专利名称：富含具有延伸的α链的血纤蛋白原的血纤蛋白原制备物的制作方法
技术领域：
本发明涉及血纤蛋白原制备物及血纤蛋白原制备物在医学中的应用。特别地，本发明涉及富含具有延 伸的α链的血纤蛋白原的血纤蛋白原制备物，及涉及产生这种制备物的方法及其应用。
背景技术：
血纤蛋白原(f ibrinogen)是ー种可溶的血楽;糖蛋白，其在人体内主要由肝实质细胞合成。其是ニ聚体分子，由通过ニ硫键连接的两对三个称作Αα、Ββ和Y的多肽链组成。所述三条多肽链由三个单独的基因编码。主要存在形式(HMW fib)携带Aa链，其作为625个氨基酸的前体合成，作为610个氨基酸的多肽链存在于在血浆中发现的血纤蛋白原中，B β链含有461个氨基酸，Y链含有411个氨基酸。所述三条多肽链从3个mRNA中单独地合成。三条成分链(Aa、Ββ和Y)装配成作为六条链的ニ聚体(Aa、Ββ，Υ)2的最終形式，该装配在内质网(ER)的腔隙中发生。血纤蛋白原在血液中以高浓度(l_2g/L)循环，并且表现为高度的异质性。据估计在每个个体中有大约ー百万个不同的血纤蛋白原分子循环。仅占总血纤蛋白原的一小部分(在大多数情况中不超过几个百分数)的这些变体中的大多数在功能和结构方面不同。Aa链的羧基末端部分的蛋白酶解产生三种主要循环形式的血纤蛋白原，其具有明显不同的分子量。血纤蛋白原以高分子量形式合成(HMW，分子量340kDa;循环中的主要形式的Aa链含有610个氨基酸)。一条A a链的降解产生LMW形式(MW=305kDa) ;LMW’形式(270kDa)是变体，其中两条Aa链在羧基末端被部分降解。在健康个体的血液中，50_70%的血纤蛋白原是HMW，20-50%是具有一或两条降解的Aa链的血纤蛋白原(de Maat andVerschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12,377)。所述 HMW 和 LMW’ 变体不出不同的凝血时间和血纤蛋白多聚体结构(Hasegawa N, Sasaki S. (1990)Thromb. Res. 57，183)。熟知的可变剪接变体是所谓的gamma prime(Y’)变体和a-ext Fib或Fib420变体。所述α-ext Fib或Fib420变体的分子量为420kDa，占总循环血纤蛋白原的1-3%(de Maat and Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12, 377) 延伸的 a -ext Fib 同种型与常规的血纤蛋白原α -链不同，其由于可变剪接而存在额外的236个残基的C末端球形结构域。在文献中给出了关于Fib420的功能和特性的矛盾数据。基于对血浆衍生的a -ext Fib 的研究，Applegate et al, Blood (2000) 95:2297 推断 α-ext Fib 的聚合和交联性质与血浆衍生的HMWFib无明显不同。他们的结论是所述额外的C-结构域对于凝血无作用，并提示所述结构域的功能也许支持整联蛋白介导的细胞粘附。在EP I 495 051中，提示Fib420可能对降解较不敏感，及对血凝块结构可能有作用。然而，未进行证实及未提示该作用在血凝块结构或强度中可能是增强或是降低。Mosesson et al. (Biophys.Chem. 112，209:2004)基于脐带血浆衍生的a -extFib研究了血凝块的超微结构。他们报道了 α-ext Fib血凝块的纤维比基于HMW血纤蛋白原的那些纤维更细及更多分支，但是其具有所有血纤蛋白纤维特有的相同周期性。所述作者提示α-ext Fib中延伸的α-链提供与细胞整联蛋白相互作用的位点的功能。详细描述本发明涉及血纤蛋白原制备物，其含有至少95%(w/w)的血纤蛋白原，并且其中至少10%的血纤蛋白原是Fib420形式。在本领域中，Fib420也称作“ a -ext Fib”、“具有延伸的α -链的血纤蛋白原”或者“血纤蛋白原·”。在本发明中，这些术语可互換使用。所有这些术语均是指所述结构(Ααεχ ,Ββ , Y)的对称分子，其中如在HMW fib中发现的两条常规血纤蛋白原α-链由延伸的α链置換。
