白结合能力起到了十分重要的作用，但在适体核心及构成茎1的2个链中引入PEG分子之后，并不显著地影响适体的结合能力，这说明其作用是结构闭锁的。以结构活性关系(SAR)及经过优化步骤1所得产物为基础，设计、合成、纯化第二系列的适体，并测定其与IL-23蛋白的结合能力。在优化过程的第二阶段中，包括了ARC1539-ARC1545(SEQ IDNO270-276)，利用第一阶段的数据，且仅加入2’-O-CH3取代物生产更高度修饰的杂化分子。对于这些及所有随后的分子，目的是要鉴定出那些保持亲和力(KD值)能够达到2nM或更高的且结合范围对100nM IL-23(或在第三阶段及第四阶段中为10nM)为至少50％的分子。仅以结合能力来讲，所得序列中最好的是ARC1544(SEQ ID NO 275)。在优化过程的第3阶段中，包括了ARC1591-ARC1626(SEQID NO277-312)，ARC979(SEQ ID NO177)的G结构的稳定性通过与IL-23结合试验证明，在试验过程中，序列的dG被dI所取代。因为脱氧次黄嘌呤结构中缺少脱氧鸟苷的外环胺结构，所以在结构中每个dG到dI的变化都使G折叠中少了一个N7氢键结合的氨基。从试验数据中可以看出，只有发生显著的取代时才能减少适体对IL-23的结合能力，这一点说明此适体是很稳健的。另外，对在ARC1544(SEQ ID NO 275)中加入硫代磷酸化残基的效果(包括ARC1620到ARC1626(SEQ ID NO306-312))进行评价。从表30中可见，相对于ARC979(SEQ ID NO177)来讲，ARC1620到ARC1626(SEQ ID NO306-312)的结合能力有了明显改进。图17表示了经历过第3阶段优化后ARC979(SEQ ID NO177)衍生物(ARC1624和ARC1625)的蛋白结合能力曲线，与母系ARC979相比，加入硫代磷酸化基团所生成的衍生物在蛋白结合能力方面有着明显的改善。优化过程的第四阶段包括ARC1755-1756(SEQ IDNO313-314)，只包含了两个序列，试图在其中引入更多的2’-O-CH3-对脱氧的取代并保持起结合能力。从ARC1755-1756看出，这些试验是成功的。除非另外指出，下面列出的序列是按照从5’端到3’端的方向书写的，表29所表示的序列可以是这些核酸的PAG衍生物。表29ARC979优化过程1-4阶段的序列信息 表30结合特点
*30分钟RT培养来确定KD*1X Dulbecoo的磷酸缓冲液(和Ca++、Mg++)+0.1mg/mL BSA反应液。
实施例2C抗-IL-23序列的血浆稳定性
在人类血浆中测定通过最优化过程确定的适体的子集的核酸酶稳定性，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定血浆核酸酶的降解性。简单的说，为了测定血浆稳定性，首先用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化化学合成的适体，用γ-32P ATP标记其5’末端之后，在用凝胶纯化，将标记后的适体与100nM未标记的适体一起在200ml人类血浆中培养，发生结合反应。用相同的成分分别测定反应起始时刻，只是将血浆改为PBS缓冲液以确保试验过程中凝胶上放射性元素的量不变。反应在37℃条件下在热循环仪中反应1，3，10，30和l00h，在每个时间点，取出20ml反应液，用200ml甲酰胺染色，在液氮中快速冷冻，于20℃条件下冷藏。在取完最后一个点后，解冻冷冻样品，从每个时间点的样品中取出20ml，向其中加入SDS至浓度为0.1％，将样品在90℃条件下培养10-15分钟，然后马上放入15％的变性PAGE凝胶中在12W条件下跑胶35分钟。用Storm 860Phosphorimager system(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)确定凝胶中放射性物质的数量，每个时间点的适体标准长度的百分比由该时间点样品的条带大小所决定。每个时间点适体标准长度的百分比与0时刻RNA片段标准长度的百分比相比确定其规格，适体标准长度受时间的作用应满足下列等式ml*eΛ(-m2*m0)，其中，ml是指适体标准长度最大百分比(ml＝100)；m2是指降解速率；因此该序列的半衰期(T1/2)等于(In2)/m2。图18表示了样品数据，表31概括了适体测试的结果。表31血浆稳定性
实施例3功能细胞试验活性rRfY″IL-23适体的细胞试验及最小化
IL-23蛋白在JAK/STAT信号传导及STAT1、3、4、5磷酸化过程中起到了重要的作用，为了测试IL-23-RNA适体是否具有细胞活性，可在外周血单个核细胞(PBMCs)溶菌液中进行信号传导试验，其中PBMCs生长在含有PHA的培养基上，更明确的说，此细胞试验可以用来证明IL-23-RNA适体是否可以抑制IL-23诱导的STAT-3硫代磷酸化。事实上，与静止细胞或适体锁定细胞相比，IL-23处理过的细胞溶液中含有更多的活性STAT3。可以使用两种方法来测定IL-23诱导的STAT-3硫代磷酸化的抑制作用一种是通过蛋白分子印记杂交的方法，该方法要用到anti-phospho-STAT3抗体(Tyr705)(Cell Signaling，Beverly，MA)；另一种是使用TransAMTMAssay(Active Motif，Carlsbad，CA)，他上含有96个孔板，在孔板上固定与STAT具有相同结合位点(5′TTCCCGGAA-3′)的寡核苷酸。anti-phospho-STAT3抗体可以识别STAT3的抗原，只有当STAT3有活性的时候此抗原才能与之接近，将抗体与HRP-共轨的二级抗体相连进行比色反应，其数值可用分光光度法测定(见图19)。概括的讲，使用Histopaque gradient(Sigma，St.Louis，MO)从血液中分离出来的外周血单个核细胞(PBMCs)可以用来引导细胞分析试验。在含有PHA、IL-2(100units/mL)(R&D Systems，Minneapolis，MN)的Peripheral Blood培养基(Sigma)上培养PBMCs，在37℃/5％CO2条件下培养3-5天，生成PHA Blasts，用IX PBS洗涤PHA Blasts两次，然后在RPMI，0.20％FBS里使血清饥饿4小时，之后，在经过适当标记的eppendorf试管中加入2百万个细胞，进行IL-23片段检测。最终浓度稳定在3ng/mL(R&D Systems，Minneapolis，MN)的hIL-23与按照实施例1所描述的方法稀释的IL-23序列结合，并将细胞因子/适体混合物加入到细胞中使其最终体积为100μl，在37℃条件下培养10-12分钟，加入1ml冰冻PBS和1.5mM Na3VO4终止培养。用TransAMTMSTAT3生产的溶解液溶解细胞。图20描述了细胞分析试验草案。用TransAMTM方法检测使用多种筛选方法产生的母系及最小化的IL-23适体，这里的筛选方法包括包含2’-F-嘧啶的RNA(rRfTY)、含有2’-O-CH3核糖核酸的RNA(rRmY)、含有2’-O-CH3-脱氧核酸的RNA和dRmY优化适体。
实施例3ArRfY筛选株母系及其最小化序列的细胞分析试验
实施例1A介绍了rRfY的全长克隆体，实施例2A介绍了其选择性最小化克隆体，用TransAMTMSTAT3测定rRfY的全长克隆体活性，表34表示了rRfY的全长克隆体的细胞分析试验数据，表35介绍了rRfY选择性最小化克隆体的活性，并与其母系进行了比较。TransAMTMSTAT3活性测定试验证明，rRfY最小化克隆体F1 Imin2(SEQ ID NO147)，A10min5(SEQ ID NO139)，A1Ominó(SEQ ID NO140)，B10min4(SEQ IDNO144)，B10min5(SEQ ID NO145)，Type1.4(SEQ ID NO151)和Type1.5(SEQ ID NO152)的活性要胜于他们各自的母系(见图21)，除了全长克隆体之外。表34细胞分析试验结果rRfY克隆体试验结果总结 表35与母系相比，IL-23 2′F-rRfY最小化适体结合能力 实施例1C描述的dRmY的母系克隆体，实施例2A.2描述的其最小化克隆体，用TransAMTMSTAT3测定dRmY母系克隆体的活性。实施例1C中介绍了3个对IL-23有最好结合能力的dRmY的全长克隆体，分别为ARC489(SEQ ID NO91)，ARC490(SEQ ID NO92)，ARC491(SEQID NO94)，测定其结合能力，并用对IL-23无结合能力的ARC492(SEQ IDNO97)作为阴性对照。试验证明ARC489(SEQ ID NO91)和ARC491(SEQID NO94)显示了相当的活性，初步数据显示其IC50′s值得范围在50nM-500nM之间。实施例2A.2描述了对IL-23具有结合能力的dRmY的最小化克隆体ARC527(SEQ ID NO159)。对其用TransAM STAT3进行活性试验，结果证明与其对应的全长序列ARC489(SEQ ID NO91)相比，ARC527的活性有所下降。
实施例3C第二个dRmY筛选株母系及其最小化克隆体的细胞分析试验
实施例1D描述的dRmY筛选的母系克隆体，实施例2A.3描述的对mIL-23表现高结合能力的来这个筛选的最小化克隆体，将二者在TransAMTM分析仪中进行功能性筛选，并在IL-23浓度保持不变(3ng/mL)的情况下进行8点IL-23蛋白滴定(0-3μM，3倍稀释)，根据剂量反应曲线计算全长克隆体的IC50值，图22是实施例1D筛选所得dRmY筛选株的剂量反应曲线的实施例，该曲线表示了TransAMTM试验中的有效细胞活性(ARC611(SEQ ID NO103)，ARC614(SEQ ID NO105)，ARC621(SEQ ID NO108)，和ARC627(SEQ ID NO110))。在TransAMTM试验中筛选dRmY的最小化克隆体(实施例2A.3)与其相应母系相比的功能性。根据剂量反应曲线计算IC50值，图23更有效的dRmY筛选株的剂量反应曲线，ARC979(SEQ ID NO177)，ARC980(SEQ ID NO178)，ARC982(SEQ ID NO180)，与其全长序列相比，ARC621(SEQ ID NO108)和ARC627(SEQ ID NO110).ARC979(SEQ IDNO177)在TransAMTM试验中一直有良好的活性，三者平均IC50值为40nM+/-10nM，此外，ARC792(SEQ ID NO162)，ARC794(SEQ ID NO164)，ARC795(SEQ ID NO165)在试验过程中也保持了有效活性。
实施例3D优化ARC979衍生物的细胞分析试验结果
实施例2B.2中描述的几个优化ARC979衍生物对hIL-23蛋白具有良好的结合能力，对这些衍生物进行筛选，用前面提到的PHA Blast试验分析对IL-23诱导的STAT3活化作用的抑制能力，IL-23诱导的STAT3磷酸化作用的抑制能力用PathscanPhospho-STAT3(Tyr705)SandwichELISA试剂盒(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)来测定。与前面提到的TransAMTM试验方法相似，PathscanPhospho-STAT3(Tyr705)Sandwich ELISA试剂盒能够通过涂布在96孔板上的STAT3小兔单克隆抗体检测磷酸化-STAT3(Tyr705)蛋白的内生长水平，在细胞液中培养之后，磷酸化的STAT3蛋白和未磷酸化的STAT3蛋白都被涂布的抗体捕获，加入一种磷酸化的STAT3小鼠单克隆抗体来检测捕获的磷酸化STAT3蛋白，然后用HRP-连接的抗小鼠抗体识别检测抗体。使用HRP培养基及TMB显色，颜色光学密度的大小与磷酸化STAT3蛋白的数量成正比。用上述方法对PHA Blasts进行分离、精制，然后用最终浓度为6ng/mL的hIL-23(R&D Systems，Minneapolis，MN)处理使STAT3活化，而不是使用3ng/mL按照上述方法进行TransAMTM试验，并在IL-23浓度保持不变(3ng/mL)的情况下对2C描述的几个筛选株进行6点IL-23蛋白滴定(0-700nM，3倍稀释)，用最终浓度为6ng/mL的h-IL-23(R&DSystems，Minneapolis，MN)处理使STAT3活化，而不是使用3ng/mL按照上述方法进行TransAMTM试验，用Pathscan试剂盒提供的缓冲液处理细胞得到溶液，然后按照说明书指示进行试验，根据剂量反应曲线计算全长克隆体的IC50值。在TransAMTM试验中测定IC50值为40+/-10nM的ARC979序列，经过Pathscan方法测定IC50为6+/-1nM，如前所述，ARC979的IC50值与KD值(1nM)相一致，在实施例2B.2描述的直接结合试验中再一次证实了这一结论。如表36所示，使用Pathscan方法测定的ARC979优化序列的有效性要明显优于ARC979，尤其是ARC1624和ARC1625，其IC50值分别为2nM和4nM。图24表示了经过Pathscan实验证明的，对IL-23表现很好的结合能力及有效细胞活性的优化适体的剂量反应曲线。
表36总结了优化序列反应曲线的IC50值表36PathscanAssay优化ARC979衍生物的IC50值
实施例3E小鼠IL-23筛选株母系及其最小化克隆体的细胞分析试验
按照上面所述进行TransAMTM试验及PHA Blast分析试验，结果证明小鼠IL-23蛋白能够活化人类PHA Blast中STAT3(见图25)，因此，实施例1E中描述的小鼠IL-23筛选株母系及其最小化克隆体(见实施例2A.4)对mIL-23有很好的结合能力，能阻碍人PHA blast细胞中m-IL-23诱导的STAT3活化。用TransAMTM试验检测母系与最小化克隆体的功能，试验方法如前所述，只是用于诱导人PHA blast中STAT3活化的m-IL-23浓度变为30ng/mL，与使用hIL-23时的浓度(3ng/mL)不同。表37列出了母系的试验结果，表38列出了最小化克隆体的试验结果。表37TransAMTM试验中mIL-23-rRfY克隆体母系的活性
*多次实验平均值。表38TransAMTM试验中mIL-23-rRfY最小化克隆体的活性
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序列表<110>阿切埃米克斯有限公司<120>人类IL-12细胞因子家族的适体和其在自体免疫疾病治疗中的应用<130>23239-578-061<140>PCT/US2005/007666<141>2005-03-07<150>60/550,962<151>2004-03-05<150>60/608,046<151>2004-09-07<160>317<170>Patentln version 3.3<210>1<211>93<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>其它特征<222>(24)..(53)<223>n是a，t，c，或g<400>3catcgatcga tcgatcgaca gcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac60gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92<210>4<211>328<212>PRT<213>人类
<400>4Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu1 5 10 15Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val20 25 30Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu35 40 45Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln50 55 60Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys65 70 75 80Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val85 90 95Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp100 105 110Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe115 120 125Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp130 135 140Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg145 150 155 160Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu180 185 190Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile195 200 205Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr210 215 220Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn225 230 235 240Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp245 250 255Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr260 265 270Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg275 280 285Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala290 295 300Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser305 310 315 320Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser325<210>5<211>189<212>PRT<213>人类
<400>5Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr1 5 10 15Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln20 25 30Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His35 40 45Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr50 55 60Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln65 70 75 80Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly85 90 95Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu100 105 110Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu115 120 125Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr130 135 140Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu145 150 155 160Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala165 170 175
Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro180 185<210>6<211>253<212>PRT<213>人类<400>6Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala1 5 10 15Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg20 25 30Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val35 40 45Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro50 55 60Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg65 70 75 80Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr85 90 95Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys100 105 110Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu115 120 125Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys130 135 140
Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser145 150 155 160Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn165 170 175Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn180 185 190Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser195 200 205Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys210 215 220Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala225 230 235 240Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser245 250<210>7<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成CpG<400>7aacgttcgag 10<210>8<211>88<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>合成模板<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(25)..(64)<223>n是a，u，c，或g<400>8gggaaaagcg aaucauacac aagannnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn60nnnngcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>9<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>9taatacgact cactataggg aaaagcgaat catacacaag a41<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>10ttctcggttg gtctctggcg gagc 24
<210>11<211>24<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成核酸序列<400>11gggaaaagcg aaucauacac aaga 24<210>12<211>24<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成核酸序列<400>12gcuccgccag agaccaaccg agaa 24<210>13<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>13gggaaaagcg aaucauacac aagagaggua ugugguuuug cggagcaacu cgugucagcg60gucagcuccg ccagagacca accgagaa 88
<210>14<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>14gggaaaagcg aaucauacac aagaaugaau uccguccacg ggcgcccgau gaugucaguu 60uucggcuccg ccagagacca accgagaa88<210>15<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>15gggaaaagcg aaucauacac aagauuagug cguguguuga aagggcucau aaugucagua60ucgagcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>16<211>88
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>16gggaaaagcg aaucauacac aagauuaggc gucgugacaa uaacuggucc acgagcaugu60cagugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>17<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>17gggaaaagcg aaucauacac aagauggaag gcgaucguag caguaaccca augauuggga60ccuagcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>18<211>88<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>18gggaaaagcg aaucauacac aagaucucuu uggccgacgc aacaaugcuc uuuuccgacc60uugcgcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>19<211>89<212>RNA<213>artificial sqeuence<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(89)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(50)..(50)<223>n是a，u，c，或g<220>
<221>其它特征<222>(57)..(57)<223>n是a，u，c，或g<220>
<221>其它特征<222>(63)..(63)<223>n是a，u，c，或g
<400>19gggaaaagcg aauccuaccc aagauguugu uggcguugau cguaugauun auggagngug60ucngugcucc gccagagacc aaccgagaa 89<210>20<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>20gggaaaagcg aaucauacac aagaugcgcu auguuuggcu gggaauugua gcauugcuca60aguggcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>21<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<220>
<221>其它特征
<222>(54)..(54)<223>n是a，u，c，或g<400>21gggaaaagcg aaucauacac aagauguuga accucuugug cgucccgaug uuungcaaug 60uggagcuccg ccagagacca accgagaa88<210>22<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>22gggaaaagcg aaucauacac aagaauguau acaaugcccu aucgucaguu aggcaugugu60ggaugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>23<211>89<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(89)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶
<400>23gggaaaagcg aaucauacac aagacagagg caaugagagc cuggcgaugu cagucgcauc60uugcugcucc gccagagacc aaccgagaa 89<210>24<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>24gggaaaagcg aaucauacac aagaucgcaa aaggaguuug ucucugcucu cggagugugu60cagugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>25<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>25gggaaaagcg aaucauacac aagagaugac uacacgccag ugugcgcuuu uugcggaguu60agcggcuccg ccagagacca accgagaa 88
<210>26<211>89<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(89)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>26gggaaaagcg aaucauacac aagagucgug augauuuggg uuaugucagu ucccuguaug60guuucgcucc gccagagacc aaccgagaa 89<210>27<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>27gggaaaagcg aaucauacac aagaguuuua uguggguccc gaugauuaac uuuauuggcg60cauugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>28<211>90<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(90)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>28gggaaaagcg aaucauacac aagagaacga guauauuugc gcuggcggag aagucucucg60aagggagcuc cgccagagac caaccgagaa 90<210>29<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>29gggaaaagcg aaucauacac aagaguauca uucggcuggu gggagaaauc ucuguagaua60uagagcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>30<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>30gggaaaagcg aaucauacac aagauagcgu cuaugauggc ggagaagcaa guguagcaua60acaggcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>31<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>31gggaaaagcg aaucauacac aagaguguug aaugagcgcu gguggacaga ucuuugguua60cagagcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>32<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>32gggaaaagcg aaucauacac aagacucaug gauauggccu agcagccgug gaagcgguca60uucugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>33<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>33gggaaaagcg aaucauacac aagaucccag cgguacguga gucuguuaaa ggccaccuaa60ugucgcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>34<211>87<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(87)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶
<400>34gggaaaagcg aaucauacac aagaguaaug ugggucccga ugauucgcug ugcggcguuu60guagcuccgc cagagaccaa ccgagaa87<210>35<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(44)..(44)<223>n at position 44 isa，u，c，or g<400>35gggaaaagcg aaucauacac aagagguuga guacgacgga gucnuggcua acacggaaac60uagagcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>36<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶
<400>36gggaaaagcg aaucauacac aagagucaug gcuuacaauu gaaacaagag cucgcgugac60acaugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>37<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>37gggaaaagcg aaucauacac aagaacggcu aggcaucaau ggccagcaaa aauagucgug60uaaugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>38<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>38gggaaaagcg aaucauacac aagaccaucg gacgaggcgg gucaccuuuu acgcuuucga60gcuggcuccg ccagagacca accgagaa 88
<210>39<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>39gggaaaagcg aaucauacac aagaugguuc ccacgugaaa guggcuagcg aguaccccac60uuaugcu ccg ccagagacca accaaggg 88<210>40<211>90<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(90)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(61)..(61)<223>n在61位是a，u，c，或g<400>40gggaaaagcg aaucauacac aagagcgcuu uagcggguau agcacuuuuc aucuaaugaa60nccguagcuc cgccagagac caaccgagaa 90
<210>41<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>41gggaaaagcg aaucauacac aagaucuacg auuguucagg uuuuuuguac ucaacuaaag60gcgagcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>42<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>42gggaaaagcg aaucauacac aagauugucu cggauugguc acucccauuu uuguucgcuu60aacggcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>43<211>89
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(89)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>43gggaaaagcg aaucauacac aagaaguuuu uugugcucug aguacucagc guccguaagg60gauaugcucc gccagagacc aaccgagaa 89<210>44<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>44gggaaaagcg aaucauacac aagaagugcu ucaugcggca aacugcauga cgucgaauag60auaugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>45<211>88<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>45gggaaaagcg aaucauacac aagagaggua ugugguuuug cggagcaacu cgugucagcg60gucagcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>46<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>46gggaaaagcg aaucauacac aagaugugcu ugaguuaaau cucaucgucc ccguuugggg60auaugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>47<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>47gggaaaagcg aaucauacac aagaaguuuu ugugcucuga guacucagcg uccguaaggg60auaugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>48<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>48gggaaaagcg aaucauacac aagagaugua uucaggcggu ccgcauugau gucaguuaug60cguagcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>49<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>49gggaaaagcg aaucauacac aagaaugguc ggaaucucug gcgccacgcu gaguauagac60ggaagcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>50<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>50gggaaaagcg aaucauacac aagagugcuu cguauguuga auacgacguu cgcaggacga60auaugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>51<211>87<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(87)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(75)..(75)<223>n at position 75 is a，u，c，or g<400>51agggaaaagg aaucauacac aagauguauc auccggucgu acaaaagcgc cacggaacca 60uucgcuccgc caganaccaa ccgagaa 87<210>52<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>52gggaaaagcg aaucauacac aagacgcguc agguccacgc ugaaauuuau uuucggcagu60guaagcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>53<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶
<400>53gggaaaagcg aaucauacac aagauaugug ccugggaugg acgacauccc cugucuaagg60auaugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>54<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>54gggaaaagcg aaucauacac aagauuacuc cguuaguguc aguugacgga gggagcguac60uauugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>55<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>55gggaaaagcg aaucauacac aagacauugu gcuuuaucac gugggugaua acgacgaaag60uuaugcuccg ccagagacca accgagaa 88
<210>56<211>89<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(89)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>56gggaaaagcg aaucauacac aagacagugu augaggaaga uuacuuccau uccugagcgg60uuuucgc ucc gccagagacc aaccgagaa 89<210>57<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>57gggaaaagcg aaucauacac aagauuggca augugaccuu caacccuuuu cccgaugaac60aguggcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>58<211>88
