专利名称：抗纤连蛋白ed-b和白细胞介素12的抗体l19的融合蛋白的制作方法
抗纤连蛋白ED"B和白细旨素12的抗体L19的融合蛋白望*。本发明特别涉及用于治疗用途的IL12与抗体分子间的缀^，所述的 治疗用途询制病理性的血管生成，包拾治疗癌症及其它肿瘤、狄湿关节炎、 糖尿病'1^L网膜病、4^H目^肉退^^血管瘤。异二聚体细胞因子白细^t-12 (IL12)^t^细J^疫的关鍵^H林，具 有有效抗癌和^##活性[4-6]。它目前(2005年春幻jt^用于治疗癌^^传染 病的II期的临床，中测试。IL12主要怍用于T和NK细胞，刺激它们的活性 和干扰素-Y (IFN-Y)的分泌m。然而，正:4^牛多其它的细胞因子相同，重组 的人IL12的施用与严重毒l^f目关，甚錄1 Hg/ kg /Ail樹氐的剂量下[8， 9]， 卩J^了其作为抗癌药物的研发。向肿瘤5T^fe向递送IL12可以用于提髙细胞因子的治疗指数。 Lexigen的科学家已经描述了细胞因子例如IL2和IL12与免疫i^蛋白的融 合以特异l^Mte向细胞因子[17， 49-51]。然而，作为M明的发明人，我们相 信这样的途4贿局限性。我们意^f'j IgG"细胞因子l^^实际上是多功能蛋白 质，并且因此除了^^结绅细胞因子洽l^卜，这些基于IgG的融錯白质能 够激活4H^并且与Fc受糾目互作用。我们认为，il^IgG"细胞因子l:^的不 良特性，因为细胞因子可淑皮带到携带有Fc受体的细胞(例如巨噬细胞、嗜中 性白细齡天然^W另细胞附近，因而fJ^肿瘤把向并且引起非特异性的细艇 化。我们iMHU缺少Fc的^^^^会更理想,:HM单链Fv胁片段(scFv)，而不^4^免^li^蛋白。我们先前在癌症^^物模型体内已经证明了 ，通过#^编码鼠细胞因 子IL12("sclL12 ")的p40和p35亚基的单链多肽与人单链Fv抗体片段 L19 ("scFv(L19)")融合，能够J^M高IL12的治疗潜力。已经证明，ScFv(L19) 能够在癌症患者体内选棒I^Mt瘤把向[16]。 L19特异,合纤连蛋白同种型 B-FN1的ED"B结构域，其是4;0^斤周知的血管生^f封己[14， 25]。 EI^B是在 B-FN同种型内发现的91个^J^的额外结构域并iL在小鼠、大鼠、兔子、狗和人中是相同的。B-FN积f^E攻击性肺瘤和经历血管生成的其它组织内的新生血 管性结构，如增生期的子宫内膜和病理状况下的一些眼结构周围，但是在正常 的^AiE织内未检测到[1-3]。在小鼠体内，融^白sclL12-scFv(L19)^L出的治疗指数i^i4高于融合 至具有无关特异It的scFv的sclL12,以;^重组的鼠IL12。这些实聪，清楚地证 明了基于抗体的细胞因子融M白的潜力是用于改善IL12治疗潜力的途径 [15]。这些结果的治疗潜力是相当大的。由于多种原因，在肿瘤血管7jc平上IL12的耙向，例如使用L19是有治疗益 处的。第一，肺瘤新生血管比肿瘤细胞更易接近静务條药的治疗剂，这有助于 避免与实体肿瘤的隙间高刷目关的问题[io],第二，血管生成(新的^j6l管从已 存在的血管上的生影是多数攻击性執肿瘤的特征[ll]'将IL12乾向至新生 血管应当允许多种不同肿瘤类型的免疫治疗。第三，IL12显示出脉管生成活 性，i^i通过它的下^N^IP-10赋予的[12， 13]。我们已经广i^9f究了 sclL12-scFv(L19)的肿瘤乾向性能，以及已经融合 至另一微瘤细胞因子IL2的scFv(L19) (" scFv(L19)-IL2 ")的性能[18]。在 带有肿瘤的小鼠体内ScFv(L19)-IL2显示出优异的肿瘤乾向性能，静脉注射后 24小时肿瘤:血液与胂瘤器官之比高达30 : 1。相反，^目同的动物模型中 sclL12-scFv(L19)的肿瘤把向能力较弱，在24小时时肿瘤血液与肿瘤器官 之tbit常比10:l还差，并且具有録的肿瘤肝脏与胂瘤秋比[15],不过 与l:fe^白sclL12-scFv(HyHEL10)相比，这些乾向结果仍然是优异的，特异于 4^溶菌酶，鍵小鼠中缺乏^^特异性i^'J.已经证明了当通itA的IgE的CH4结构域使scFv (L19) 二聚化时，构皿 胁结构，杨为"小免疫蛋白"或SIP, scFv(L19)的肿瘤把向特性得到改善。 SIP(L19)的肺瘤把向棒性先前e^t描述[21〗。本发明基于这样的工作，作为发明人的我们比较了 IL12与scFv(L19)的三 种缀合物的肺瘤把向能力，每种具有不同形式的细胞因子和/或不同形式的抗 体，并JL^m过以特殊的方式^缀合物的形式能够改善sclL12-scFv (L19) 的肿瘤把向能力。我们测试的一种形狄sclL12-scFv(L19)，在图1A中说明。该缀^显 示出中度的肿瘤把向能力，与財絲中的发SeA""^的，另 一种形式是利用以上提到的二聚的SIP(L19)构建体创造 sclL12-SIP(L19)同型二聚体，在图1B中说明。然而，尽管J贿技樣明利用 SIP形式能够改善L19的肿瘤耙向特性,但是我们没有M^到该缀^的提高的 肿瘤摄取。另一种形U IL12 p40与p35亚基的杂二聚体，其中每个亚基融合至 scFv(L19),形成scFv(L19)-p35 / p40-scFv(L19)杂二聚体，如图1C说明的。 利用这样的异二聚体形式，我们得到了该缀合物的肿瘤才聂^^方面的明显的改善。因此，我们已经发现了新的抗体-IL12l:fe^白形式，由通过IL12的p40 和p35亚J^异二聚^M匕的两个scFv片段组成，保持了全部的IL12活性并皿 示出;W的胂瘤把向能力。这些结^TM的治疗学意义，用于改善IL12对肿瘤以; Ut病理'J4j6L管生 成的其它部位的乾向性，例如用于治疗M湿关节炎、糖尿病'1 网膜病、年 斜目^/L肉退^^血管瘤。本发明的用途^3U^伸到IL12与scFv(L19)的融合， 而JUr彭，J其它特异峰合成员和其它药物和物质间的4繊。例如，除了与IL12 亚基4繊的scFv(L19),可以用特异li结合成员，如对肿瘤相关^^、特异的其它 片段例如^^蛋白-C同种型构建缀^，并JL^)于肿瘤把向和癌症治疗。 更广泛的牵连还包括^t其它应用，涉及体内物质的把向，包4棘断方法以及 疾病及其它病理状况的预防和治疗，在Vh方面，本发明涉及新的缀*、生产它们的方法、编码该缀*或 其成分的核酸、含有该缀合物的药物组合物，以及该缀#在治疗方法中的应 用。在一个方面，本发明是包含具有第4第二亚基的蛋白的缀，，其中第 4第二亚基分别缀合于特异It^合成员上。该蛋白通常是二聚的，M的是异二聚的，并且典型地包含生物活性剂或 药物，通常为治疗或诊断剂。因此，该缀^通常具有以下形式[特异lt^合成员]-[第一亚基]-[第二亚基〗-[特异峰合成员] 特异^合成员通常是^^^"， to为单链Fv(scFv)。 ^E^发明中单链 Fv(scFv)^^衬是特别to的，原因在于它们的尺寸小，这提供了体内翻 该缀合物的生SJi^治疗上的优势，jHi^卜，scFv缺少Fc区域，潜^减少了抗独特'lit^并且樣小了 j傳活^^目关的不良特性以及与Fc受体的相互作用， 这些可能会PiUl肺瘤靶向性并且导致非特异性细胞活化。因此，缀合物的M的形U:[Scf v]—[第一亚基]-[第二亚基]—[Scf v]可选择地，特异)^合成员可以是单结构域旨，和/或M片段。以下更 详细itM笛述了特异峰合成员和^^f"。缀録可以是或可以包^li^白，即多肽，该多肽是#^产物，来自于 两个或多个基因或核酸编码序列l:k^入一^Hf放阅读框(ORF)的融^^。两个基 因或ORF的融合^Ji产物可以通itAfc接头(短的为2-20， M的为2-15，个氨 ^g^Jj^伸H腺在一个实施方案中，肽接头是6-絲序列GSADCG(SEQID NO: 15)。融錯白可以包^t号財列，通常位于特异麟合成员和亚基的上 游(5')。^^发明的缀#内，第一^第二亚M常是连接的，例如它们可以以共 ^h^接，例M过一个或多个"^傲蛋白可以絲聚的(例如二聚的，to的 为异二聚的)，并JLS聚体形式可以自然M生，以及缀*内的第一第二亚 基可以因此以它们的自然方式fetb^接。本发明因此允许在缀合物内^^)和保 持蛋白的自然形式。iii^了构建或^D药物的单敏体的^^r需要，以錄 大化缀*内##药物的4^活性的能力的，需要。jW^卜，亚基间的4^it it^许在寡聚物内第""^第二亚斜合(例如二聚化)允许方亏Jt^建和纟錄缀 絲，因此，第 第二亚基可以典型胁自缀合于特异性结合成员上，形成 一对通iti^S^合的特齐鹏合成员-亚錢建体(例如杂二聚体)。在一4S^ 的实施方案中，第一亚U1合于特异'I^合成员作为第一融錯白，并JL^二 亚J^^特异lt^合成员作为第^iU^白，优选的是，缀^具有的衬量为250 kDa或更小，更魅的是200 kDa、 150 kDa、 125 kDa、 120 kDa或115 kDa或更小(即Mr为或低于250 000、 200 000、 150 000 、 125 000、 120 000、或115 000)。这可以是实际测定的^i:(糖基 4t^者没有糖基似，或^^^于例:ft^^^^(有或，通常没有)^^l-4b^用的预 期M量的估计值。尺寸相对较小的缀^可提高它穿it^^只和到达目标位置 (例如血管生成、肿瘤或疾病的位X)的能力，因錄高了它的治疗功效并且减 少了所需剂量，然而仍然已实现缀^与把的多价(通常为二价)结合。通常，缀合物的使用目的来选择蛋白和特异性结合成员。在一^H^的实施方案中，蛋白是IL12。正如以上所讨辆，IL12适用于治疗癌症，抑制肿瘤生###，以;sj台疗病理'tiik管生^目关的其它病症。缀絲内一个或关的#^,例如位i^^生性生^V或血管生成的位置的才朽说合。！^卜M成分可以是赘生性生^/a管生成的才射己，因为"些过程期间细J^卜M被 重塑。一个实例是纤连蛋白的B-FN同种型，如上所说明的，其包含额外结构域 ED"B。本发明的特异性结合成员伏选特异地与纤连蛋白同种型B-FN的EI>_B结 合。特异鹏合成员可以具有包含L19的VHCDR1(SEQIDN0: 25)、 VHCDR2(SEQ ID NO: 26)和/或VH CDR3 (SEQ ID NO: 27)序列和/或L19的VL CDR1 (SEQ ID NO: 28)、 VL CDR2 (SEQ ID NO: 29)和/或VL CDR(SEQ ID NO: 30)序列的^J^序列。 例如，特异4錄合成员可以是scFv，財VH结构域，^MJ^列包含L19 的VH CDR1、 VH CDR2和/或VH CDR3，以及VL结构域，^tJ^列包含L19 的VL CDR1、 VL CDR2和/或VL CDR3。特异14#合成员可以包含VH结构域，其 ^KJ^序列与如SEQ ID NO: 22所示的L19 VH结构域的^tj^序列有至少60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或100%序列同一性，和/或包含VL结构域， ^tJ^列与如犯Q ID NO: 23所示的L19 VL结构域的^J^列有至少60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90°/。、 95%或100%序列同一性。M的特异It^合成 员是scFv(L19)，其包含L19VH结构域(SEQIDN0: 22)和L19 VL结构域(SEQ ID NO: 23)。在一^N^的实财案中，特异性结合成员是^T"tJ^列SEQID N0: 5(图10)的scFv(L19)。另一实例;I^JII:蛋白"C(TnC)，其以不同的同种型存在.在癌^i只内包^^额 外结构域的TnC》b^JE常^J只内的TnC 4itit/"泛，特别是包賴构域C的同 赠(cTN"C) [33]。因此，4^明的缀絲内特异鹏合成员可以特异地与癌 纟1^相关的4JH:蛋白"C同种型，特别是cTN-C结合.特异l!i^合成员可以是具 有如SEQ ID NO: 21 (图ll)所示序列的TN11 scFv[33]。在本发明的缀合物内特异性结合成员作为选择可以结合其它肿瘤相关抗 原，即在肿瘤釈免内(如在肿瘤细ilfcJi)》b^Jt常细自免内(如在非肿瘤细^Ji)經洲絲。通常，缀絲内两*异性结合成员是相同的，或者至少对于相同的靶、 絲錄赠是特异的。在本发明的特别优选的实施方案中，缀^包含已缀合于并且位于两个特异〖錄合成员，絲的是scFv(L19)间的人IL12异二聚体；其中 异二聚^^有第一 (通常是p40)亚絲第二 (通常是p35)亚基 第一或p40亚^^合于第一#异性结合成员作为第一融^1"白； 第4 p35亚J^合于第4异f^合成员作为第二l^f"白。 如上所述，第""^第二亚基典型^JW^接的，例如^^t^i接的。 ^i^，第一或p40亚基的N-^与特异^^合成员融合，即在融^白和编码它的核酸中亚基位于特异战合成员的上游。在该形式中，p40的N-末端可能因此是游离的(融合)，被认为i^:大化了它的活性。 &，第^^p35亚基的C-^与特异l^合成员融合，即在融M白和编码它的核酸中亚基位于特异性结合成员的下游。这可以增强融M白的表达，因为该特务勝合成员，特别是財上游N-絲信号肽，可以容易^4Jt并且因jtb^许l:^白的高^4ii。 I第一I^^白具有如SEQ ID NO: 1所示的p40-scFv(L19)的M酸序列。^i^L，第二il!^蛋白具有如SEQ IDNO: 2所示的scFv(L19)-p35的本发明的缀r^可以用任何可用的方法生产，如利用重组4支术，例如逸过 作为融^f"白^Ji^^的^或部分。