专利名称：人细胞纤连蛋白的外用药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种人细胞纤连蛋白(Human Cellular Fibronectin)的外用药物组合物及其制备方法。更具体地说，本发明涉及一种人细胞纤连蛋白和/或其片断为活性成分，与外用基质组成的组合物。本发明的外用药物组合物局部使用治疗各种皮肤损伤、创伤及溃疡；烧烫伤、美容；用于癌症切除手术后的伤面；治疗角膜炎、宫颈炎等上皮损伤性疾病。
背景技术：
纤连蛋白(Fibronectin，FN)是脊椎动物体内的一类具有多种生物学功能的大分子糖蛋白。纤连蛋白主要有两种类型，即血浆纤连蛋白(Plasm Fibronectin，pFN)和细胞纤连蛋白(Cellular Fibronectin，cFN)。两类纤连蛋白的分布、分子结构和生物学功能有明显的不同。
血浆纤连蛋白是由两条多肽链组成的二聚体，以可溶型存在于血浆、羊水、精液、脑脊液等体液中。细胞纤连蛋白由二聚体或多聚体组成，以不溶型的微纤维丝或无定形结构存在于细胞表面、细胞外基质或基底膜中。
血浆纤连蛋白的分子结构中不含EDA、EDB的结构域，其二聚体中只有一个亚基含有可变区IIICS。细胞纤连蛋的分子结构中含有数量不同的EDA和/或EDB结构域，其所有亚基都含有可变区IIICS。
血浆纤连蛋白具有调理素作用，化学趋动作用，参与止血过程，促进伤口愈合，与细胞的分化和肿瘤有关。细胞纤连蛋具有粘附能力，维持细胞正常结构，参与细胞运动，促进细胞分裂，在胚胎发育、肿瘤发生和转移以及创伤修复等病理生理过程中起重要作用。
目前，人们只是从动物血液如牛血或人血中提取获得血浆纤连蛋白进行研究，特别是用于治疗烧伤、创伤(Grinnel F.J cell Biol，1984；26107)、角膜炎、宫颈炎等(NishidaT，etal.Arch ophthalmol，1984，102455)疾病有显著疗效。还发现肿瘤的复发和转移与纤连蛋白密切有关，有试验表明纤连蛋白和/或片断有明显的抗癌作用(Yi M，Proc NatlAcad Sci USA；2001，98(2)620)。
但是，血浆纤连蛋白作为一种血液制品，它可能携带病毒或污染物，如牛血的疯牛病病毒，人血的的乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等。因此，用血浆纤连蛋白治疗疾病有极大的不安全因素，同时也受到资源的局限。这成为血浆纤连蛋白难以广泛使用的主要障碍。
从动物组织中提取细胞纤连蛋白更为困难。因此，长期以来细胞纤连蛋白的研究和应用更难进行。随着生物技术的发展，人们能够通过分离人体细胞，并进行人工培养，经提取、纯化制备人细胞纤连蛋白。它不仅能大量制备，不受资源限制；而且更重要的是避免血源性传染病的发生，并且应用临床有更好的同源性。
人细胞纤连蛋白作为一种活性蛋白在常温下是不稳定的，特别是在含水的介质中更容易变性或降解，而使得其生物活性丧失。为了开展人细胞纤连蛋白的研究和应用，特别是能够满足临床有关适应症的应用要求，非常需要一种适宜的剂型。这种剂型不仅要求稳定性好、能长期贮藏、使用方便，而且能充分显示出生物活性。
发明内容
本发明的目的在于提供人细胞纤连蛋白的外用剂型，适宜在临床上用于治疗各种皮肤损伤、创伤及溃疡；烧烫伤、美容；用于癌症切除手术后的伤面；治疗角膜炎、宫颈炎等上皮损伤性疾病。
本发明人进行了大量的研究，筛选出外用剂型，制剂的配方和制备工艺，不仅满足了上述适应症在治疗中的应用，而且稳定性好、能长期贮藏、使用方便，并显示出良好的疗效。由此，完成了本发明。
本发明涉及一种外用药物组合物，它包含人细胞纤连蛋白和/或其片断作为活性成分与外用基质组成的药物组合物。
本发明的外用药物组合物的形式包括溶液剂、喷雾剂、洗剂、搽剂、甘油剂、糊剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜剂、膜剂。
在临床上用于治疗皮肤损伤、创伤、溃疡、烧烫伤时配制成喷雾剂更为适宜，它不仅使人细胞纤连蛋白均匀分布在损伤区，而且对损伤区不会因摩擦涂抹造成物理刺激。喷雾剂型也适应于外科手术切除癌症组织后在伤口处使用，既有止血、促进伤口愈合的作用，又可抑制癌症的术后复发。