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>58gggaaaagcg aaucauacac aagacaugac ugcaugcuuc gggaguaucu cggucccgac60guucgcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>59<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>59gggaaaagcg aaucauacac aagacuuauc gccucaaggg ggguaauaaa cccagcgugu60gcaugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>60<211>89<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(89)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>60gggaaaagcg aaucauacac aagaauccug gcuucgcaua guguaugggu aguacgacag60cgcgugcucc gccagagacc aaccgagaa 89<210>61<211>89<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(89)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>61gggaaaagcg aaucauacac aagaacgcau agucggauuu accgaucauu cugugccuuc60gugacgcucc gccagagacc aaccgagaa 89<210>62<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>62gggaaaagcg aaucauacac aagaauugug cuuacaacuu ucguuguacc gacgugucag 60uuaugcuccg ccagagacca accgagaa88<210>63<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>63gggaaaagcg aaucauacac aagaguguau uacccccaac ccagggggac cauucgcgua 60acaagcuccg ccagagacca accgagaa88<210>64<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>64gggaaaagcg aaucauacac aagacuuaac agugcggggc gcaguguaua gauccgcaau 60gugugcuccg ccagagacca accgagaa88<210>65<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>65gggaaaagcg aaucauacac aagacgauag uaugaccuuu ugaaaggcuu cccgagcggu60guucgcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>66<211>88<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶
<400>66gggaaaagcg aaucauacac aagacgugug cuuuauguaa accauaacgu uccauaagga60auaugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>67<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>67taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctac 39<210>68<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>68catcgatcga tcgatcgaca gc 22<210>69<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成核酸序列<400>69gggagaggag agaacguucu ac 22<210>70<211>22
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成核酸序列<400>70gcugucgauc gaucgaucga ug 22<210>71<211>74<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>71gggagaggag agaacguucu acaaaugaga gcaggccgaa gaggagucgc ucgcugucga60ucgaucgauc gaug 74<210>72<211>74<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<400>72gggagaggag agaacguucu acaaaugaga gcaggccgaa aaggagucgc ucgcugucga60ucgaucgauc gaug 74<210>73<211>74<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>73gggagaggag agaacguucu acaaaugaga gcaggccgaa aaggagucgc ucgcugucga60ucgaucgauc gaug 74<210>74<211>75<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>74gggagaggag agaacguucu acgguaaagc aggcugacug aaagguugaa gucgcugucg60aucgaucgau cgaug 75
<210>75<211>74<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>75gggagaggag agaacguucu acagguuaag agcaggcuca ggaauggaag ucgcugucga60ucgaucgauc gaug 74<210>76<211>75<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>76gggagaggag agaacguucu acaacaaagc aggcucauag uaauauggaa gucgcugucg60aucgaucgau cgaug 75<210>77<211>75<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>77gggagaggag agaacguucu acaacaaagc aggcucauag uaauauggaa gucgcugucg60aucgaucgau cgaug 75<210>78<211>74<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>78gggagaggag agaacguucu acaaaagaga gcaggccgaa aaggagucgc ucgcugucga60ucgaucgauc gaug 74<210>79<211>75<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>79gggagaggag agaacguucu acaaaaggca ggcucagggg aucacuggaa gucgcugucg60aucgaucgau cgaug 75<210>80<211>76<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>80gggagaggag agaacguucu acaagauaua auuaaggaua agugcaaagg agacgcuguc 60gaucgaucga ucgaug 76<210>81<211>74<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<400>81gggagaggag agaacguucu acgaaugaga gcaggccgaa aaggagucgc ucgcugucga60ucgaucgauc gaug 74<210>82<211>75<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>82gggagaggag agaacguucu acgagaggca agagagaguc gcauaaaaaa gacgcugucg60aucgaucgau cgaug 75<210>83<211>75<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>83gggagaggag agaacguucu acgcaggcug ucguagacaa acgaugaagu cgcgcugucg60aucgaucgau cgaug 75
<210>84<211>76<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>84gggagaggag agaacguucu acggaaaaag auaugaaaga aaggauuaag agacgcuguc60gaucgaucga ucgaug76<210>85<211>75<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(29)..(29)<223>n是a，u，c，或g<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>n是a，u，c，或g
<220>
<221>其它特征<222>(64)..(64)<223>n是a，u，c，或g<220>
<221>其它特征<222>(68)..(68)<223>n是a，u，c，或g<220>
<221>其它特征<222>(72)..(72)<223>n是a，u，c，或g<400>85gggagaggag agaacguucu acggaaggna acaanagcac uguuugugca ggcgcugucg60aucnaucnau cnaug 75<210>86<211>73<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(73)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>86gggagaggag agaacguucu acuaaugcag gcucaguuac uacuggaagu cgcugucgau60cgaucgaucg aug 73<210>87<211>75<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>87aggagaggag agaacguucu acuagaagca ggcucgaaua caauucggaa gucgcugucg60aucgaucgau cgaug 75<210>88<211>75<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>88gggagaggag agaacguucu acauaagcag gcuccgauag uauucgggaa gucgcugucg60aucgaucgau cgaug 75<210>89<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>89catcgatcga tcgatcgaca gc 22
<210>90<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成核酸序列<400>90gcugucgauc gaucgaucga ug 22<210>91<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>91gggagaggag agaacguucu acagcgccgg ugggcgggca uuggguggau gcgcugucga60ucgaucgauc gaug 74<210>92<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>92gggagaggag agaacguucu acagccuuuu ggguaagggg aggggugccg gucgcugucg60aucgaucgau cgaug 75<210>93<211>75<212>DNA<213>artificials sequence<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>93gggagaggag agaacguucu acguaacggg gugggagggg cgaacaacuu gacgcugucg60aucgaucgau cgaug 75<210>94<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>94gggagaggag agaacguucu acagcgccgg ugggugggca uaggguggau gcgcugucga60ucgaucgauc gaug 74
<210>95<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>95gggagaggag agaacguucu acgggcuacg gggauggagg guggguccca gacgcugucg60aucgaucgau cgaug 75<210>96<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>96gggagaggag agaacguucu acacggggug ggaggggcga gucgcaugga ugcgcugucg60aucgaucgau cgaug 75<210>97<211>75
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>97gggagaggag agaacguucu acucaaugac cgcgcgaggc ucugggagag ggcgcugucg60aucgaucgau cgaug 75<210>98<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成模板<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(23)..(52)<223>n是a，u，c，或g<400>98gggagaggag agaacguucu acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnggucgauc60gaucgaucau cgaug 75
<210>99<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>99taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctac 39<210>100<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>100catcgatgat cgatcgatcg ac 22<210>101<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成核酸序列<400>101gggagaggag agaacguucu ac 22<210>102<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成核酸序列
<400>102gucgaucgau cgaucaucga ug 22<210>103<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>103gggagaggag agaacguucu acaggcaagg caauugggga gugugggugg ggggucgauc60gaucgaucau cgaug 75<210>104<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>104gggagaggag agaacguucu acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg ggggucgauc60gaucgaucau cgaug 75
<210>105<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>105gggagaggag agaacguucu acaaggcggu acggggagug.uggguugggg ccggucgauc60gaucgaucau cgaug 75<210>106<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>106gggagaggag agaacguucu acgauauagg cgguacgggg ggagugggcu ggggucgauc60gaucgaucau cgaug 75<210>107<211>75
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>107gggagaggag agaacguucu acaggaaagg cgcuugcggg gggugaggga ggggucgauc60gaucgaucau cgaug 75<210>108<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>108gggagaggag agaacguucu acaggcgguu acgggggaug cgggugggac aggucgaucg60aucgaucauc gaug 74<210>109<211>74<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>109gggagaggag agaacguucu acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gggucgaucg60aucgaucauc gaug 74<210>110<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>110gggagaggag agaacguucu acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugucgaucg60aucgaucauc gaug 74<210>111<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>111gggagaggag agaacguucu acaggcaagg caauugggga gcgugggugg gggggucgau60cgaucgauca ucgaug76<210>112<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>112gggagaggag agaacguucu acaauugcag guggugccgg ggguuggggg cgggucgauc60gaucgaucau cgaug 75<210>113<211>73<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(73)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>113gggagaggag agaacguucu acaggcucaa aagaggggga ugugggaggg ggucgaucga60ucgaucaucg aug 73<210>114<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>114gggagaggag agaacguucu acaggcgcag ccagcgggga gugagggugg gggucgaucg60aucgaucauc gaug 74<210>115<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<400>115gggagaggag agaacguucu acaggccgau gagggggagc aguggguggg gggucgaucg60aucgaucauc gaug 74<210>116<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>116gggagaggag agaacguucu acuagugagg cgguaacggg gggugagggu ggggucgauc60gaucgaucau cgaug 75<210>117<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>117gggagaggag agaacguucu acagguaggc aagauauugg gggaagcggg uggggucgau60cgaucgauca ucgaug76
<210>118<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>118gggagaggag agaacguucu acacauggcu cgaaagaggg gcgugagggu ggggucgauc60gaucgaucau cgaug 75<210>119<211>76<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成模板<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有嘌呤(A和G)为2′-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(18)..(57)<223>n是a，u，c，或g<400>119ggagcgcacu cagccacnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnuuu60cgaccucucu gcuagc76