在本发明中，术语“血纤蛋白原制备物”是指分离形式的血纤蛋白原，例如血纤蛋白原的血浆分离物或者细胞上清分离物。其也可以是指合成的血纤蛋白原制备物。本发明的血纤蛋白原制备物优选含有基于总蛋白质的至少65%w/w、至少70%>w/w、至少75%w/w、至少80%w/w或者至少85%的血纤蛋白原。更优选地，其是纯的制备物，其中基本上没有污染物如其它蛋白质存在，其含有基于总蛋白质的至少90%w/w、至少95%w/w、至少96%w/w、至少97%w/w或者至少98%的血纤蛋白原。更优选地，本发明的血纤蛋白原制备物包含基于总蛋白质的至少99%w/w或者至少99. 5%w/w的血纤蛋白原。这种纯血纤蛋白原制备物特别适合配制用于医学应用中的组合物，如用于伤ロ治疗和手术修复的组合物。根据本发明，所述制备物中至少10%的血纤蛋白原是Fib420形式。优选地，至少15%w/w、至少20%w/w、至少25%w/w或者至少30%w/w的血纤蛋白原是Fib420形式。更优选地，至少40%w/w、至少50%w/w、至少60%w/w、至少70%w/w、至少80%w/w或者至少90%w/w是Fib420形式。最优选地，至少95%w/w、至少99%w/w或者所有血纤蛋白原均是Fib420形式。本发明的血纤蛋白原制备物的一个优势是血纤蛋白原制备物的纤溶酶介导的消化慢于血浆衍生的血纤蛋白原。其对于纤溶酶消化的增强的抗性可有益于治疗患有血纤蛋白溶解亢进的患者，通常见于获得性凝血功能障碍情况中。使用本发明的血纤蛋白原制备物，血凝块较快速地形成，并且形成的血凝块与血浆衍生的血纤蛋白原或HMW血纤蛋白原形成的血凝块相比具有更高的血凝块坚固性(firmness)。这意味着当使用本发明的血纤蛋白原制备物时，血纤蛋白血凝块稳定性增强，本发明的血纤蛋白原制备物与现有制备物相比更强效。更强效的血纤蛋白原制备物使得给予的液体量和治疗性蛋白质的量均降低。这对于静脉内使用以治疗稀释性凝血功能障碍是有利的。目前对于静脉内(i. V)注射血纤蛋白原以补偿低凝血活性，需要高剂量的血纤蛋白原(毎次治疗、g血纤蛋白原)。这是通过直接注射70mg/kg剂量给予的。由于血纤蛋白原通常在20mg/ml最大浓度可以被溶解,这意味着需要静脉内给予成人大约250ml液体。通过提供更强效的血纤蛋白原以降低整个剂量是有益的。另ー优势是使用本发明的血纤蛋白原制备物与使用血浆衍生的血纤蛋白原或HMW血纤蛋白原的制备物相比导致的血凝块形成对因子XIII的依赖性降低。在缓冲液中由α-延伸的Fib (不存在因子XIII)形成的血凝块的强度高于含有ー些因子XIII的血浆衍生的血纤蛋白原形成的血凝块的强度。不需要因子XIII以形成坚实的血凝块。因此，在一个实施方案中，本发明的血纤蛋白原制备物没有因子XIII。使用ROTEM分析可以测量a -ext rhFib和血衆衍生的血纤蛋白原的凝血时间(CT)、血凝块形成时间(CFT)和血凝块坚固性。ROTEM (PentapharmGmbH, Munich, Germany)表不 Rotation ThromboElastoMetry。该技术利用在一次性试管中浸没在(血液)样品中的旋转轴。在不同凝血条件下弾性(elasticity)的改变导致轴旋转的改变，这在凝血 弹性描记图中观测到，反映出机械凝血參数(见例如LuddingtonR.J. (2005) Clin Lab Haematol. 200527 (2) : 81)。在相似条件下的ROTEM 系统检测中，本发明的血纤蛋白原制备物的性能通常至少同样好于或者优于其中血纤蛋白原变体分布类似于在人血浆中的变体分布(即少于5%w/w的血纤蛋白原是Fib420类型)的血纤蛋白原制备物或组合物。