本发明中的活性成分人细胞纤连蛋白，它包含人细胞纤连蛋白和/或其片断。人细胞纤连蛋白为有2个或2个以上的多肽链组成的完整分子；人细胞纤连蛋白的片断为完整分子的降解片断，它包含有活性结构域，同样具有生物学功能。
本发明中的人细胞纤连蛋白和/或片断是通过人细胞的培养、分离提取、精制获得的。在组合物中的含量以制剂的总重计在0.001mg/g至10mg/g范围内，优选的含量以制剂的总重计在0.1mg/g至2mg/g范围内。
本发明中的外用基质包含水凝胶、缓冲剂、等渗剂、防腐剂和溶剂。
本发明中的水凝胶包含有聚羧乙烯(卡波姆)、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸树脂、纤维素及其衍生物、帕洛沙姆。
本发明中的缓冲剂包含有磷酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂、Tris-HCL缓冲剂，在组合物中维持PH在4至9的范围，优选为6至8的范围。
本发明中的等渗剂包含有氯化钠。
本发明中的防腐剂包含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、青霉素、链霉素。
本发明中的溶剂包含有水、甘油、丙二醇、乙醇。
本发明中的所使用的各种水凝胶、缓冲剂、等渗剂、防腐剂和溶剂的用量，依据制备的剂型需要，按常规用量配制。
本发明外用药物组合物的制备方法如下(1)制备人细胞纤连蛋白冻干粉剂将氯化钠和缓冲剂溶解于适量的注射用水中，并与人细胞纤连蛋白和/或片断溶液混合，然后分装成每瓶含量为规定量的人细胞纤连蛋白，经真空冷冻干燥制成无菌冻干粉剂。
(2)制备外用基质将防腐剂和/或水凝胶用溶剂溶解或溶胀，分装制成规定量的无菌溶液或半固体基质。
(3)使用前的贮藏人细胞纤连蛋白冻干粉剂在低温-10℃～-20℃下冷藏，有效期为2年。外用基质在低温-10℃～-20℃下或室温贮藏，有效期为2年。
(4)使用的配制将人细胞纤连蛋白冻干粉剂与注射用水或外用基质混合，配制成所需要的剂型。现用现配，或配制后在短期内冷藏使用。
具体实施例方式
以下实施实例进一步说明本发明。但是，应当理解本发明不以任何方式限于这些实例。
实施例1人细胞纤连蛋白冻干粉剂的制备人细胞纤连蛋白 0.1g氯化钠 0.88g磷酸氢钠 0.14g20％磷酸 适量注射用水 适量总量 100g将氯化钠，磷酸氢钠溶解于适量注射用水中，用20％磷酸调节溶液PH后，将其灭菌，并与人细胞纤连蛋白在注射用水中经过滤和灭菌的溶液混合，得到100g溶液。然后分装于灭菌的小瓶中，每瓶分装1g，经真空冷冻干燥成干粉，密封，即得人细胞纤连蛋白冻干粉剂。该冻干粉剂，每瓶中人细胞纤连蛋白的含量为1mg，在-10℃～-20℃的温度冷藏保存，有效期为2年。
实施例2人细胞纤连蛋白冻干粉剂的使用配制将注射用水2ml注入含量为1mg的人细胞纤连蛋白冻干粉剂小瓶中，轻轻振摇使溶解，呈无肉眼可见不溶物的透明溶液，即得到浓度为0.5mg/ml的溶液剂。依据临床需要将上述溶液的一定量喷雾或滴涂到使用部位。该溶液可一次性用完，也可在低温下冷藏一个月内使用。
实施例3液体基质的制备卡波姆9400.08g氢氧化钠 适量注射用水 适量总量 100g将卡波姆940加入适量的注射用水中，充分溶胀，用氢氧化钠调节溶液的PH后，分装小瓶，每瓶2ml，密封，灭菌，即得液体基质。液体基质在室温下贮藏，有效期为2年。
使用时将液体基质2ml注入含量为1mg的人细胞纤连蛋白冻干粉剂小瓶中，轻轻振摇使溶解，呈无肉眼可见不溶物的透明溶液，即得到浓度为0.5mg/ml的溶液剂。依据临床需要将上述溶液的一定量喷雾或滴涂到使用部位。该溶液可一次性用完，也可在低温下冷藏一个月内使用。
实施例4凝胶剂基质的制备卡波姆940 1g丙二醇 20g对羟基苯甲酸甲酯0.2g三乙醇胺适量注射用水适量总量100g将对羟基苯甲酸甲酯溶解于适量的注射用水中，加入卡波姆940使充分溶胀，加入丙二醇，再搅拌下缓缓加入三乙醇胺并调节PH后，即得粘稠状的凝胶剂基质100g。然后分装小瓶，每瓶4g，密封，灭菌。凝胶剂基质在室温下贮藏，有效期为2年。
使用时将凝胶剂基质4g注入含量为1mg的人细胞纤连蛋白冻干粉剂小瓶中，轻轻振摇使溶解，即得到浓度为0.25mg/g的凝胶剂。依据临床需要将上述凝胶剂的一定量涂抹到使用部位。该凝胶剂可一次性用完，也可在低温下冷藏一个月内使用。