<210>120<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>120taatacgact cactatagga gcgcactcag ccac34<210>121<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>121gctagcagag aggtcgaaa 19<210>122<211>17<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成核酸序列<400>122ggagcgcacu cagccac 17<210>123<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成核酸序列
<400>123uuucgaccuc ucugcuagc 19<210>124<211>75<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>124ggagcgcacu cagccacagg uggcuuaaua cuguaaagac gugcgcgcag agggauuuuc 60gaccucucug cuagc 75<210>125<211>76<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-0H，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>125ggagcgcacu cagccaccgu aauucacaag gucccugagu gcaggguugu auguuuguuu 60cgaccucucu gcuagc 76
<210>126<211>76<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>126ggagcgcacu cagccacucu acucgauaua guuuaucgag ccggugguag auuaugauuu 60cgaccucucu gcuagc 76<210>127<211>75<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>127ggagcgcacu cagccacgcc uacaauucac ugugauauau cgaauuauag cccugguuuc 60gaccucucug cuagc 75<210>128<211>76
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>128ggagcgcacu cagccaccgg cuuaauaucc aauaggaacg uucgcucuga gcaggcguuu 60cgaccucucu gcuagc 76<210>129<211>76<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400> 129ggagcgcacu cagccacagc ucgguggcuu aauaucuaug ugaacgugcg caacagcuuu 60cgaccucucu gcuagc 76<210>130<211>76<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>130ggagcgcacu cagccaccuu gggcuuaaua ccuaucggau gugcgccuag cacggaauuu 60cgaccucucu gcuagc 76<210>131<211>76<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(46)..(46)<223>n是a，u，c，或g<400>131ggagcgcacu cagccacggu uuacuuccgu ggcaauauug accucncucu agacagguuu 60cgaccucucu gcuagc 76<210>132<211>76
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>132ggagcgcacu cagccaccug ggaaaaucug ggucccugag uucuaacagc agagauuuuu 60cgaccucucu gcuagc 76<210>133<211>76<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(12)..(12)<223>n is a，u，c or g<220>
<221>其它特征<222>(62)..(62)<223>n是a，u，c或g
<400>133ggagcgcacu cngccacuuc ggaauaucgu ugucuucugg gugagcaugc guugagguuu 60cnaccucucu gcuagc 76<210>134<211>76<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(61)..(61)<223>n是a，u，c，或g<400>134ggagcgcacu cagccacugg ggaacaucuc augucucuga ccgcucuugc aguagaauuu 60ngaccucucu gcuagc 76<210>135<211>60<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(60)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶
<400>135ggagaucaua cacaagaagu uuuuugugcu cugaguacuc agcguccgua agggaucucc 60<210>136<211>48<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(48)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>136ggagucugag uacucagcgu ccguaaggga uaugcuccgc cagacucc 48<210>137<211>39<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(39)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>137ggaguuacuc agcguccgua agggauaugc uccgacucc39<210>138<211>50
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(50)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>138ggagucugag uacucagcgu cccgagaggg gauaugcucc gccagacucc50<210>139<211>61<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(61)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>139ggagcauaca caagaaguuu uuugugcucu gaguacucag cguccguaag ggauaugcuc 60c 61<210>140<211>51<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(51)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>140ggaguacgcc gaaaggcgcu cugaguacuc agcguccgua agggauacuc c 51<210>141<211>65<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(65)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>141ggagcgaauc auacacaaga agugcuucau gcggcaaacu gcaugacguc gaauagauau 60gcucc 65<210>142<211>55<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(55)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶
<400>142ggaucauaca caagaagugc uucaugcggc aaacugcaug acgucgaaua gaucc 55<210>143<211>47<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(47)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>143ggaucauaca caagaagugc uucacgaaag ugacgucgaa uagaucc 47<210>144<211>60<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(60)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>144ggagcauaca caagaagugc uucaugcggc aaacugcaug acgucgaaua gauaugcucc 60<210>145<211>46
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(46)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>145ggaguacaca agaagugcuu ccgaaaggac gucgaauaga uacucc46<210>146<211>30<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(30)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>146gguuaaaucu caucgucccc guuuggggau 30<210>147<211>57<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(57)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>147ggacauacac aagaugugcu ugaguuaaau cucaucgucc ccguuugggg auauguc57<210>148<211>47<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(47)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>148ggcauacacg agagugcugu cgaaagacuc ggccgagagg cuaugcc 47<210>149<211>47<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(47)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶
<400>149ggcauacgcg agagcgcugg cgaaagccuc ggccgagagg cuaugcc 47<210>150<211>43<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(43)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>150ggauacccga gagggcuggc gaaagccucg gcgagagcua ucc 43<210>151<211>47<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(47)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>151ggguacgccg aaaggcgcuu ccgaaaggac guccguaagg gauaccc 47<210>152<211>49
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(49)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>152ggaguacgcc gaaaggcgcu uccgaaagga cguccguaag ggauacucc 49<210>153<211>42<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(42)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>153ggaaucauac cgagagguau uaccccgaaa ggggaccauu cc42<210>154<211>48<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(48)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>154ggaaucauac acaagagugu auuaccccca acccaggggg accauucc 48<210>155<211>57<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(57)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>155ggaagaaugg ucggaaucuc uggcgccacg cugaguauag acggaagcuc cgccaga57<210>156<211>39<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(39)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶
<400>156ggaggcgcca cgcugaguau agacggaagc uccgccucc39<210>157<211>58<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(58)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>157ggacacaaga gauguauuca ggcgguccgc auugauguca guuaugcgua gcuccgcc 58<210>158<211>38<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>158ggcgguccgc auugauguca guuaugcgua gcuccgcc 38<210>159<211>37
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>159acagcgccgg ugggcgggca uuggguggau gcgcugu 37<210>160<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(32)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>160gcgccggugg gcgggcaccg gguggaugcg cc 32<210>161<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>161acagcgccgg uguuuucauu ggguggaugc gcugu35<210>162<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>162ggcaaguaau uggggagugc gggcgggg28<210>163<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(25)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<400>163cuacaaggcg guacggggag ugugg 25<210>164<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(30)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>164ggcgguacgg ggaguguggg uuggggccgg 30<210>165<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(36)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>165cgauauaggc gguacggggg gagugggcug gggucg 36<210>166<211>31
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(31)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>166uaauugggga gugcgggcgg ggggucgauc g31<210>167<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(27)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>167gguggggagu gcgggcgggg ggucgcc 27<210>168<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>168acaggcaagg uaauugggga gugcgggcgg ggugu35<210>169<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>169ccaggcaagg uaauugggga gugcgggcgg ggugg35<210>170<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(29)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<400>170ggcaagguaa uugggaagug ugggcgggg 29<210>171<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(29)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>171ggcaagguaa uuggguagug agggcgggg 29<210>172<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(29)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>172ggcaagguaa uuggggagug cgggcuggg 29<210>173<211>29
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(29)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>173ggcaagguaa uugggaagug ugggcuggg 29<210>174<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(29)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>174ggcaagguaa uuggguagug agggcuggg 29<210>175<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>175acaggcaagg uaauugggua gugagggcug ggugu35<210>176<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(40)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(41)..(41)<223>t在41位是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>176gauguuggca aguaauuggg gagugcgggc gggguucauc t 41<210>177<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>177acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugu 34<210>178<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>178ccaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugg 34<210>179<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(25)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<400>179ggcgguuacg ggggaugcgg guggg 25<210>180<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(30)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>180ggcgguuacg ggggaugcgg gugggacagg 30<210>181<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(26)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>181ggcaaguaau uggggagugc gggcgg 26<210>182<211>32
