专利名称：螠蛏共附生菌株抑菌活性蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌活性蛋白的制备方法，特别是一种操作简单、成本低廉的螆 蛏共附生菌株抑菌活性蛋白的制备方法。
背景技术：
螆蛏constricta Iamarck)俗名蛏子、青子、竹蚶、海蛏，隶属于 软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(LameUibranchia)、真瓣鳃目(Eulamellibranchia)、蛏科 (Wmrellidae)，是我国与日本特有的种类，也是100多年来我国沿海养殖的重要贝类之 一。螆蛏肉味鲜美，营养丰富，蛋白质含量5.5%，脂肪0.8%，糖1.8%和无机盐1. 1%。螆蛏 的软体部还有补虚的作用，对阴虚、血虚效果最佳，产后、病后多用之。近年来，海洋贝类的 研究已引起人们极大重视，海洋贝类中所具有的多种生物活性肽、多糖、不饱和脂肪酸等已 成为海洋保健食品和功能食品的重要原材料，如Bordenave等将太平洋牡蛎(Crassostrea gi gas )用胃蛋白酶水解，得到具有抑制ACE能力的水解产物；文蛤(Meretriχ meretriχ (Linnaeus))多糖对不同剂量的环磷酰胺(CTX)引起的迟发型超敏反应(DTH)有双向调节 功能等。但是，目前关于螆蛏的研究多集中在干制品加工及营养成分分析方面，对其生物活 性的研究甚少，螆蛏的共附生菌株及其代谢产物没有得到充分利用，产品品种单调，在一定 程度上限制了螆蛏养殖业的发展。
发明内容
本发明是为了解决现有技术存在的上述技术问题，提供一种操作简单、成本低廉 的螆蛏共附生菌株抑菌活性蛋白的制备方法。本发明的技术解决方案是一种螆蛏共附生菌株抑菌活性蛋白的制备方法，其特 征在于依次按如下步骤进行
a.取干净、新鲜的螆蛏肉研磨后，将200mL研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养 基上，37 °C恒温培养2天；
b.挑取单菌落反复划线培养至纯菌株，用滤纸片法检测纯菌株的抑菌活性；
c.取抑菌圈直径大于或等于10mm的菌株，在用葡萄糖做碳源pH5的沙氏液体培养基 中35°C培养120 h ；
d.4000r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为90%，4°C 静置过夜，10000 r/min离心30 min，将沉淀用PBS缓冲液溶解后，再用分子截留量3500道 尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥。本发明操作简单、成本低廉，从螆蛏共附生菌株的发酵液中所提取的抑菌活性蛋 白抑菌活性强，有较好的清除超氧阴离子活性，并对海虾无节幼体具有一定毒性，可应用于 抗肿瘤药品、生物农药和食品保鲜、防腐剂和化妆品的添加剂等方面，具有产业价值。
具体实施例方式
本发明实施例按如下步骤进行a.取新鲜的螆蛏，用无菌水清洗5遍后，将螆蛏肉充分研磨制成螆蛏肉研磨液，将200 mL研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，37°C恒温培养2天。b.挑取单菌落反复划线培养至纯菌种，用滤纸片法检测纯菌株的抑菌活性 将大肠杆菌Escherichia coli (EC)、变形杆菌Proteus vulgaris (PV)、金黄色葡萄球
菌 Staphylococcus aureus (SA)、产气杆菌 Enterobacter aerogenes (EA)禾口枯草芽抱杆 菌Bacillus subtilis (BS)分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，振荡培养M h作指 示菌，上述菌种均可购自上海坤肯生物化工有限公司。分别用移液枪取指示菌液IOOyL于牛肉膏蛋白胨固体培养基，用无菌三角涂棒 涂抹均勻，然后将牛肉膏蛋白胨固体培养基平板分成六个区，每个区分别放入一张滤纸片， 再分别用移液枪移取螆蛏共附纯菌株沙氏培养基的发酵产物样品10 μ L滴入滤纸片中央， 置于37 ！培养箱中培养。每个处理做3次重复，阳性对照为75%酒精，阴性对照为无菌水。 三天后观察指示菌的生长情况，测定抑菌圈的直径大小。结果表明所有菌株发酵产物对 指示菌基本都具备抑菌作用，尤其对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和变形杆菌、大肠杆菌 的抑菌效果非常显著。c.取抑菌圈直径大于或等于10 mm的菌株，在用葡萄糖做碳源ρΗ5的沙氏液体培 养基中35°C培养120 h ；