这是例如基于血浆衍生的血纤蛋白原的血纤蛋白原浓缩物的情況。这种浓缩物是可商购的。特别地，其血凝块形成时间低于其中低于5%w/w的血纤蛋白原是Fib420类型的血纤蛋白原制备物的血凝块形成时间。优选地，本发明的血纤蛋白原制备物的血凝块形成时间是其中低于5%w/w的血纤蛋白原是Fib420类型的血纤蛋白原制备物如血浆衍生的血纤蛋白原制备物的血凝块形成时间的最多80%、最多60%、最多50%、最多40%、最多30%，、最多20%、最多10%。在实施例中呈现的使用α-ext rhFib的ROTEM试验表明本发明的血纤蛋白原制备物的血凝块形成时间(CFT)低于纯化的血浆衍生的血纤蛋白原在静脉内应用产生的CFT。另ー方面，本发明涉及包含本发明的血纤蛋白原制备物的组合物。除了血纤蛋白原之外，所述组合物还可包含激活物，如凝血酶或凝血酶样蛋白质，如reptilase。其也可包含适用于注射用制备物中的赋形剂。所述制备物可以是干燥形式及随后用例如缓冲盐水等重建，或者其可以是液体形式，是悬浮液或者溶液。合适的赋形剂材料可包括溶剂和助溶齐U，如こ醇、甘油、PEG、油等；增溶剂、湿润剂、悬浮剂、乳化剂或者增稠剂，如羧甲基纤维素、水解的明胶、普流罗尼克(pluronics)、聚山梨醇酯等；螯合剂,如EDTA I丐、DTPA等；抗氧化剂和还原剂，如BHT、抗坏血酸、焦亚硫酸钠等；抗微生物防腐剂，如苯甲醇、苯酚、苯甲酸酯类(parabens)等；缓冲剂和pH调节剂,如氨丁三醇(tromethamine)、磷酸钠、こ酸钠、氢氧化钠等；膨胀剂(bulking agent)、防护剂和张カ调节剂,如丙氨酸、白蛋白、葡聚糖、乳糖、山梨糖醇、氯化钠、组氨酸等；特殊的添加剂，如西甲娃油(simethicone)作为抗泡沫剂,海藻糖用于降低蛋白质聚集。所述组合物可用于其中使用血浆衍生的或者重组的血纤蛋白原的任何应用中。主要应用是止血及密封组织。在本发明的一个实施方案中，所述组合物是药物组合物。所述药物组合物包含本发明的血纤蛋白原制备物及药物可接受的载体。“药物可接受的载体”是指利用其给予本发明的血纤蛋白原制备物的运载体、辅助剂、佐剂、稀释剂、赋形剂或者载体。药物可接受的载体的实例包括但不限于水、缓冲盐水、こ醇、多元醇(例如甘油、丙ニ醇、液体聚こニ醇等)、ニ甲基亚砜(DMSO)、油、洗涤剂、悬浮剂或者其合适的混合物。合适的药物可接受的载体和配制物在Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19thEd. (Mack Publishing Co. , Easton, 1995)及〃 Remington: The Science And Practice OfPharmacy^by Alfonso R. Gennaro (Lippincott Williams & Wilkins, 2005)中描述。所述药物组合物可局部使用，可包括水溶性、吸水性、水不溶性或者水溶胀性载体。合适的材料包括糖，如单糖和ニ糖，包括乳糖、甘露醇和海藻糖，或者葡聚糖及葡聚糖聚合物等，如Sephadex,其可以不同颗粒大小获得,淀粉、pullulan衍生物、透明质酸酯等。纤维素产品如微晶纤维素(Avicel range)、甲基纤维素、羧甲基纤维素、超细(microfine)纤维素或者羟基丙基纤维素及其它材料如交联的聚こ烯吡咯烷酮(PVP)可以单独或混合使用。合适的载体也包括聚こニ醇(PEG)，优选分子量为大约1000 ;聚こ烯吡咯烷酮(PVP)，优选平均分子量为大约50，000 ;聚(丙烯酸)，PVA，聚(甲基こ烯基醚-马来酸酐共聚物)，聚(环氧こ烯)，及葡聚糖，典型平均分子量为大约40，000。可包含片剂崩解剂。这些材料从伤口中吸收水分，迅速扩展及因此增强粉末混合物的止血成分的可湿性。合适的实例包括羧甲淀粉钠(Explomb' 或Primojel )，其平均颗粒大小范围为35-55 μ m。