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(32)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>182acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggu gu 32<210>183<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>183ggcgguacgg ggaguguggg uuggggcc28<210>184<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>184ggcgguacgg ggaguguggg cuggggcc28<210>185<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(22)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>185gguacgggga guguggguug gg 22<210>186<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(22)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<400>186gguacgggga gugugggcug gg 22<210>187<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(27)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>187ggcgguacgg ggaguguggg uugggcc 27<210>188<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(27)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>188ggcgguacgg ggaguguggg cugggcc 27<210>189<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(21)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>189gguacgggga guguggguug g 21<210>190<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(21)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>190gguacgggga gugugggcug g 21<210>191<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>191ggcgguacgg ggggaguggg cugggguc28<210>192<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(27)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>192ggcgguacgg ggggaguggg cuggguc 27<210>193<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<400>193ggcgguacgg ggagaguggg cugggguc28<210>194<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(22)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>194gguacggggg gagugggcug gg 22<210>195<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(21)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>195gguacggggg gagugggcug g 21<210>196<211>22
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(22)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>196gguacgggga gagugggcug gg 22<210>197<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(25)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>197ggcgguacgg ggggaguggg cuggg 25<210>198<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(25)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<400>198ggcgguacgg ggaguguggg uuggg 25<210>199<211>43<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(43)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>199gggcacucag ccacaggugg cuuaauacug uaaagacgug ccc 43<210>200<211>48<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(48)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶
<400>200ggagcgcacu cagccaccgg cuuaauaucc aauaggaacg uucgcucu 48<210>201<211>48<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(48)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>201gggcacucag ccacagcucg guggcuuaau aucuauguga acgugccc 48<210>202<211>43<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(43)<223>所有嘌呤(A和G)为2’-OH，所有的嘧啶(C和U)为2’-氟-嘧啶<400>202gggcacucag ccaccuuggg cuuaauaccu aucggaugug ccc 43<210>203<211>35
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(2)..(2)<223>2位上的n是硫代磷酸连接<400>203ancaggcaag taattgggga gtgcgggcgg ggtgt35<210>204<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(3)..(3)<223>3位的n是硫代磷酸连接<400>204acnaggcaag uaauugggga gugcgggcgg ggugu35
<210>205<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(7)..(7)<223>7位的n是硫代磷酸连接<400>205acaggcnaag uaauugggga gugcgggcgg ggugu35<210>206<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(8)..(8)<223>8位的n是硫代磷酸连接
<400>206acaggcanag uaauugggga gugcgggcgg ggugu35<210>207<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(9)..(9)<223>9位的n是硫代磷酸连接<400>207acaggcaang uaauugggga gugcgggcgg ggugu35<210>208<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(10)..(10)<223>10位的n是硫代磷酸连接<400>208acaggcaagn uaauugggga gugcgggcgg ggugu35<210>209<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(11)..(11)<223>11位的n是硫代磷酸连接<400>209acaggcaagu naauugggga gugcgggcgg ggugu35<210>210<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(12)..(12)<223>12位的n是硫代磷酸间隔<400>210acaggcaagu anauugggga gugcgggcgg ggugu35<210>211<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(13)..(13)<223>13位的n是硫代磷酸连接<400>211acaggcaagu aanuugggga gugcgggcgg ggugu35<210>212<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(14)..(14)<223>14位的n是硫代磷酸间隔<400>212acaggcaagu aaunugggga gugcgggcgg ggugu35<210>213<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(15)..(15)<223>15位的n是硫代磷酸连接<400>213acaggcaagu aauungggga gugcgggcgg ggugu35<210>214<211>35<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(19)..(19)<223>19位的n是硫代磷酸连接<400>214acaggcaagu aauuggggna gugcgggcgg ggugu35<210>215<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(20)..(20)<223>20位的n是硫代磷酸连接<400>215acaggcaagu aauuggggan gugcgggcgg ggugu35
<210>216<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(21)..(21)<223>21位的n是硫代磷酸连接<400>216acaggcaagu aauuggggag nugcgggcgg ggugu35<210>217<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(22)..(22)<223>22位的n是硫代磷酸连接
<400>217acaggcaagu aauuggggag ungcgggcgg ggugu35<210>218<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(23)..(23)<223>23位的n是硫代磷酸连接<400>218acaggcaagu aauuggggag ugncgggcgg ggugu35<210>219<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(27)..(27)<223>27位的n是硫代磷酸连接<400>219acaggcaagu aauuggggag ugcgggncgg ggugu35<210>220<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(28)..(28)<223>28位的n是硫代磷酸连接<400>220acaggcaagu aauuggggag ugcgggcngg ggugu35<210>221<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(29)..(29)<223>29位的n是硫代磷酸连接<400>221acaggcaagu aauuggggag ugcgggcgng ggugu35<210>222<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(33)..(33)<223>33位的n是硫代磷酸连接<400>222acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gungu35<210>223<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(34)..(34)<223>34位的n是硫代磷酸连接<400>223acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugnu35<210>224<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>224acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>225<211>35<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了1位的之外，其中腺嘌呤是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>225acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>226<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了3位的之外，其中腺嘌呤是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>226acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35
<210>227<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了4位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>227acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>228<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了5位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)
<400>228acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>229<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了7位的之外，其中腺嘌呤是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>229acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>230<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了8位的之外，其中腺嘌呤是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的
<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35 的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>230acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>231<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了9位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>231acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>232<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了11位的之外，其中腺嘌呤是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>232acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>233<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了12位的之外，其中腺嘌呤是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>233acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>234<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了15位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>234acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>235<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了16位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>235acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>236<211>35<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了17位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>236acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>237<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了18位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>237acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35
<210>238<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了19位的之外，其中腺嘌呤是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>238acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>239<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了20位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)
<400>239acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>240<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了22位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>240acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>241<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了24位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的