例如，可以按照以下方法生产缀^b，其&^r:^Ji包含第一亚^^特异l^合成员的第一融M白； ^Ji包含第二iE^特异f錄合成员的第二融^I"白；以及将第一^第二錄m^"^。通常，该方法^^^J^^纯化笫"-^第^^^白质。 通常，表ii^含有编码l:^蛋白的核酸的宿主细胞内进行，例:W养的真 核细胞如冊K或CHO细胞，或细菌细胞如;^杆菌，因而^Ji可以^0l"养这 样的宿主细胞，如果第—第二ili^白勤目同的细胞(例如用编舰两种齡蛋白的核酸共转染的或含有该核酸的细胞内狄，sa^的异二聚^^寡聚化则可以在细胞内j^或者a细胞中純化融M白期间;^。在其它情况下，第一和第二融^白质可以被单独地(例如在不同的细胞内)絲，然后H^在一 起(组合)，从而第""^第二亚基异二聚^^者另外iiy^合。将亚基^^""^可以;^i动的或被动的过程。^^可以包括将第一第 二融^^白暴露于或置于第一和第二亚基能被偶^L-^的条件中(例如締合 或寡聚化/异二聚化)。4^1可以包括亚基间J^嫩的形成，或者另一^^键 的形成。^^如^^危鍵的形成可以在非还原的IHt下发生，并且因此4^:可以包括将第一第二融M白暴露于非i^^的IHt下。才^本发明表ii^^f"白和生产缀^的的^dt^法在以下的实例中被详细 胁出。作为另外的步骤，该方法可以包括将缀#配制到药物组合物中。逸逸常涉;sj^化缀^^并且将其与生理学可接受的载体组合'药物组^b在以下^Jt详细麵述。编码缀絲和它的部分(例如编码融妙白)的核^^杨^^发明的一 部分。在一个方面本发明;liH^，包含包^^码融合蛋白的核苷^列的第一核*于，其中融^白包^#异 '1±#合成员和第一蛋白质亚基和包^码融^^白的核苷^列的第4^^，其中融^白包^#异 -1±#合成员和第二蛋白质亚基。核^t可以,特务I^合成员和亚基间的肽接头，以致于在iH^f"白 中特异性结合成员与亚Ufit^接头相连接，可以被编码的M融合蛋白、亚 基、特异性结合成员械头4^文的其它地^^L^详细麟t在她的实施 方案中第-"^第二亚基分别是IL12异二聚体亚基(典型的是p40和p35亚勤， 并且m的特异鹏合成员是scFv，特别是scFv(L19),在一个实施方案中第 一核^^编^ SEQ ID NO: 1所示的IL12p40"ScFv(L19)的^J^序列和/ 或第4^^^^口 SEQ ID N0: 2所示的scFv (L19)-IL12p35的^J^序列。核^t可以是载体，例如是适于核苷辦列狄的质粒。因此，第4 第^fe^^可以^一和第二载体。通常，核苷酸序列可,'li^与调节元 ^ft^如用于转录的启动子连接，第4第ji^^^可以被包含在宿主细胞内，其可以;l^)核^^共转ii染的细M者这种细胞的后代。含有核*子的细|$^^^发明的一部分，特别是M细胞例如HEK和CH0细胞，或者细菌细胞例如;U^杆菌'核g达后，融^"白可以通itilL基4^^形^^发明的缀合物，如本文其 它地方所描述的。才娥本发明的缀合物可以用于治疗人或动物体的方法，如治疗患者(典型地 是人患者)的疾病或病症的方法(其可以包括预防性治疗)，包括对患者施用该缀 她用缀合物可治疗的病症包括癌症、其它肿瘤^^生性病症。缀#可以被 用于抑制血管生成并且因此治疗类风湿关节炎、糖尿病'制见网膜病、年斜目关 肌肉退化、血管瘤和肿瘤，包括癌症。治疗可以包鄉防性治疗。缀*也可 以在诊断方法，例如血管生成的靶向和诊断中施用，其可能与任何上述病斜目关。才娘缀"^内包賴蛋白治疗'liil诊断性试剂的自然'M以及特异性结合 成员的特异lt，也可以诊wr治疗其它的疾病和病症。因此，本发明的更进一步的方面提供的治疗方法，包M用本发明的缀合 物，包^1种缀*的药物组#，和这样的4^i物在用于治疗病M疾病的 药物生产中的应用，例如在制造药物或药物组合物的方法中的应用，包4封^] 生理学可接受的载^M形剂配制该缀，。才Mt本发明，提供的组絲可以向患者施用。to的是以"治疗有效量"施 用，i^A以显示对患者的好处。这样的好^bl^码可以改善至少一种症状。施用的实际量，以;sufe用的速率和时间过程将取决于所治疗病症的'M和严重程度。治疗的处方，例如剂量的确定等，在"fit^Jk^其它医生的职责范围内。 旨的适宜剂量^M^^/^的[26， 27]。4^发明的^^ ，包括那些含有^W^结^^构域的缀^b，可以通过 ^^适合施用的途^t需要治疗的患者祐用，通常通it^Ajk^p/或直接^A 被治疗的位置，例如肺瘤或肺瘤维管结构，准确的剂#它的施用频率取决于 许多因素，治疗的途径、^疗区域的位置和尺寸(例如肿瘤)、胁的确切性 质(例如scFv衬)，以及缀"^中含有的检测^i^其它衬的'l!Mt组*可以单4^用或与其它治疗相结合，^:，冶疗的病症同时M 连续g用。其它治疗可以包^fe用适合剂量的^緩解药物如非甾族的抗炎 药物(例如阿斯匹林、朴热息痛、布^^或酮^)iU^，J如吗啡，或抗催吐剂。因J^Mt本发明的、以及#^本发明使用的药物组*,除活性成分(缀合物)以外可以包含药学上可接受的赋形剂、栽体、緩冲剂、稳定剂或^4页域賴 技术人员所熟知的其它材料。这样的材料应该a豢的并且将不应干扰活性成 分的功效。载体或其它材料的确切仗贫取决于给药途径，其可口服，或通过注 射，例^#脉注射。为了静脉内注射，或在痛辨位的注射，活性成分将是胃 肠外可接受的水 形式，其是无热原的并且具有适宜的pH值、等渗)^^急定 性。在本发明的缀*中，蛋白通常包含重^t产的第"^第二多M基，亚 基可以被糖基化，并JLil^^基化的程度和M可以通过选棒菱宜的宿主细胞 綠制，在其中表纽基。蛋白可以包含生物活性剂，即影响给予该活性剂的 目标生物体的结构或功能。通常，蛋白包^断或治疗剂。例如，它可以包含 用#断、预防或治疗疾病或病理学病症的物质。蛋白可以包^^如用i^断的才^ieiy朽己试剂，在本发明的上下文中蛋白通常包舍治疗物质用于治疗或预 防病理学病症，特别是血管生成，例如癌#其它肿瘤、狄湿关节炎、糖尿病,船见网膜病、"W^目B肉退^^血管瘤的治疗。例如它可以包含毒素、酶^Jt疫^H^如细胞因子。蛋白可以A^然或重组白细^H"-12(IL12)。用于本发明的IL12可以来源于^^r动物，例如人、储动物(例如大鼠，小^)、马、奶牛、猪、绵羊、狗等等。在用于M人的缀合物中人的IL12是他逸的。IL12是作为由40 kDa (p40) 亚# 35 kDa (p35)亚^iBL^的天^"在的异二聚^^蛋白，亚基的实际^1:可 以有变化，例如当在不同的树中表达时，并JL^:于蛋白是否^t基化以及 糖基4bl^式。术语"p40 "和"p35"因此并不意pM该亚基分别M精确的40和 35 kDa ^t。反之，这些术iS^iM^定和区别IL12的这两种异二聚体亚基， 这可以根提它们的JU^列更准确地确定。