大约25%的葡萄糖単元是羧甲基化的；交联的聚こ烯吡咯烷酮(Polyplasdone );藻酸盐和褐藻酸；交联的羧甲基纤维素钠(Ac-Di-Sol)。可以使用的树胶和凝胶剂包括例如黄苗胶、刺梧桐胶(karaya gum)、可溶淀粉、明胶、果胶、瓜尔豆胶和gelIan gum。特别优选的添加剂是Emdex ，即水合形式的dextrates (含有少量淀粉寡糖的喷雾结晶的葡萄糖)。其是高度精制的产物，由白色自由流动的喷雾结晶的大孔球体组成，中位粒径为190-220 μ m。最优选的添加剂是NON-PAREILSEEDS : (Sugar Spheres)。这些用于多个药物単位中，用以获得改良的含量均匀度、一致和受控制的药物释放及高度药物稳定性，大小范围是 200-2000mm。药物可接受的载体可包含泡腾组合(effervescent couple)。在泡腾反应后产生的气体可以使血纤蛋白密封剂(fibrin sealant)扩展为“泡沫”和/或増加包含所述血纤蛋白密封剂的粉末的可湿性。随着所述粉末应用于伤ロ，泡腾成分溶解、反应及释放，即释出ニ氧化碳，从而増加止血成分的可湿性，及因此增强血凝块形成的时间。血纤蛋白密封剂一旦充分反应且血凝块形成，其呈现出稳定泡沫形式。所述泡腾组合典型地包含柠檬酸或者柠檬酸氢钠和碳酸氢钠，但是也可以使用其它生理学可接受的酸/碱金属或者碱土金属碳酸盐混合物，例如酒石酸、脂肪酸、反丁烯ニ酸或苹果酸，以及碳酸(氢)钠、钾或钙或者甘氨酸钠碳酸盐。通常地，发现当泡腾组合的成分在化学分子当量基础上的相对比率在4:3至1:3范围、更优选大约2:3时呈现出优选的口味特性，这个比率以酸性成分与碱性成分的分子当量比率表示。就柠檬酸与碳酸氢钠的优选组合而言，这些值基于重量表示酸与碱成分的比率为1:1至0.3:1的范围，优选0.5: I。本发明的药物组合物适于促进组织粘附、改良伤ロ愈合或者适于静脉内给予。在一个实施方案中，本发明的药物组合物是血纤蛋白密封剂。本发明的血纤蛋白密封剂典型地包含凝血酶。所述密封剂可以是任何形式，干燥或液体形式。其中可使用本发明的血纤蛋白原制备物的干燥的密封剂的合适实例是Fibrocaps 粉末密封剂，其在W097/44015中被描述，且基于血纤蛋白原和凝血酶的微粒。所述单独的成分通过喷雾干燥血纤蛋白原与海藻糖及凝血酶与海藻糖而制备。每种粉末成分均具有主要颗粒大小为大约直至50μπι直径。所述Fibrocaps 血纤蛋白密封剂是这些成分的混合物，已经证实其是易于使用的稳定及有效的局部止血剤。所述产物可立即使用，不用重建，并可用于伤ロ治疗、手术修复及作为血管外支架(extravascular stent)。在与含水液体如血液接触时,暴露的凝血酶使暴露的血纤蛋白原转变为不溶的血纤蛋白聚合物。本发明的血纤蛋白原制备物提 供进ー步改良的凝血性质。
本发明的组合物可用于伤ロ、伤ロ缝合、切ロ及可发生出血的其它开放性损伤。伤ロ包括对活生物体中的任何组织的损害。所述组织可以是内部组织(如器官)或外部组织(如眼或皮肤)，及可以是硬组织(如骨)或者软组织(如肝或脾)。伤ロ可以是由任何原因导致，包括感染、手术干预、烧伤或创伤。本发明的组合物可用于手术干预如在胃肠道系统中，如食管、胃、小肠、大肠、直肠，实质性器官如肝、胰腺、脾、肺、肾、肾上腺、淋巴和甲状腺；在耳、鼻和喉部区域(ENT)的手术介入，包括口腔外科手术，心血管外科手术，美容外科手术、神经外科手术，淋巴、胆汁和脑脊液(CSF)瘘，胸腔和肺手术期间的漏气，胸腔手术包括气管、支气管和肺手术，妇科、血管科、泌尿科、骨科(如松质切除木)和急救外科手木。作为血管外支架或支持物，本发明的组合物可应用于一个节段的外面或者静脉移植的全部。合适的血管外支架组合物是本发明的血纤蛋白原制备物与凝血酶的组合物。所 述组合物可以是任何合适形式，液体或干燥形式。在一个实施方案中，例如如上所述的ー种干燥粉末组合物用作血管外支架。所述干燥粉末组合物在天然存在于血管壁外部的有限量的体液中聚合，从而形成血管外支架。