<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>241acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>242<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了25位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>242acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut35<210>243<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了26位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>243acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>244<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了28位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>244acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>245<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了29位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>245acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>246<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了30位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>246acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>247<211>35<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了31位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>247acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>248<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了33位的之外，其中鸟苷是2′-O-甲基的；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>248acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35
<210>249<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了1、3位的腺嘌呤是2′-O-甲基的，33位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>249acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>250<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了7、8位的腺嘌呤是2′-O-甲基的，15位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)
<400>250acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>251<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(4)..(4)<223>4位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(36)..(36)<223>36位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>251acanggcaag uaauugggga gugcgggcgg ggugun 36<210>252<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(5)..(5)<223>5位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(36)..(36)<223>36位的n是胸苷是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>252acagngcaag uaauugggga gugcgggcgg ggugun 36<210>253<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(6)..(6)<223>6位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(36)..(36)<223>36位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>253acaggncaag uaauugggga gugcgggcgg ggugun 36
<210>254<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(16)..(16)<223>16位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(36)..(36)<223>36位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>254acaggcaagu aauugnggga gugcgggcgg ggugun 36<210>255<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(17)..(17)<223>17位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(36)..(36)<223>36位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>255acaggcaagu aauuggngga gugcgggcgg ggugun 36<210>256<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(18)..(18)<223>18位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(36)..(36)<223>36位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>256acaggcaagu aauugggnga gugcgggcgg ggugun 36
<210>257<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(24)..(24)<223>24位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(36)..(36)<223>36位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>257acaggcaagu aauuggggag ugcngggcgg ggugun 36<210>258<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(25)..(25)<223>25位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(36)..(36)<223>36位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>258acaggcaagu aauuggggag ugcgnggcgg ggugun36<210>259<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(26)..(26)<223>26位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(36)..(36)<223>36位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>259acaggcaagu aauuggggag ugcggngcgg ggugun 36
<210>260<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(30)..(30)<223>30位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(36)..(36)<223>36位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>260acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggn ggugun 36<210>261<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(31)..(31)<223>31位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(36)..(36)<223>36位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>261acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg ngugun36<210>262<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(32)..(32)<223>32位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(36)..(36)<223>36位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>262acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gnugun 36
<210>263<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(40)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(12)..(12)<223>12位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(21)..(21)<223>21位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(23)..(23)<223>23位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(25)..(25)<223>25位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(27)..(27)<223>27位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(32)..(32)<223>32位的n是硫代磷酸连接
<220>
<221>其它特征<222>(41)..(41)<223>41位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>263acaggcaagu anauugggga ngnungncgg gncggggugu n 41<210>264<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(36)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(4)..(4)<223>4位的n是PEG间隔<220>
<221>其它特征<222>(33)..(33)<223>33位的n是PEG间隔<220>
<221>其它特征<222>(37)..(37)<223>37位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>264acanggcaag uaauugggga gugcgggcgg ggnugun 37
<210>265<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了2、38位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(5)..(5)<223>5位的n是PEG间隔<220>
<221>其它特征<222>(34)..(34)<223>34位的n是PEG间隔<220>
<221>其它特征<222>(39)..(39)<223>39位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>265cgcanggcaa guaauugggg agugcgggcg gggnugcgn 39<210>266<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(29)..(29)<223>29位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>266ggcaaguaau uggggagugc gggcggggn 29<210>267<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了4、5位的腺嘌呤是2′-O-甲基的，12位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(29)..(29)<223>29位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>267ggcaaguaau uggggagugc gggcggggn 29<210>268<211>35<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(9)..(9)<223>9位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(18)..(18)<223>18位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(20)..(20)<223>20位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(22)..(22)<223>22位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(24)..(24)<223>24位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(29)..(29)<223>29位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)
<400>268ggcaaguana uuggggangn ungncgggnc ggggn 35<210>269<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了4、5位的腺嘌呤是2′-O-甲基的，13位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(9)..(9)<223>9位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(18)..(18)<223>18位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(20)..(20)<223>20位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(22)..(22)<223>22位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(24)..(24)<223>24位的n是硫代磷酸连接
<220>
<221>其它特征<222>(29)..(29)<223>29位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>269ggcaaguana uuggggang ungncgggnc ggggn 35<210>270<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了1位的腺嘌呤是2′-O-甲基的，33位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>270acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>271<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了8、11位的腺嘌呤是2′-O-甲基的，9位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>271acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>272<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了9位的腺嘌呤是2′-O-甲基的，18、20、22位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>272acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>273<211>35<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了26、28、29的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>273acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>274<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了1、8、11、19位的腺嘌呤是2′-O-甲基的，9、18、20、22、26、28、29、33位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)
<400>274acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>275<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了16、17、24、25、30、31位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>275acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>276<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-O-甲基的，除了3、7、12位的腺嘌呤是脱氧的，4、5、15位的鸟苷是2′-O-甲基的；
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>276acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>277<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(4)..(4)<223>n在4位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>277acangcaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35
<210>278<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(5)..(5)<223>n在5位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>278acagncaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>279<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(4)..(5)<223>n在4、5位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>279acanncaagu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35<210>280<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(9)..(9)<223>n在9位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>280acaggcaanu aauuggggag ugcgggcggg gugut 35
<210>281<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(15)..(15)<223>n在15位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>281acaggcaagu aauungggag ugcgggcggg gugut 35<210>282<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(16)..(16)<223>n在16位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>282acaggcaagu aauugnggag ugcgggcggg gugut 35<210>283<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(17)..(17)<223>n在17位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>283acaggcaagu aauuggngag ugcgggcggg gugut 35