异二聚体IL12包含第一第二多 綠基，*^别与人IL12的p40亚絲p35亚基同源i^目同.典型地，IL12 的第一錄包賴J(J^列与如SEQ ID NO: 3所示的人的ILH亚基p40的 ^J^序列有至少60%、 65% 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或100%序列同一 性。典型地，IL12的第二亚基包^^^J^序列与如SEQIDN0: 4所示的人的 IL12亚基p35的^J^序列有至少60 6、 65% 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或100°/。序列同一性。在本发明的缀^^中的IL121橫IL12的生物活性，例如 具有作为活化的T和M细胞的生长因子的能力，增强NK/淋巴因子激活的杀伤 细胞的溶解活性，通过使PMBC休目M'J激IFN-Y的产生，抑制血管生成(例々叇 过下i^HUP-10)，和/或抑制肿瘤生#/或#^多。特异^#合成员是一对^"元件，具有相互的结M异It。 一对特异的结 合成员可以K然来源的或完全或部分itk^成生产，该对W的一个元件在其 表面上具有区域，或空腔，它特异麟合至并因此互补于该对衬的另一元件 的特殊的立^^极'l^诚。因此该对元件具有;^^异f!i^合的特性。特异性结^^成员通常包^^具有^^结^i点的^"。例如，特异l^合成 员可以是^^衬或含有^^结^i点的非^^蛋白。^^、结合点可以通it4[29: 30， 31]或者i^蛋一白支架内的环上随M刚或突变^liJ^JJlt赋予 对期望乾的结^ft异It。蛋白中用于X^呈化新的结合点的支架已经被详细地综 述[31]。用于^^以物的蛋白支架已经被/>^[32],包辆蛋白质(^^^以 物)含有纤连蛋白类型III结构域,具有至少一个随^.可^-^或多种CDR i^v其中的适宜支架，例如一组HCDR，可以通it^疫球蛋白基因絲的^^T结 构,件提供。支架可以是人的或者非人的蛋白。非^^蛋白支架的优势在于在支架W内可以提供^^结^i点，该衬 至少比有些抗体分子小和/或易于生产。特异It^合成员小的尺寸可以赋予有用 的生理特性:WiA细胞，^fji且织^^者到达其它结构内的把点，或者结 合至目标4^^蛋白魏内的能力，非抗体蛋白支架内抗源结合点的使用综^[34]中。典型的是^稳定骨 架和一个或多个可变环的蛋白质，其中环或多个环的^J^列是特异的或者 随机突变的，来创造^^结棘点，其具有结合目标抗原的特异性。这样的蛋 白质^^妙色葡萄球菌(S. aureus)的蛋白A、铁^it蛋白、四连蛋白、纤连 蛋白(例如第10个纤连蛋白III型结构询和脂笼蛋白的IgG结^构域，其它 途径^#^成"微跳"(Selecore GmbH)，其以財衬内^6I;的环肽小蛋白 质为基础。^^主意，歸CDR能够^iL架如纤连蛋白或细胞色素B携带[29， 30， 31], 用于携带4^发明的CDR或-"^E CDR的结构他逸的是#的重#^^序列或者它们的实质部分，其中CDR或一组CDR位于自然JLt的由重排免疫球蛋白基因 编码的VH和VL M可变结构域的CDR或一组CDR的相应位置，免疫球蛋白可 变结构域的结构和位置可以参考Kabat等[35]及其更新来确定，#也可用国 际互联网(http : / / immuno.bme.nwu.edu或者利用任何搜索引擎搜索"Kabat ")。胁衬狄疫球蛋白，或者狄然的或者是部^k^完4^^处产的。 术语也涵盖^^r含有^^f、结^i点的多AUil蛋白。財可能，利用单克絲其它胁以及寸狄重组DM ^M^生产其它的淋 或嵌"子，仍##原始#的特异性。这样的技术可以涉及将编码M的免 疫球蛋白可变区或者CDRs的DM导入不同免疫球蛋白的恒定区、或恒定区加框 架区[37， 38， 39].产生抗体的杂^l或其它细胞可以经历遗传突变或者其它 改变，可以 或可以不改变所产生抗体的结^#异性。因为M能够用很多方式修饰，术语"^^^""应该被认为是涵盖了任何 具有所需特异性的^#^^结綠点的特异性结合成员或物质，因此，术语涵 盖了M片段以及衍生物，包^f封可含有^^f结^i点的多肽，无论K然的或者K全或部分合成的。因此也包括含有与另一多JlUi合的扭i^原结 *点，或等效物的嵌^^"。嵌合^的克1^^^1//^的[40， 41〗。跳Xif呈领域可用的更进一步的^^使得可以分离人的和人源^^,例 如，如先前所描述的能够制iiA的杂^1[36]。噬菌体展示，另一产生特异性 结合成员的确定净1^已经被详细描述[36， 42].小鼠^^基因M活并^1人的^^基因替换而且保留小！^它完整的免 疫系^^^转基因小鼠食,于分离人的M[43]。合成^^f"可以通it4^合成的并且插Ait宜的^Ji^体内的寡聚核苷 g因来创造[44， 45]。已録示，^h胁片段能够实现结合^^的功能。.由于其小的尺寸并且 最小^^与其它^^受体(例如Fc受体)相互作用，胁片段舰的;LML明 的缀合物'特别M的是单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构m过 肽M连接，允许两个结构^^^^^结合点[46, 47]。通iti^接VH和VL 结构域的^M^的掺入，scFv可以被稳定化[48〗，另^t小的^^结合M片^idAb(结构域^W，即^^重M^的可变区[28]。 VH dAb自然^A^^駝中(例如骆駝、美洲駝)并且可以用目标vR 原免疫骆駝，分离^f、特异的B细胞并且直接从单个的B细胞中克隆dAb基因 来生产。dAb也可以在细^l"养物中生产。它们的小尺寸，^的溶解度以及j显单个结构域的特异性结^^成员，特别^1单个结构域的M如dAb,可以用 于本发明中，并且可以从例如Do咖ntis、 Phylos、 Pieris和Aff ibody商业上 买到。^^结^f立点^子的"^分，其结合到并且互补于目标抗原的4^P或部 分。在:ii^衬中它被称为^^^结^f立点，并且包絲异艇合到和互补 于目标抗原的4^P或部分的^^部分。其中抗源很大时，M可以仅^it合到 抗原的特定部分，该部^f皮称为抗源^^位。抗/^^结合f立点可以通过一个或 多个^^可变结构^€供。 的，^^^结純点包含^^^可变区(VL) 和旨重^^T变区(VH)。术语"特异的"可以用于指一种情况，其中特异f^合酉。寸中的一个元件不 会显示出与它的特异性结合S沐(S)以外的任何分子的显著结合。术语^Lit用 于，例如^f、结^f立点对特殊的表位是特异的，许多^^、携带该表位，在该种 情况下携带有^^结合位点的特异性结合成员能够与携带该表位的不同抗原相 结合'L19 ^A的重组M，对纤连蛋白同种型B-FN的ED"B结构^1特异的。 这种^^它的序列ei4先1^"描述[20]。 