用本发明的血管外支架组合物包被的静脉也是本发明的一部分。所述静脉可以是需要被保护以免于过度伸展或者需要支持的任何静脉，如静脉曲张。在一优选的实施方案中，所述静脉是静脉移植物。在一个实施方案中，所述组合物在将静脉移植物导入人或动物身体中之前应用。在另ー实施方案中，所述组合物在静脉移植物已经导入人或动物身体中之后应用。另ー方面，本发明涉及使用本发明的血纤蛋白原制备物作为药物。其可用于制备用于治疗急性出血性事件、血纤蛋白溶解亢进、血纤蛋白原缺乏症(获得性或先天性)或者其它出血性疾病的药物。在一个实施方案中，本发明的组合物用于在大出血部位减少出血的方法中。优选地，使用止血有效量的本发明的组合物。当用作局部止血剂时，可以实现止血时间(TTH)为大约10分钟或更少，大约5分钟或更少，或者大约3分钟或更少。在本发明中，TTH是至出血停止的时间。如果使用加压片(pressure sheet),则TTH的测量典型地从当将所述加压片应用于出血部位时开始直至敷料可视化使出血停止和/或观测到敷料内外无出血为止。另ー方面，本发明涉及制备本发明的血纤蛋白原制备物的方法。这种制备物可以使用本领域可利用的技术通过任何合适的方式制备。为了以经济可行的方式产生a-extFib，需要高表达水平的完整的功能性血纤蛋白原，及因此优选重组产生方式。在本发明中，当氨基酸序列含有由核苷酸序列编码的所有氨基酸时，任选地不含在正常细胞(分泌)加エ期间除去的氨基酸，此时血纤蛋白原或血纤蛋白原链是“完整形式”。因此，具有866或847个氨基酸的a -ext链是完整形式a -链的实例。血纤蛋白原的重组产生具有优于使用血浆衍生的材料的许多优势。这些优势包括其优选的安全性、产生没有任何其它血液污染物的变体的纯的均质制备物的可能性及无限制供应。此外，对于特殊应用(例如使用血纤蛋白原作为静脉内止血剤)，需要正确的翻译后修饰(例如糖基化)。因此，优选在真核生物、特别是在哺乳动物系统、更特别是在人系统中表达。在一优选的实施方案中，本发明的血纤蛋白原制备物通过包括如下步骤的方法制备
-提供包含核酸序列的表达载体，所述核酸序列编码血纤蛋白原的α-延伸的多肽链；-用所述表达载体转化真核细胞；-在使得编码血纤蛋白原的α-延伸的多肽链的核酸序列表达的条件下維持所述转化的真核细胞。真核宿主的表达载体为本领域已知，可以使用常规用于在真核细胞中表达的任何载体。表达载体典型地包含与被表达的核酸序列可操纵地连接的启动子及核糖体结合位点，聚腺苷酸化信号，转录终止序列，上游调节结构域及增强子。在一个实施方案中，使用在哺乳动物细胞如CHO或PER.C6 中表达的表达载体。这种载体为本领域已知，合适的实例包括 pcDNA3· I 质粒，GATEWAY (Invitrogen), pCMV/Bsd (Invitrogen), pFN 载体(Promega)及多种其它载体系统。在本发明中，“血纤蛋白原的α -延伸的多肽链”可以是指具有信号序列的866个 氨基酸的血纤蛋白原α链，或者是指不具有信号序列的多肽链，以及是指其通过遗传多态性或糖基化和磷酸化中的差异而产生的任何变体。合适的α延伸链氨基酸序列的实例在SEQ ID No. I中示出。术语“α链”和“ Aa链”在本发明文中可互換使用。本领域技术人员理解所述真核细胞必须也含有编码血纤蛋白原的β和Y链的核酸序列以能产生血纤蛋白原分子。从α、β和Υ链中重组产生血纤蛋白原先前已经描述，见例如 PCT/EP2009/058754、US 6，037, 457 或 W095/023868 所述。在本发明中，术语“β链”和“Ββ链”可互換使用。其是指β链的野生型及变体，有或没有信号序列。合适的血纤蛋白原β链氨基酸序列的实例在SEQ ID No. 2中示出。在本发明中，术语“gamma链”和“ Y链”可互換使用。其是指Y链的野生型及变体，有或没有信号序列。合适的血纤蛋白原Y链氨基酸序列的实例在SEQ ID No. 3和4中示出。优选地，编码血纤蛋白原链的核酸序列被优化。