<210>284<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(18)..(18)<223>n在18位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>284acaggcaagu aauugggnag ugcgggcggg gugut 35<210>285<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(15)..(16)<223>n在15、16位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>285acaggcaagu aauunnggag ugcgggcggg gugut 35<210>286<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(16)..(17)<223>n在16、17位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>286acaggcaagu aauugnngag ugcgggcggg gugut 35
<210>287<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(17)..(18)<223>n在17、18位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>287acaggcaagu aauuggnnag ugcgggcggg gugut 35<210>288<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(15)..(18)<223>n在15、16、17、18位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>288acaggcaagu aauunnnnag ugcgggcggg gugut 35<210>289<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(20)..(20)<223>n在20位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>289acaggcaagu aauuggggan ugcgggcggg gugut 35
<210>290<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(22)..(22)<223>n在22位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>290acaggcaagu aauuggggag uncgggcggg gugut 35<210>291<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(24)..(24)<223>n在24位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>291acaggcaagu aauuggggag ugcnggcggg gugut 35<210>292<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(25)..(25)<223>n在25位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>292acaggcaagu aauuggggag ugcgngcggg gugut 35
<210>293<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(26)..(26)<223>n在26位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>293acaggcaagu aauuggggag ugcggncggg gugut 35<210>294<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(24)..(25)<223>n在24、25位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>294acaggcaagu aauuggggag ugcnngcggg gugut 35<210>295<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(25)..(26)<223>n在25、26位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>295acaggcaagu aauuggggag ugcgnncggg gugut 35
<210>296<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(24)..(26)<223>n在24、25、26位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>296acaggcaagu aauuggggag ugcnnncggg gugut 35<210>297<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(28)..(28)<223>n在28位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>297acaggcaagu aauuggggag ugcgggcngg gugut 35<210>298<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(29)..(29)<223>n在29位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>298acaggcaagu aauuggggag ugcgggcgng gugut 35
<210>299<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(30)..(30)<223>n在30位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>299acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggn gugut 35<210>300<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(31)..(31)<223>n在31位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>300acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg nugut 35<210>301<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(28)..(29)<223>n在28、29位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>301acaggcaagu aauuggggag ugcgggcnng gugut 35
<210>302<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(29)..(30)<223>n在29、30位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>302acaggcaagu aauuggggag ugcgggcgnn gugut 35<210>303<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶
<220>
<221>其它特征<222>(30)..(31)<223>n在30、31位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>303acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggn nugut 35<210>304<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(28)..(31)<223>n在28、29、30、31位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>304acaggcaagu aauuggggag ugcgggcnnn nugut 35
<210>305<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有嘌呤(A和G)为脱氧嘌呤，所有的嘧啶(C和U)为2’-O-甲基-嘧啶<220>
<221>其它特征<222>(33)..(33)<223>n在33位是脱氧肌苷<220>
<221>其它特征<222>(35)..(35)<223>35位的胸苷是反向脱氧腺苷(3′-3′连接)<400>305acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gunut 35<210>306<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了17、18、25、26、31、32位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的
<220>
<221>其它特征<222>(3)..(3)<223>3位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(36)..(36)<223>36位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>306acnaggcaag uaauugggga gugcgggcgg ggugun 36<210>307<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(36)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了18、19、26、27、32、33位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(4)..(4)<223>4位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(6)..(6)<223>6位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(37)..(37)<223>37位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)
<400>307acangngcaa guaauugggg agugcgggcg gggugun37<210>308<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(40)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了22、23、30、31、36、37位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(7)..(7)<223>7位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(9)..(9)<223>9位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(11)..(11)<223>11位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(14)..(14)<223>14位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(16)..(16)<223>16位的n是硫代磷酸连接
<220>
<221>其它特征<222>(20)..(20)<223>20位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(41)..(41)<223>41位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>308acaggcnana ngunanauun ggggagugcg ggcggggugu n 41<210>309<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了16、17、28、29、34、35位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(18)..(18)<223>18位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(20)..(20)<223>20位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(22)..(22)<223>22位的n是硫代磷酸连接
<220>
<221>其它特征<222>(25)..(25)<223>25位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(39)..(39)<223>39位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>309acaggcaagu aauugggngn angungcggg cggggugun 39<210>310<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了16、17、24、25、33、34位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(26)..(26)<223>26位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(29)..(29)<223>29位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(31)..(31)<223>31位的n是硫代磷酸连接
<220>
<221>其它特征<222>(38)..(38)<223>38位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>310acaggcaagu aauuggggag ugcggngcng ngggugun 38<210>311<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了16、17、24、25、30、31位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(33)..(33)<223>33位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(36)..(36)<223>36位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>311acaggcaagu aauuggggag ugcgggcggg gungun 36<210>312<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了25、26、37、38、46、47位的鸟苷是2′-O-甲基的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(3)..(3)<223>3位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(5)..(5)<223>5位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(7)..(7)<223>7位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(10)..(10)<223>10位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(12)..(12)<223>12位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(14)..(14)<223>14位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(17)..(17)<223>17位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(19)..(19)<223>19位的n是硫代磷酸连接
<220>
<221>其它特征<222>(23)..(23)<223>23位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(27)..(28)<223>27位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(29)..(29)<223>29位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(31)..(31)<223>31位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(34)..(34)<223>34位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(39)..(39)<223>39位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(42)..(42)<223>42位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(44)..(44)<223>44位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(49)..(49)<223>49位的n是硫代磷酸连接
<220>
<221>其它特征<222>(52)..(52)<223>52位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>312acnangngcn anangunana uungggngna ngungcggng cngngggung un 52<210>313<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-O-甲基的，除了4、9、15位的腺嘌呤是脱氧的，5、6、19位的鸟苷是脱氧的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(3)..(3)<223>3位的n是代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(8)..(8)<223>8位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(14)..(14)<223>14位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(18)..(18)<223>18位的n是硫代磷酸连接
<220>
<221>其它特征<222>(39)..(39)<223>39位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>313acnaggcnaa guanauungg ggagugcggg cggggugun 39<210>314<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(42)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-O-甲基的，除了4、9、15、25位的腺嘌呤是脱氧的，5、6、19、23、27、30位的鸟苷是脱氧的之外；所有的嘧啶(C和U)是2′-O-甲基的<220>
<221>其它特征<222>(3)..(3)<223>3位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(8)..(8)<223>8位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(14)..(14)<223>14位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(18)..(18)<223>18位的n是硫代磷酸连接
<220>
<221>其它特征<222>(22)..(22)<223>22位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(24)..(24)<223>24位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(26)..(26)<223>26位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(29)..(29)<223>29位的n是硫代磷酸连接<220>
<221>其它特征<222>(43)..(43)<223>43位的n是反向脱氧胸苷(3′-3′连接)<400>314acnaggcnaa guanauungg gngnangung cgggcggggu gun 43<210>315<211>335<212>PRT<213>小鼠<400>315Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu1 5 10 15Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val20 25 30
Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu35 40 45Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln50 55 60Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys65 70 75 80Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr85 90 95Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp100 105 110Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys115 120 125Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln130 135 140Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro145 150 155 160Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys165 170 175Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln180 185 190Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu195 200 205
Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser210 215 220Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln225 230 235 240Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro245 250 255Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val260 265 270Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys275 280 285Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln290 295 300Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn305 310 315 320Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser325 330 335<210>316<211>196<212>PRT<213>小鼠<400>316Met Leu Asp Cys Arg Ala Val Ile Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp Val1 5 10 15Thr Gln Gly Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln20 25 30
Cys Gln Gln Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His35 40 45Ala Pro Ala Gly His Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu Glu Asp Glu Glu50 55 60Thr Lys Asn Asn Val Pro Arg Ile Gln Cys Glu Asp Gly Cys Asp Pro65 70 75 80Gln Gly Leu Lys Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile Arg Gln85 90 95Gly Leu Ala Phe Tyr Lys His Leu Leu Asp Ser Asp Ile Phe Lys Gly100 105 110Glu Pro Ala Leu Leu Pro Asp Ser Pro Met Glu Gln Leu His Thr Ser115 120 125Leu Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Asp His Pro Arg Glu130 135 140Thr Gln Gln Met Pro Ser Leu Ser Ser Ser Gln Gln Trp Gln Arg Pro145 150 155 160Leu Leu Arg Ser Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Leu Ala Ile165 170 175Ala Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu180 185 190Val Pro Thr Ala195
<210>317<211>215<212>PRT<213>小鼠<400>317Met Cys Gln Ser Arg Tyr Leu Leu Phe Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu1 5 10 15Asn His Leu Ser Leu Ala Arg Val Ile Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg20 25 30Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asp Met Val35 40 45Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp50 55 60Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr Leu Lys Thr65 70 75 80Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser Cys Leu Ala Thr Arg85 90 95Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro Gln Lys Thr100 105 110Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys115 120 125Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu Gln Asn His130 135 140Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met Leu Val Ala Ile Asp145 150 155 160
Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu Thr Leu Arg Gln Lys165 170 175Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met Lys Leu Cys180 185 190Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val Thr Ile Asn Arg Val195 200 205Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala210 21权利要求
1.一种特异性结合IL-23的适体。
2.根据权利要求1所述的适体，其中IL-23为运行生物功能的IL-23变异体，该生物功能基本上与IL-23功能相同。
3.根据权利要求2所述的适体，其中IL-23的变异体具有如同IL-23大体相同的结构和大体上结合上述适体的相同的能力。
4.根据权利要求3所述的适体，其中IL-23或其变异体包括氨基酸序列与包括SEQ ID NOs 4和5的序列有至少70％的同源性。
5.根据权利要求3所述的适体，其中IL-23或其变异体包括氨基酸序列与包括SEQ ID NOs 4和5的序列有至少80％的同源性。
6.根据权利要求3所述的适体，其中IL-23或其变异体包括氨基酸序列与包括SEQ ID NOs 4和5的序列有至少90％的同源性。
7.根据权利要求3所述的适体，其中IL-23或其变异体具有包括SEQ ID NOs 4和5的序列。
8.根据权利要求7所述的适体，其中适体为核糖核酸。
9.根据权利要求8所述的适体，其中适体为单链核糖核酸。
10.根据权利要求7所述的适体，其中适体为脱氧核糖核酸。
11.根据权利要求10所述的适体，其中适体为单链脱氧核糖核酸。
12.根据权利要求7所述的适体，其中适体具有对IL-23或其变异体为约100nM或更少的的解离常数。
13.根据权利要求12所述的适体，其中适体具有对IL-23或其变异体为约50nM或更少的解离常数。
14.根据权利要求13所述的适体，其中适体具有对IL-23或其变异体为约10nM或更少的的解离常数。
15.根据权利要求14所述的适体，其中适体具有对人类IL-23或其变异体为约1nM或更少的的解离常数。
16.根据权利要求7所述的适体，其中适体包括至少一个化学修饰。
17.根据权利要求16所述的适体，其中修饰选自由在糖位置上的化学取代，在磷酸位置上的化学取代，和在碱基位置、核酸上的化学取代组成的组。
18.根据权利要求16所述的适体，其中修饰选自由加入修饰的核苷酸，3′封端，与高分子量、非免疫原化合物结合，与亲脂性化合物结合，和磷酸骨架修饰组成的组。
19.根据权利要求18所述的适体，其中非免疫原、高分子量化合物为聚氧化烷撑。
20.根据权利要求19所述的适体，其中聚氧化烷撑为聚乙二醇。
21.根据权利要求18所述的适体，其中骨架修饰包括加入一个或多个硫代磷酸到磷酸骨架中。
22.根据权利要求21所述的适体，其中适体包括加入少于10个硫代磷酸在磷酸骨架中。
23.根据权利要求21所述的适体，其中适体包括加入少于6个硫代磷酸在磷酸骨架中。
24.根据权利要求22所述的适体，其中适体包括加入少于3个硫代磷酸在磷酸骨架中。
25.根据权利要求7所述的适体，其中适体调节IL-23和其变异体的功能。
26.根据权利要求25所述的适体，其中适体抑制IL-23和其变异体的功能。
27.根据权利要求26所述的适体，其中适体体内抑制IL-23和其变异体的功能。
28.根据权利要求26所述的适体，其中适体阻止IL-23与IL-23受体的结合。
29.根据权利要求1所述的适体，其中适体具有与包括选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ ID NOs 91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-134、SEQ ID NOs135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs 164-172、SEQ IDNOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs 199-314组成的组的核苷酸序列的适体结合IL-23基本相同的能力。
30.根据权利要求1所述的适体，其中适体具有与包括选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ ID NOs 91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-134、SEQ ID NOs135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs 164-172、SEQ IDNOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs 199-314组成的组的核苷酸序列的适体结合IL-23基本相同的结构和基本相同的能力。
31.根据权利要求1所述的适体，其中适体包括的核苷酸序列与选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ ID NOs91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-134、SEQ IDNOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs 164-172、SEQID NOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs199-314任一个序列至少80％的同源性。
32.根据权利要求31所述的适体，其中适体包括的核苷酸序列与选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ IDNOs 91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-134、SEQID NOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs 164-172、SEQ ID NOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs199-314任一个序列至少90％的同源性。
33.根据权利要求1所述的适体，其中包括20个邻接核苷酸的适体与选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQID NOs 91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-134、SEQ ID NOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs164-172、SEQ ID NOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQID NOs 199-314组成组的任一个序列性的区别区域序列中20个邻接核苷酸的序列具有同源性。
34.根据权利要求33所述的适体，其中包括8个邻接核苷酸的适体与选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQID NOs 91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-134、SEQ ID NOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs164-172、SEQ ID NOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQID NOs 199-314组成组的任一个序列性的区别区域序列中8个邻接核苷酸的序列具有同源性。
35.根据权利要求34所述的适体，其中包括4个邻接核苷酸的适体与选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQID NOs 91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-134、SEQ ID NOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs164-172、SEQ ID NOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQID NOs 199-314组成组的任一个序列性的区别区域序列中4个邻接核苷酸的序列具有同源性。
36.一种能结合IL-23和其变异体的适体，其包括选自由SEQ IDNOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ ID NOs 91-96、SEQ IDNOs 103-118、SEQ ID NOs 124-134、SEQ ID NOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs 164-172、SEQ ID NOs176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs 199-314组成组的核苷酸序列。
37.根据权利要求34所述的适体，进一步包括至少一个化学修饰。
38.根据权利要求37所述的适体，其中修饰选自由在糖位置上的化学取代，在磷酸位置上的化学取代，和在碱基位置、核酸上的化学取代组成的组。
39.根据权利要求37所述的适体，其中修饰选自由加入修饰的核苷酸，3′封端，与高分子量、非免疫原化合物结合，与亲脂性化合物结合，和磷酸骨架修饰组成的组。
40.根据权利要求39所述的适体，其中非免疫原、高分子量化合物为聚氧化烷撑。
41.根据权利要求40所述的适体，其中聚氧化烷撑为聚乙二醇。
42.根据权利要求39所述的适体，其中骨架修饰包括加入一个或多个硫代磷酸到磷酸骨架中。
43.根据权利要求42所述的适体，其中适体包括加入少于10个硫代磷酸在磷酸骨架中。
44.根据权利要求43所述的适体，其中适体包括加入少于6个硫代磷酸在磷酸骨架中。
45.根据权利要求44所述的适体，其中适体包括加入少于3个硫代磷酸在磷酸骨架中。
46.根据权利要求1所述的适体，能进一步结合IL-12。
47.根据权利要求46所述的适体，其中IL-12是IL-12的变异体，该IL-12的变异体履行的生物功能与IL-12功能基本相同。
48.根据权利要求47所述的适体，其中IL-12的变异体具有基本相同结构和与IL-12相比具有结合上述适体基本相同的能力。
49.根据权利要求48所述的适体，其中IL-12或其变异体包括的氨基酸序列与包括SEQ ID NOs 4和6的序列具有至少80％的同源性。
50.根据权利要求48所述的适体，其中IL-12或其变异体包括的氨基酸序列与包括SEQ ID NOs 4和6的序列具有至少90％的同源性。
51.根据权利要求48所述的适体，其中IL-12或其变异体具有包括SEQ ID NOs 4和6的氨基酸序列。
52.根据权利要求51所述的适体，其中适体调节IL-12或其变异体的功能。
53.根据权利要求52所述的适体，其中适体抑制IL-12或其变异体的功能。
54.根据权利要求53所述的适体，其中适体体内抑制IL-12或其变异体的功能。
55.根据权利要求53所述的适体，其中适体阻止IL-12与IL-12受体的结合。
56.根据权利要求4所述的适体，其中IL-23或其变异体为小鼠IL-23。
57.根据权利要求56所述的适体，其中小鼠IL-23具有包括SEQID NOs 315和316的氨基酸序列。
58.一种药物组合物，其包括有效治疗剂量的适体，该适体包括选自由SEQ ID NOs 13-66、SEQ ID NOs 71-88、SEQ ID NOs91-96、SEQ ID NOs 103-118、SEQ ID NOs 124-130、SEQ IDNOs 135-159、SEQ ID NO 162、和SEQ ID NOs 164-172、SEQID NOs 176-178、SEQ ID NOs 181-196、和SEQ ID NOs203-314组成组的核酸序列，或其盐，和药物用载体或赋形剂。
59.一种治疗、预防或改善由IL-23介导的疾病的方法，该方法包括对脊椎动物进行权利要求58所述组合物的给药。
60.根据权利要求59所述的方法，其中脊椎动物为哺乳动物。
61.根据权利要求60所述的方法，其中哺乳动物为人类。
62.根据权利要求59所述的方法，其中上述疾病选自由自体免疫疾病、炎性疾病、癌症、骨质疏松症的骨吸收、和I型糖尿病组成的组。
63.根据权利要求62所述的方法，其中自体免疫疾病选自由多重硬化症、风湿性关节炎、牛皮癣、全身性红斑狼疮、和肠易激综合症组成的组。
64.根据权利要求62所述的方法，其中癌症选自由直肠癌、肺癌、和肺癌转移组成的组。
65.根据权利要求63所述的方法，其中肠易激综合症选自由克隆氏病(Crohn′s Disease)和溃疡性结肠炎组成的组。
66.一种药物组合物，包括有效治疗剂量的适体该适体包括选自由SEQ ID NO 14、SEQ ID NOs 17-19、SEQ ID NO 21、SEQID NOs 27-32、SEQ ID NOs 34-40、SEQ ID NO 42、SEQ IDNO 49、SEQ ID NOs 60-61、SEQ ID NOs 91-92、SEQ ID NO94、和SEQ ID NOs 103-118组成组的核酸序列，或其盐，和药物用载体或赋形剂。
67.一种治疗、预防或改善由IL-12介导的疾病的方法，该方法包括对人类进行权利要求66所述组合物的给药。
68.根据权利要求67所述的方法，其中上述疾病选自由自体免疫疾病、炎性疾病、癌症、骨质疏松症的骨吸收、和I型糖尿病组成的组。
69.根据权利要求68所述的方法，其中自体免疫疾病选自由多重硬化症、风湿性关节炎、牛皮癣、全身性红斑狼疮、和肠易激综合症组成的组。
70.根据权利要求68所述的方法，其中癌症选自由直肠癌、肺癌、和肺癌转移组成的组。
71.根据权利要求69所述的方法，其中肠易激综合症选自由克隆氏病(Crohn′s Disease)和溃疡性结肠炎组成的组。
72.一种检测方法，包括IL-23或其变异体的等检组合物接触权利要求36所述适体并检测IL-23或其变异体存在或不存在。
73.根据权利要求36所述的适体在体外诊断中的使用。
74.根据权利要求36所述的适体在体内诊断中的使用。
全文摘要
本发明提供了治疗发病机理与细胞因子相关的免疫疾病的材料和方法。本发明的材料和方法对自体免疫疾病的治疗是有利的。本发明的材料和方法是针对能够结合人类IL－23和/或人类IL－12细胞因子的核酸配体并因此调节它们的生物活性，作为免疫、自体免疫和癌症治疗的治疗药物是有用的。
文档编号C07H21/04GK1976943SQ200580014470
公开日2007年6月6日 申请日期2005年3月7日 优先权日2004年3月5日
发明者约翰·L·戴纳, 艾利希那·费格森, 滨口信子, 萨拉·切斯沃思·克内, H·A·丹尼尔·莱加斯, 波加·桑霍尼, 克里斯汀·汤普森 申请人:阿切埃米克斯有限公司