L19的单链Fv也已被描述，并且优 ^k^A4^发明的缀絲内。ScFv (L19)是含有L19 VH结构# L19 VL结构域 的scFv，其中VH和VL通it^接头序列连接在一个多肽链中。VH结构域含有VH CDR1、 CDR2和CDR3序列，并且VL结构域含有VL CDR1 、 CDR2和CDR3序列，如 图IO所示，L19 CDR序列是VH CDR1 SFSMS SEQ ID NO: 25VH CDR2 SISGSSGTTYYADSVKG SEQ ID NO: 26VH CDR3 PFPYFDY SEQ ID NO: 27VL CDR1 RASQSVSSSFLA SEQ ID NO: 28VL CDR2 YASSRAT SEQ ID NO: 29VL CDR3 QQTGRIPPT SEQ ID NO: 30VH结构域可以具有如SEQ ID NO: 22所示的^J^序列，并且VL结构域 可以具有如SEQ ID NO: 23所示的^tj^f列(图10)。 VH和VL结构^常通 ita接头连接，如12个絲的絲SEQIDN0: 24(图10)。 to的，scFv(L19) 具有如SEQ ID NO: 5所示的^iJ^序列。
图1(A)显示的是sclL12-scFv(L19); (B)显示的是sclL12-SIP(L19)同型 二聚体；(C)显示的是p40"ScFv (L19) / scFv (L19)-p35异二聚体。图2(A)显示的是^ii原的和非还原条降下sclL12-scFv(L19)l:^蛋白的 SDS-PAGE分析；(B)显示的W然糾下显示为二聚体的sclL12-scFv (L19)融 ^"i"白的^^i;虑^^布。图3显示了用体内分布M"测定的sclL12-scFv(L19)体内乾向性。积累量 以(A)4和(B)24h后每ii且织的:;iA剂t/。表示(。/。n) / g)。 ^C^性的组织是(从 左Jj&):肿瘤、脾、肝脏、肺、心脏、肠、iL^和肾。图4(A)显示的是&原的和非i^f、务降下sclL14-SIP(L19)融M白的 SDS-PAGE分析；(B)显示的;1^然##下显示为二聚体的sclL14-scFv (L19)融 M白的^^^虑^^布。图5显示的^1体内分布" "测定的sclL12-SIP(L19)体内耙向性以及积 累量以(A)4和(B)24h后每克组织的注入剂i^表示WlD / g)。代^j法的纽3只是肿瘤、脾、肝脏、肺、心脏、肠、Jfi^肾' 图6(A)显示的是扭原的和非i^f、条件下p40-scFv(L19)/ scFv(U9)-p35融合蛋白的SDS-PAGE分析；(B)显示的是天然条件下显示为二聚体的 p40-scFv (L19) / scFv (L19) -p35 Isfe^白的^^i;應^^布。图7显示的;|^1体内分布" *测定的p4(HscFv (L19) / scFv (L19) -p35体内 把向性以》J 、累量以(A) 4和(B) 24h后"^iia织的注/^剂J^^^示(%ID / gh代 表性的^UR是(^iJ^):肿瘤、脾、肝脏、肺、心脏、肠、jfc^t和肾。图8显示了^liJ^列SBQ ID NO: 1。从N到C絲，序列含有(i) 信号败(ii) 人的IL12 p40亚基(SEQ ID恥3的虚线下划线所示的)；(iii) 肽絲卿ID NO: 15);(iv) scFv(L19) (SEQ ID NO: 5下划线所示的);和(v) myc;即信号肽-人p40-接头-L19iyc。在我们所^^的编>6 齡列中，myc标 签后接三*止密財。图9显示了^J^f列SEQ ID NO: 2。序列含有，从N到C賴(i) 信号眠(ii) scFv(L19) (SEQ ID NO: 5的下划线所示);(iii) 肽接头(SEQ ID NO: 15);(iv) 人的IL12 p35亚基(SEQ ID NO: 4的虚线下划线所示)；和(v) 6His-終；即信号肽-L19-接头-人p35-6xHis。在我们所使用的编g^列中， 六个组^^接三^Hf止密^f"。图10显示scFv(L19)的^J^列(SEQ ID NO: 5)。 VH和VL结构^^皮单 独显示(分别为SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 23)。在VH和VL结构域中CDR1 2 和3序列均为下划线所示。VH和VL结构m过12个残JJi接头序列分开，(SEQ ID NO: 24)。图11显示抗^Jt蛋白"C scFv TN 11的^J^列(SEQ ID NO: 21)。 本发明的方面和M实施方案将在以下^^I^^^Ni兌明。 实施例^^i!E我们描述IL12-L19缀M三种不同形式的生产和特征，证明^EjH^ 求的形式的体内把向m^^l!i。分别说明在图1 A、 B和C中的三种形式是sclL12-scFv(L19)、 sclL12-SIP (L19)同型二聚# p4(hscFv (L19) / scFv (L19)-p35异二聚体。描錄图1 A中的sclL12-scFv(L19)是sclL12和scFv(L19)的ili^白。 由于每^f"有单一scFv:^^结^:点，缀^因jtbi^^。图1 B描述的sclL12-SIP(L19)同型二聚^^是两种iH^白的同型二聚体， 每个融^f"白分别含有sclL12、 scFv(L19)和人IgE的CH4结构域，缀^^通过 两个CH4结构域间的二iMt^^接实^聚化，形成微M或SIP结构，由于每 个分子中存在两个scFv (L19)抗源结械泉，缀^的因此是二价的.图1 C中说明的p40"ScFv(L19)/ scFv(L19)—p35异二聚体是两个不同的融 ^白的异二聚体。第"nlfe^蛋白含有人IL12p40亚基，通过6个^J^的肽18接头GSADGG与scFv(L19)的N絲融合(SEQ ID NO: 15)。第二融^白含有 scFv (L19)，通过6个^J^的肽接头GSADGG与人IL12 p35亚基的N辆融合 (SEQIDN0: 15)。该两种融M白通过p40和p35亚基间的J^iiL^^接来实现 异二聚化，形^^异二^^体p40-scFv(L19)/ scFv(L19)-p35。由于每个衬存在 两个scFv (L19) ^f、结^^立点，该缀*是二价的。 没有FLAG标苍的sclL12-scFv (L19)因为先前描述[15]的原始融合蛋白使用C-末端FLAG标签来克隆(" sclL12-scFv(L19)-FLAG ")，我们应该考虑剖这样的可能l"生，含有酪狄的FLAG 标善可能使得在体内分布微中存在假象。当蛋白中的酪氨酸ifc^H射己时， FLAG标苍的溶剂暴露的酪#^也可以被>^匕。FUG标各可以后;JME体内蛋白水 解。