优化的核酸序列可以有效表达完整形式的重组血纤蛋白原。优选地，其被优化以在真核细胞培养系统中表达，如在COS细胞、BHK细胞、NSO细胞、Sp2/0细胞、CHO细胞、PER. C6细胞、HEK293细胞或昆虫细胞培养系统中表达。更优选地，其被优化以在哺乳动物细胞培养系统中表达。最优选地，所述核酸序列被优化以在人细胞培养系统中表达，如在PER. C6细胞或HEK293细胞培养系统中表达。优化的核苷酸序列可以是DNA或RNA。优选是cDNA。编码血纤蛋白原的α延伸的、β或Υ链的优化的核苷酸序列示出与其各自的非优化的对应序列具有至少70%相同性。在一个实施方案中，编码血纤蛋白原的a-ext Fib、Ββ和Y链的优化的核苷酸序列与其各自的非优化的序列示出70-80%相同性。优选地，编码血纤蛋白原的α延伸的、β或Y链的优化的核苷酸序列不含有顺式作用位点，如剪接位点和poly(A)信号。用于本发明方法中及编码血纤蛋白原α延伸的链的优化的核苷酸序列不含有在编码人血纤蛋白原α链的基因中正常存在的39个碱基对直接重复序列。所述重复序列必须被改变而不改变编码的蛋白质序列。在一优选的实施方案中，SEQ ID NO. 5所示优化的核苷酸序列或者这个序列的无信号序列的一部分(核苷酸60-2598)用于表达α延伸的链。
在另ー优选的实施方案中，SEQ ID NO. 6所示优化的核苷酸序列或者这个序列的无信号序列的一部分(核苷酸93-1473)用于表达β链。在另ー优选的实施方案中，SEQ ID NO. 7或8所示优化的核苷酸序列或者这个序列无信号序列的一部分(SEQ ID NO. 7的核苷酸51-1311及SEQID NO. 8的核苷酸51-1359)用于表达Y链。本发明的核酸序列可以编码任何类型的血纤蛋白原链。优选其编码哺乳动物血纤蛋白原链，更优选其编码灵长类动物血纤蛋白原链，最优选其编码人血纤蛋白原链。组合也是可能的，如一或两个哺乳动物 血纤蛋白原链组合两或ー个啮齿动物血纤蛋白原链。本发明方法的重组表达使得Fib420的表达水平与重组HMW Fib的表达水平相似。
图I :Western印迹分析。泳道I是含有血衆衍生的野生型血纤蛋白原(FIB3,Enzyme Research Laboratories)的对照组。泳道2含有克隆W115的培养上清，该克隆是表达a -ext rhFib的PER. C6克隆。分子量标记(MW)在左侧标示。图2 ROTEM分析。凝血时间、血凝块形成时间及血凝块坚固性通过ROTEM分析确定。左侧图示出在缓冲液中的血纤蛋白原制备物，右侧图示出与所述血纤蛋白原制备物I I混合的血浆。2A :缓冲液中血衆衍生的血纤蛋白原(Haemocomp lettan, CSLBenrmg, Marburg, bermanyノ ；2B :缓冲液中PER. C6衍生的重组HMW血纤蛋白原(α -625)；2C :缓冲液中PER. C6衍生的rhFib-ext血纤蛋白原(α -847)；2D 与血衆混合的血衆衍生的血纤蛋白原(Haemocomp lettan, CSLBenrmg, Marburg, bermanyノ ；2E :与血浆混合的PER. C6衍生的重组HMW血纤蛋白原(α -625)；2F :与血浆混合的PER. C6衍生的rhFib-ext血纤蛋白原(α -847)。图3 :该图示出加样来自纤溶酶降解的血浆衍生的材料的材料的Coomassie染色的蛋白质凝胶(ERL FIB3,上图；a-ext Fib,下图)。条件在凝胶上方标示；图中还示出保温时间(0、1、5、30、60和120分钟及ο/η(过夜))。在凝胶的右侧示出丽标记。