实施例5涂膜剂基质的制备聚乙烯吡咯烷酮 5.5g甘油5g对羟基苯甲酸甲酯0.2g注射用水适量总量100g将对羟基苯甲酸甲酯溶解于适量的注射用水中，加入聚乙烯吡咯烷酮使充分溶胀，加入甘油，即得涂膜剂基质100g。然后分装小瓶，每瓶5g，密封，灭菌。涂膜剂基质在室温下贮藏，有效期为2年。
使用时将涂膜剂基质5g注入含量为1mg的人细胞纤连蛋白冻干粉剂小瓶中，轻轻振摇使溶解，即得到浓度为0.2mg/g的涂膜剂。依据临床需要将上述涂膜剂的一定量涂抹到使用部位。该涂膜剂可一次性用完，也可在低温下冷藏一个月内使用。
实验人细胞纤连蛋白对豚鼠伤口促愈合作用的研究取荷兰种豚鼠40只，体重200～250g，雌雄各半，随机分为2组，即试验组20只，对照组20只。在动物腹部脱毛，用手术刀造成长5cm的伤口，用镊子分开伤口，可见腹腔内容物。试验组动物的伤口用人细胞纤连蛋白溶液喷雾0.5ml(内含人细胞纤连蛋白0.25mg)，常规缝合皮肤，纱布包扎伤口，连续3天喷雾给药。对照组动物的伤口用无菌生理盐水溶液喷雾0.5ml，其他操作与试验组相同。连续15天观察伤口部位的变化并判定疗效。伤口10天内愈合且不感染的为显效；15天愈合且不感染的为有效；15天未愈合或伤口感染的为无效。结果如下表表 人细胞纤连蛋白对豚鼠伤口促愈合作用的试验
试验结果表明对照组的显效率为25％，试验组的显效率为60％，两组有明显的统计学差异(P＜0.01)。对照组总有效率为65％，试验组的总有效率为95％，两组有统计学差异(P＜0.05)。观察感染情况，对照组有4只动物感染，试验组无一感染。两组愈合后伤口组织光学镜检结果表明对照组在新生上皮下，有一薄层的纤维组织排列紊乱，有大量炎性细胞(以中性白细胞为主)和少量的巨噬细胞；试验组在新生上皮下，有较厚层的纤维组织，平行排列，毛细血管丰富，有大量炎性细胞，巨噬细胞较多等。统计伤口愈合时间，试验组为9.85±3.12天，对照组为12.85±3.71天。
结果证实本发明药物组合物外用手术伤口，具有明显的促进伤口愈合，减少感染，抑制病变的疗效。试验中未见任何不良反应发生。
权利要求
1.一种外用药物组合物，其特征在于所述的外用药物组合物包含以人细胞纤连蛋白和/或片断为活性成分和外用基质组成。
2.按照权利要求1所述的外用药物组合物，其特征在于所述的药物组合物形式包括溶液剂、喷雾剂、洗剂、搽剂、甘油剂、糊剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜剂、膜剂。
3.按照权利要求1和2所述的外用药物组合物，其特征在于所述的药物组合物形式为喷雾剂。
4.按照权利要求1所述的外用药物组合物，其特征在于所述的外用药物组合物的活性成分人细胞纤连蛋白和/或片断是通过人细胞培养的方法，经提取、精制获得的。
5.按照权利要求1所述的外用药物组合物，其特征在于所述的外用组合的活性成分人细胞纤连蛋白和/或片断的含量以制剂的总重计在0.001mg/g至10mg/g范围内。
6.按照权利要求1和5所述的外用药物组合物，其特征在于所述的外用组合的活性成分人细胞纤连蛋白和/或片断的含量以制剂的总重计在0.1mg/g至2mg/g范围内。
7.按照权利要求1所述的外用药物组合物，其特征在于所述的外用基质包含水凝胶、缓冲剂、等渗剂、防腐剂和溶剂。
8.按照权利要求1所述的外用药物组合物，其特征在于所述的药物组合物分别以两种形式长期贮藏，即含有人细胞纤连蛋白的冻干粉剂和基质。
9.按照权利要求1和8所述的外用药物组合物，其特征在于所述的药物组合物分别以两种形式长期贮藏，使用时将人细胞纤连蛋白冻干粉剂和注射用水或基质混合，现用现配，或配制后短期冷藏使用。
全文摘要
本发明外用药物组合物，是以细胞培养方法制备的人细胞纤连蛋白和/或片断为活性成分，与外用基质配制成的。本发明的外用药物组合物局部使用治疗各种皮肤损伤、创伤及溃疡；烧烫伤、美容；用于癌症切除手术后的伤面；治疗角膜炎、宫颈炎等上皮损伤性疾病。
文档编号A61P17/00GK1762488SQ200510018079
公开日2006年4月26日 申请日期2005年10月8日 优先权日2005年10月8日
发明者张怡, 于 玲, 陈小兰, 金城, 张若飞 申请人:张怡