为了^W究该I:^白的肺瘤乾向特性，我们克隆和M了没有FLAG #^的sclL12—scFv(L19)l:fe^白。sclL12-scFv (L19)的克1^表达以含有sclL12-scFv(L19)-FLAG[15]基因的pCH33载体作模板，扩增 sclL12-scFv(L19)的DNA片段。PCR^H^] sp40backEco引物(5 ' ccg gaattc atg tgt cct cag aag cta ace atc 3 ') (SEQ ID NO: 6)，其用p40的内源分 泌序列退火并且在它的5 '端添加核酸内切酶EcoRI限制性位点，以及 U9stopNotfor引物(5 ' ttt tcc ttt t gcggccgc cta tea tea ttt gat ttc cac ctt ggt ccc 3 0 (SEQ ID NO: 7)， sclL12-L19融妙白的3 '端添加三* 止密码子并^添加核酸内切酶Notl的限制性位点，并且因M失FLAG标签， 利用栽体的EcoRl和Notl限制性位点，将DM片^隆入哺乳动物细I^^U^ 体pcDNA3.1(+)栽体(Invitrogen, Basel,瑞士)内。用该载,染HEK 293细胞并^G418(500jig/ ml)存在下选g定的转 染子。通过ELISA法筛i^Ji^M"白的抗G418细胞克隆，^f捐Aif连蛋白的 重組ED"B结构域作为抗原。如先前e^述的[19， 20],利用^色i普法it^^ ;i^^l&^养基中^^l^"白并M4iC下过^t析MjL。 Isfe^白在-20"C 下以等^#可分量冷冻'在SDS-PAGE上在还原的和非i^M下以;M" Superdex S-200柱(Amersham Pharmacia Biotech) Ji^天然^Ht下通过FPLC 凝胶过滤分析sclL12-scFv(L19)融合蛋白的大小。与单体的原始 sclL12-scFv(L19)-FLAG l:l^白不同，大约三分之一的IL12—L19蛋白级^iiE明是二聚体。sclL12-scFv(L19)的^f^征用体内分布实^"测定没有FLAG标l的sclL12-scFv(L19)的体内乾向性。 因此用FPLC ^^过滤法过S叩erdex S-200柱纯化融^f"白的单^l分。级分 纯化后立即^^匕并且^A^携带鼠畸胎癌肺瘤的129SvEv免疫活性小鼠。注射4 和24小时后杀死小鼠，称重器官并且计I^W性。代表性器官和肺瘤内的积累 量以每克组织的;^^剂量的%4示(%10 / g)(图3)。 24小时后没有X!L^到在肿 瘤位置有积累。因jt诚们认为flag标各没有干扰体内分布结果。sclL12—SIP(L19)同型二聚体已经证明了当^ft助于人的IgE的CH4结构域将scFv(L19)二^^^，构成 微^^结构，也称为"小的免疫蛋白"或SIP， scFv(L19)的肿瘤乾向',得到改 善.SIP(U9)的肿瘤靶向特性先前已被描述[21]。因此，我们构建了 sclL12-SIP(L19)的同型二聚体，测试该形^i否也改善了 IL12对肿瘤的把向 性。我们构建sclL12 SIP(L19)融^S"白，通过将人的IgE免疫球蛋白的CH4 结构域l:fe^在sclL12-scFv (L19) -FLAG融合蛋白的c-末端[22]。 sclL12-L19-SIP同型二聚体的克隆和^J^将CH4结构域^^至sclL12-L19片段的c-末端是通过一轮PCR并且将PCR 片段插入已含CH4结构域的载体中来完成。从含有sclL12-scFv (L19)-FLAG基因的pCH33载体中扩增sclL12 scFv(L19) 片段[15]'改换限制性位点，^^引物sp40backHind(5' ccgta aagctt atg tgt cct cag aag cta acc atc 3 ') (SEQ ID NO: 8)，该引物在p40分泌序列的5 ' 端ii^并且将EcoRl更妙Hindill限制性位点，以及引物LWforAgelBsp(5 ' tgt ggg accggt ttt gat ttc cac ctt ggt ccc 3 0 (SEQ D NO: 9)，其在3 ' 端狄，除掉FLAG;^f且导入Agel限制性位点，提供BspEl的格l4^。 一^gj^接了 ， Agel / BspEl限制性位点与BspEl就;^#是可^|.这一步是必 需的因为sclL12序列含有BspEl限制性位点。现在使用核酸内切酶Hindlll 和BspEl将片^隆入Ci^有CH4结构域并在它的5 '絲含有BspEl P艮制性位 点的哺乳动物细胞pcDNA3.1 (+)^ii^体Ul〗。sclL12-SIP(L19)的转染、^ii^纯^^照以上所述的sclL12-scFv(L19)融M白的方法进行。也是在SDS-PAGE上在还原的和非iE^务降下以;ML Superdex S-200 ^Ji^天然糾下通过FPLC ^Mi^虑，分析IL12-SIP (L19)融 M白的大小(图4)。sclL12-SIP(L19)同型二^^的特征sclL12-SIP(L19)在第二步蛋白过S叩erdex S-200^^it^ii^^化并 且收集后立即辐射^f匕二聚体级分。标记蛋白注入携带F9鼠畸胎癌肺瘤的 129SvEv免疫活性小鼠。注射4和24小时后杀死小鼠，称重器官并且计lfc^ 性强度。^性器官和肿瘤内的积累量以每克组织的注入剂量的%表示(%10 / g)(图5)。尽管sclL12-SIP(L19)蛋白在BIAcore中显示出改善的ED~B结合活 性，但未淑Jl^到提高了肺瘤摄取并ilJt瘤摄取仍粉艮差。p40-scFv (L19) /scFv (L19) -p35异二聚体p40-scFv(L19)/ scFv(L19)-p35异二聚体由两个亚基组成。 一个含有 scFv(L19)片段，融合至IL12的p35亚基的N-末端(scFv(L19)-p35)。在第二个 中，IL12的p40亚Ui合至scFv(L19)的N—絲(p40-scFv(L19))。然后通过 p40和p35间的二石克键用融合蛋白质构建异二聚体p40-scFv(L19)/ scFv(L19)-p35。该异二聚体抗体-细胞因子融合蛋白缀合物在非糖基化时预计的大小为 114 kD。由于不同的糖基4^态和不同的糖基化方式，#^缀#所要在其中 ^Ji的物种不同，缀合物的M量可以有变化。,没有W^后的糖基化的DM 序列长度，融合蛋白质的理论大小是p40-U9为65 kDa， L19-p35为49 kDa以 及异二聚体p机19 / L19-p35为114 kDa,p40-scFv (L19) /scFv (L19) -p35的克lt^狄两个亚基p40-scFv(L19)和scFv(L19)-p35分别克隆入两个不同的载体， 第-Hv^有用于检测的myc标签以;S^^^有用于检测的his标签。