实施例实施例I :优化的cDNA构建体的制备编码a-ext Fib (Fib420)、B β和Y人血纤蛋白原多肽链的cDNA由GeneArt (Regensburg, Germany)以密码子优化形式合成(i)除去顺式作用位点(剪接位点，poly㈧信号)；(ii)修饰Aa链的重复序列；(iii)増加GC含量以延长mRNA半衰期；(iV)使密码子使用适合于CHO (密码子适应指数-CAI->0. 95)。将a -ext Fib (SEQ ID NO. 5)、B β (SEQ ID No. 6)和 Y (SEQ ID NO. 6)链的密码子优化的cDNA亚克隆进pcDNA3. I衍生物中。将Aa-延伸的链(Fib420)克隆进 pcDNA3. I (+)neo 中，B β 链克隆进 pcDNA3. I (+)hygro 中，Y 链克隆进 pcDNA3. I (-)hygro (Invitrogen, Carlsbad, USA)中。
实施例2 :表达重组人a -ext Fib的PER. C6细胞系产生重组人血纤蛋白原的PER. C6细胞系的产生与PCT/EP2009/058754所述相似。总的来说，将细胞在MAb培养基中悬浮培养，用AMAXA nucleofection装置(程序A-27)转染，及使用Nucleofector试剂盒T,其具有编码人血纤蛋白原蛋白的三条不同链(Aa -ext、Ββ和Y链)并含有优化的cDNA链(分别为SEQ ID no. 5, SEQ ID no. 6和SEQ ID no. 7)的三个载体。在转染和在96孔平板中铺板之后，转移325个克隆，在48孔平板中筛选。在扩增途径(expansion path)结束时,将24个克隆移至摇瓶中，选择其中8个在连续分批培养检测中进行稳定性和表达分析。分批培养产量与使用表达610或625个氨基酸形式的A α链的细胞系获得的产量相似，表明Aa链的延伸不削弱表达水平。这个结果最初未曾预料，因为血浆衍生的血纤蛋 白原与含有610/625Αα链的血纤蛋白原相比仅含有1_3%延伸的A α链。使用SDS-PAGE的蛋白质分析及Western印迹分析表明所述重组血纤蛋白原以完整形式产生，具有预期大小的α链(图I)。实施例3 :从PER. C6细胞培养基中纯化α -延伸的血纤蛋白原根据标准方法从细胞培养上清中纯化重组人α-延伸的血纤蛋白原。简而言之，将(MM)2SO4加入所述培养上清中至40%饱和度，通过离心收集沉淀。随后，将沉淀物在TMAE加样缓冲液(5mM Tris-HCl pH 8. 5，O. 01%Tween_20)中溶解，随后用相同缓冲液透析。然后将蛋白质溶液加样于Fractogel EMD TMAE (m) 40-90 μ m (3ml) (MerckKGaA, Darmstadt, Germany)离子交换柱上。随后使用在20个柱体积中0_1M NaCl连续盐梯度洗脱重组人α-延伸的血纤蛋白原。将在峰值部分的重组人血纤蛋白原通过加入(MM)2SO4至40%饱和度而再次沉淀，通过离心收集。最后，将所述材料在TBS(50mMTris-HCl, pH7. 4, IOOmM NaCl)中溶解，用TBS透析以除去任何残余的(NH4)2S04。实施例4 :ROTEM分析 使用ROTEM分析测量a-ext rhFib和血浆衍生的血纤蛋白原的凝血时间(CT)、血凝块形成时间(CFT)及血凝块坚固性。ROTEM (Pentapharm GmbH, Munich, Germany)代表Rotation ThromboElastoMetry。该技术利用一次性试管中浸没在(血液)样品中的旋转轴。在不同凝血条件下弹性(elasticity)的改变导致轴旋转的改变,这在凝血弹性描记图中观测到，反映出机械凝血參数(见例如Luddington R. J. (2005)Clin LabHaematol. 200527(2):81)。将集合的正常(柠檬酸盐)血浆与血浆衍生的血纤蛋白原(Haemocomplettan，CSLBehring GmbH, Marburg, Germany)或者 PER. C6 血纤蛋白原(HMW rhFib 或 a -ext rhFib)以1:1混合，均为在TBST(TBS+0. 001% Tween-20)中2mg/ml。也直接使用血纤蛋白原制备物(在TBST中2mg/ml)。加入CaCl2至终浓度为17mM(在血浆中测量)或I. 7mM(在缓冲液中測量)。为了开始凝集，加入α-凝血酶至终浓度为I IU/ml。缓冲液中或者与血浆