组^^线含有编码sclL12-scFv(L19)-FLAG蛋白的基因的pCH33载体[15〗 和含有编码SIP(L19)片段的基因的pLB载体[21]作为模板，PCR生产 p40"ScFv(L19)inyc片段。朋pCH33作;^L^建含有p40"lp^l第一片段A, PCRA^MM第一引物HindSp40back(5 ' ccc aagctt atg tgt cct cag aag cta acc atc 3 0 (SEQ ID NO: 10)，该引物与IL12的p40亚基的分泌序列i^C并 在5 ';W引入核酸内切酶Hindlll限制性位点以朋第二引物Sp40HaLifor(5'acc tec ate age get tec gga teg gac cct gca gg 3 ') (SEQ ID NO: 1 1), 该引物与p40的3 '端退火,并添加1分接头(GSADGG)用于融合至第二片段B。 利用才飄pLB在两轮PCR中构建提供scFv(L19)部分的片段B， 4M第一引物 LinkLWback(5 , gga age get gat gga ggt gag gtg cag ctg ttg gag tc 3 ,)卿 ID NO: 12)，该引物与scFvL19的5 '末端退火并添加一lp分接头(GSADGG) (SEQ ID NO: 15)以;S^二引物LWmycstoBamfor (5 ' att cag ate etc ttc tga gat gag ttt ttg ttc ttt gat ttc cac ctt ggt ccc ttg 3 0 (SEQ ID NO: 13),该引 物与scFv(L19)的3 '端退火并且添加C-末端myc标签。该片段使用引物 LinkLWback和第三引物mycstoBamfor在第二轮PCR完成，第三引物 mycstoBamfor (5 ' cgc ggatcc eta tea tea att cag ate etc ttc tga gat gag ttt 3 0 (SEQ ID NO: 14)在片段B的5 '端添加3 >Hf止密码子和BamHl限制进行PCR，通耕性接头GSADGG将p40片^li合至胁片段scFv(L19)的N-末 端，产生片段p40"GSADGG"L19iyc。然后利用Hindlll和BamHl作为P艮制性位 点将该片^jt隆入哺乳动物^i^体pcDNA3.1+ / Hygro， ^^^潮霉素抗性用于 选择。用该载^^染CHO细胞并且用潮霉素选樹t、定的转染子(500ng/ ml)。 用ELISA法^^J重组体ED~B作为抗原筛选阳性克I^MM^J抗myc M用于检 测。扇Ji蛋白并iUtii^前描述[19， 20]的抗原亲和色镨法>^^|#^养基 中纯化，在4"C下透析过M盐。该l^"白在-20X:下以等^^可^i:冷冻， SDS PAGE大小分析显^H亥蛋白的大约5W为不同形式的^tJ^SiN^大约50% 的同型二^^[23]。^fei且^^^)相同的质粒pCH33和pLB作为模板PCR生产scFv (L19) -p35-Hi s 片段。与scFv(L19)部^j"应的第一片段C以pLB为^L^J建，，第一引物 EcoLonSL19back(5 ' ccg gaattc get tgt cga cca tgg get g 3 0 (SEQ ID NO: 16)，与scFvl-19的分泌序列i^并在它的5 '絲引入核酸内切酶EcoRl的限 制性位点以及第二引物L19HaLifor(5 ' acc tec ate age get tec ttt gat ttc cac ctt ggt ccc 3 0 (SEQ ID NO: 17)，与scFv(L19)的3 '端狄，引入一 部分接头(GSADGG)。含有P35部^第二片段D以pCH33为觀用两轮PCR构 建，^J l第一引物HaUp35back(5 ' gga age get gat gga ggt agg gtc att cca gtc tct gga 3 0 (SEQ ID NO: 18)，与稳定的p35亚基5 '端i^并在它的5 '末端添加"-^分接头(GSADGG)以^二引物p35hisfor (5 ' gtg atg gtg atg atg atg ggc gga get cag ata gcc 3 ') (SEQ ID NO: 19)，与p35亚基的3 '端退 火并添加his标签。在第二轮PCR将3个终止密码子和Notl P艮制性位点添加至 片段D的3'端，使用引物HaLip35back和第三引物p35hisstoNotlfor(5' ttt tec ttt t gcggccgc eta tea tea gtg atg gtg atg atg atg ggc 3 ,) (SEQ ID NO: 20)。雞将p35细胞因子亚絲过PCR融合至scFv(L19)片段的C一;M^， 组合使用引物 EcoLonSLWback 和 p35hisstoNotlfor 生产 L19 L19"GSADGG~p35-his。5 ^^f^I EcoRl和Notl限制性位点将该片^SjL隆入pcDNA 3.1哺乳动物表ii^体，提情霉素抗性。转染HEK 293细胞并JJD G418(500 jug/ ml)选糊!定的转染子。通过ELISA法筛錄iili錯白的拔l!i克隆转染 细胞，^^人的重组EDB作为^^和^i且^^胁用于检测。如前所述[19， 20] 通过亲和色语法过^^^细，#^养基中纯化融合蛋白，在4"下透析过夜 脱盐。SDS PAGE分析显示表ii^mil的并JU^^H玄蛋白是由轉、二聚#高 錄聚体城。然后同时用编码scFv(L19)-p35和p40"ScFv(L19)的两个载^^转染HEK 293细胞。用G418(500iag/ml)和潮霉素(500Mg/ml)选择含有两种l^蛋白的 稳定转染子。使用作为抗原的重组EDB和抗myc抗体以及:^L^^^，用ELISA 法筛i!4达两种融合蛋白的细胞。在第一步骤如先前描述[19， 20]利用亲和色 i普法过ED"B ^^^fc化l^蛋白质并且在4X:下透析过^jL。然后在第二步 骤中通过HisTrap HP 1 ml Ni2+柱(Amersham Biosciences)纯化该第一级分，洗 除没有被束绰于异二聚体(p40"ScFv(L19)/ scFv(L19)-p35)内的游离 p40-scFv(L19)片段，为了|&#，向蛋白中加入0.1%的-说80,然后以等^ ##蛋白冷冻于-80"' SDS PAGE分析显示，在非ii^条件下，该蛋白是两种糖基化状态的二聚体以;M^原状态下，该蛋白是两种不同大小的异源牟沐， 其中p40~L19单体呈现两种不同的糖基化状态。利用Superdex S-200 ;tii^行凝 胶it^,，证明该蛋白在自脉态下是纯的二聚体(图6)。 p40"ScFv(L19)/scFv(L19)-p35的^iE通过已^M匕的异二聚体蛋白的IL12活性判喊I:1^白是否JE^折叠和 IL-12洽hiitiiii行T细j^殖分析来判断[24],简言之，用^J1MJ!&^裂剂(植物血细舰集素(PHA)和IL-2)培糾眠的AJf周jk^[细胞(PBMC) 3天， 并且随后用融合蛋白或商业上可买到的、重组的、鼠的IL-12(R & D Systems Europe Ltd, Abingdon United Kingdom)的系列稀#"液作为标>1^养。|5|^用 [3H]胸腺^^^A测量增殖。用在Superdex S-200柱上FPLC皿过滤的已纯化的和放射'f4^典化的 p40—scFv(L19)/scFv(L19)-p35进行体内分布实验。才科2^白; iA携带F9鼠畸 胎癌肿瘤的129SvEv免疫活性小鼠。注射4和24小时后杀死小鼠，称重器官并 且计toW性。代^4性器官和肿瘤内的积累量以每克组织的注入剂量的%表示 (%ID / g)。我们^JU异二聚体形式，实现了在24小时的肿瘤摄取量几乎为 10% (图7)。参考文献所有引用的M文献特此引A^文作为参考。1. 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权利要求
1. 一种包含具有第一和第二亚基的异二聚体蛋白的缀合物，其中所述的第一和第二亚基各自缀合于单链Fv(scFv)，并且其中所述的异二聚体蛋白含有治疗或诊断剂。
2. 才娥;M'漆求1的缀合物,其中所述的第一亚^^合于scFv作为第一融 M白，而所述的第二亚^^合于scFv作为第二融^白。
3. 才N^U'J要求1或^5U'漆求2的缀合物，其中所述的异二聚体蛋白的第 卡第二亚糾ii^克键"M^接。
4. #^拟'漆求1至3的^-项的缀賴，其中所述的异二聚体蛋白是 IL12。
5. 才娥前述^"^'J^求的缀^的，其中所述的缀^具有250， 000或更 低的衬量'
6. 才N^K矛J^求5的缀*，其中所述的缀^;具有的衬量为150， 000 或更小。
7. 才^^M'J^求6的缀合物，其中所述的缀*具有的分子量为120， 000 或更小。
8. 才Nt前述^-^'J^求的缀^的，其中所述的两个scFv是相同的。
9. #*|jM'JJN^ 1至8的缀合物，包>^_合于并位于两个scFv之间的人的 IL12异二聚体；其中IL12异二聚^^r有第-"^第二亚^; 所述的第一亚^i^合于scFv作为第一融合蛋白；而 所述的第二亚J^合于scFv作为第二l:fc^白。
10. 才^l^;M'J^求9的缀*,其中所述的第一l:fe^白絲如SEQ ID NO: 1所示的^J^序列。
11. 才N^5U'J^求9或^'J^求10的缀^^，其中所述的第二l:^f"白具 有如SEQ ID NO: 2所示的^iJ^序列。
12. #4t |3u'JJN^ 1至9的fr"项的缀合物，其中一个或两个scFv特异地 结合于与赞生'1^ ^/#管生^目关的^卜^成分。
13. 根据拟'漆求12的缀#，其中该成分是纤连蛋白ED"B。
14. 才^^M'J^求13的缀*，其中该scFv是具有VH结构# VL结构域 的scFv(L19)，所述VH结构域包含SEQIDNO: 25、 SEQIDN0: 26和SEQIDNO: 27的^J^序列，所述VL结构域包含SEQ ID NO: 28、 SBQ ID NO NO : 29和 SEQ ID NO: 30的^l^^列。
15. 才^^WJ^求14的缀合物，其中scFv是具有如SEQ ID NO: 5所示的 ^Jj^列的scFv(L19)。
16. 才娘权矛澳求12的缀合物，其中该成分;IA腱蛋白"C同种型。
17. 根据;M'J要求16的缀合物，其中scFv是具有如SEQIDNO: 21所示的 ^J^^列的scFv(TN11)。
18. 生产^^;M'J^求4至17的任一项的缀#的方法，包括 表ii^ 第^^l^白质；和 将第-^第二亚基^^以形成异二聚体蛋白。
19. 才娥 M，J要求18的方法，包括在含有编码两种融^I"白的核酸的细胞 内^Ji^""^第二融^I"白'
20. 才^t^U'J^求18或W，J^求19的方法，更i^一步包:fe将所述的缀^^ 配制成药物组絲。
21. —种组*,包含含有编码融M白的核苷^/f列的第一核酸^，其中该融M白包含 scFv和异二聚体蛋白的第一亚基以及含有编码融合蛋白的核苷酸序列的第1酸分子，其中该融^白包含 scFv和异二聚体蛋白的第二亚基。
22. 推据^f'J^求21的组合物，其中scFv :ftwM'J^求12至17的^-~项中 所定义。
23. 才IUfjM'漆求21或^U'决求22的组*，其中所述的第一iia^是IL12 p40亚Jj^;S^斤述的第二亚基是IL12 p35亚基。
24. ;fm^，j^求21、 22或23的^-"项的组^，其中所述的第-^第二核^^U^""^第二栽体。
25. 一含有:iM5U'J^求21至24的^-项中所定义的第"""^笫J1^^^的宿主细胞。
26. "-^t药物组^，其包^WM'决求1至17的—项的缀^。
27. 根据权利要求1至17的任一项的缀合物，其用于通过疗法治疗人氛动物。
28. 根据权利要求10至17的任一项的缀在制造用于抑制患者中血管生成和赘生性生长的药物中的应用。
29. 根据权利要求28的应用，其中所述药物用于治疗肿瘤、类风湿关节炎、 糖尿病性视网膜病、年龄相关肌肉退化或血管瘤。
30. —种抑制患者体内赘生性生絲/或血管生成的方法，包括对患者施用根据权利要求10至17的任一项的缀合物。
31. 根据权利要求30的方法，包通过抑制血管生成来治疗肿瘤、类风湿 关节炎、糖尿病性视网膜病、年龄相关肌肉退化或血管瘤。
全文摘要
用于将治疗或诊断剂或药物靶向至体内细胞或组织，例如赘生性生长或血管生成的缀合物。缀合物在体内诊断或治疗上的应用例如抑制肿瘤生长或转移，抑制血管生成和/或治疗癌症。缀合物包含为寡聚蛋白质例如异二聚体蛋白形式的治疗或诊断剂，其中蛋白的第一和第二亚基各自缀合于特异性结合成员例如抗体片段如scFv。寡聚物的亚基可以缀合于特异性结合成员作为融合蛋白。缀合物可以包含具有两个亚基的IL-12异二聚体，每个亚基与scFv L19或TN11融合，以将IL 12靶向至与赘生性生长和血管生成相关的胞外基质成分。
文档编号A61P19/02GK101258162SQ200680015804
公开日2008年9月3日 申请日期2006年5月3日 优先权日2005年5月11日
发明者C·哈林, D·尼里, V·加弗纳 申请人:菲罗根股份公司