I I混合的血纤蛋白原制备物的ROTEM 分析图在图2中示出。A10、A20、CFT和MCF值(mm)在表I中示出。AlO和A20反映在加入α -凝血酶后10分钟和20分钟时血凝块的坚固性。CFT反映从凝血开始直至检测到20mm血凝块坚固性的时间。MCF反映最大血凝块坚固性。
结果表明缓冲液中a -ext rhFib的凝集产生比HMW rhFib (A10=4mm)观测到的结果更强的血凝块(A10=12mm)。血浆衍生的血纤蛋白原的AlO为15mm ;这种在缓冲液中较强的血凝块形成可以由共纯化的血液衍生的FXIII的活性解释，后者与血纤蛋白単体(部分)交联。在纯化的重组血纤蛋白原中，不存在FXIII，因此不会发生交联。这可以通过在稀释的血浆(其含有FXIII)中进行实验而补偿。在这种情况中，形成较强的血凝块。令人感兴趣地，在这种情况中，α-ext rhFib与HMW rhFib或者血衆衍生的Fib相比形成较强的血凝块并且更快速地形成，A20值分别为21、18和17mm 。表I
权利要求
1.血纤蛋白原制备物，其在ROTEM 凝血弾性描记法检测中在相似条件下具有低于血浆衍生的血纤蛋白原制备物的血凝块形成时间的血凝块形成时间。
2.权利要求I的血纤蛋白原制备物，其含有至少95%(w/w)的血纤蛋白原，且其中至少10%(w/w)的血纤蛋白原是Fib420形式。
3.权利要求I或2的血纤蛋白原制备物，其没有因子XIII。
4.包含权利要求1-3的血纤蛋白原制备物及药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
5.权利要求4的药物组合物，其中所述组合物适于促进组织粘附、改良伤ロ愈合或者适于静脉内给予。
6.权利要求4或5的药物组合物，其中所述药物组合物是血纤蛋白密封剂或者局部止血剂。
7.权利要求4-6的药物组合物，其进ー步包含凝血酶。
8.权利要求4-7的药物组合物，其是干燥形式。
9.权利要求1-3的血纤蛋白原制备物用作药物。
10.权利要求1-3的血纤蛋白原制备物或者权利要求4-8的药物组合物用于治疗急性出血性事件、血纤蛋白溶解亢进、血纤蛋白原缺陷或者其它出血性疾病的方法中。
11.权利要求1-3的血纤蛋白原制备物或者权利要求4-8的药物组合物在制备用于治疗急性出血性事件、血纤蛋白溶解亢进、血纤蛋白原缺陷或者其它出血性疾病的药物中的应用。
12.制备Fib420血纤蛋白原制备物的方法，所述方法包括 -提供包含编码血纤蛋白原的α-延伸的多肽链的核苷酸序列的表达载体； -用所述表达载体转化哺乳动物细胞； -在使得编码所述血纤蛋白原的α-延伸的多肽链的核苷酸序列表达的条件下維持所述哺乳动物细胞。
13.权利要求12的方法，其中所述编码血纤蛋白原的α-延伸的多肽链的核苷酸序列是优化的序列，优选是SEQ ID NO. 5所示的优化的序列。
14.权利要求12或13的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞，优选PER.C6细胞。
全文摘要
本发明涉及富含α-延伸的血纤蛋白原的血纤蛋白原制备物。包含这种制备物的组合物与基于HMW Fib的制备物相比示出改良的凝血性质，后者典型地不含有或仅含有少量α-延伸的血纤蛋白原。特别地，由α-延伸的血纤蛋白原产生的血凝块的形成时间和血凝块强度得以改良。此外，与血浆衍生的血纤蛋白原相比，α-延伸的血纤蛋白原的纤溶酶介导的降解降低。
文档编号A61K38/36GK102724995SQ201180005609
公开日2012年10月10日 申请日期2011年1月7日 优先权日2010年1月8日
发明者A·伯特, J·库普曼, J·格林伯格 申请人:普罗菲布瑞克斯公司