d. 4000r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为90%，4°C 静置过夜，10000 r/min离心30 min，将沉淀用PBS缓冲液溶解后，再用分子截留量3500道 尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥。对所得冻干品进行聚丙烯凝胶电泳，结果表明冷冻干燥的透析袋中物为抑菌活 性蛋白质。实验及结果
1.抑制植物病原菌活性的检测在无菌条件下，用移液枪移取螆蛏共附生纯菌株发酵 液1.5 mL,加入到冷却至40°C左右的沙氏培养基中摇勻，使其最终体积为15 ml,凝固后 分别用孔径为0. 8cm的打孔器取菌落边缘生长旺盛的植物病原菌菌饼接种到含有发酵液 的沙氏培养基平板上，每个培养皿接种1个菌饼，每种植物病原菌3个重复。以空白沙氏 培养基加入到培养基作为对照，置于27 ！的恒温培养箱内培养。培养7 d后，拍照、测 量直径，方法是按照十字交叉测量2次，以其平均值代表菌落直径的大小。根据抑制率的 计算公式如下纯生长量=菌落平均直径-菌饼直径，抑制率=(对照纯生长量-处理纯 生长量)/对照纯生长量进行计算。结果表明本发明中实施离中所得菌株的发酵液对于棉 花枯萎、禾古镰刀菌、串珠镰刀菌、毛霉菌、辣椒青枯、番茄灰霉、玉米早役抑制率接近100% ； 对于苹果粉红、瓜类枯萎的抑制率达到87% ；对雪霉叶枯的抑制率达到31%，上述菌种均可 购自上海坤肯生物化工有限公司。由此可见，螆蛏共附生纯菌株具有很强的抑制植物病原 菌活性，其活性蛋白可作为粉剂或液体制剂用于生物农药的制备。2.温度敏感性的测定将螆蛏共附生纯菌株发酵液分别进行如下处理20°C、 40°C、60°C、80°C、沸水(IOO0C )水浴lh、121°C高压灭菌30min。处理完后按照上述方法用 滤纸片法检测纯菌株的抑菌活性，结果表明螆蛏共附生纯菌株发酵液对温度具有较好的耐 性，从20°C到121°C均有抑菌活性，且活性没有减弱。说明所制备的活性蛋白具有抗热性， 扩大了其应用范围，可应用于必须经高热条件处理的产品中。
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3.蛋白的pH敏感性测定将本发明实施例所制备蛋白分别溶于已经调好pH值的 蒸馏水中(pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11)配成浓度为3 mg/ml的发酵液，对其发酵液进 行抑菌实验(方法同上)，最后测定抑菌直径。结果表明不同PH值时，蛋白对枯草枯草芽孢 杆菌和变形杆菌影响不大，扩大了其应用范围。4.海虾毒性实验取本发明实施例所制备的蛋白样品(8 mg/mL)0. 05mL加到3个 带刻度的试管中，再在每试管中加入约4 mL海水和10只健康的海虾无节幼体，最后用海水 加至5 Ml ；另取3只试管，也加入10只健康的海虾无节幼体，再用海水加至5 mL，作为空白 对照。置日光灯下，24 h后计数存活海虾。每个实验重复三次，实验结果表明小虾存活 率为沈.67%，而空白对照无一死亡，因此该蛋白具有一定的海虾毒性活性。海虾幼虫曾被许 多活性测试系统应用，有研究发现海虾毒性法和9KB (人鼻咽癌)细胞毒性实验呈现很好 的相关性(P = 01036, kappa = 0156)。细胞毒的ED50 —般是海虾毒LD50的1/10，可用 海虾毒性法代替昂贵而繁杂的体内体外抗肿瘤实验，指导对具细胞毒和3PS ( P388，体 内老鼠白血病)活性提取物的分离。海虾毒性法具快速，便宜和简单(如不需无菌 操作)等优点，本实验结果表明本发明制备的活性蛋白质具有抗肿瘤活性，可应用于抗肿 瘤药物的制备。
权利要求
1. 一种螆蛏共附生菌株抑菌活性蛋白的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行a.取干净、新鲜的螆蛏肉研磨后，将200mL研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养 基上，37 °C恒温培养2天；b.挑取单菌落反复划线培养至纯菌株，用滤纸片法检测纯菌株的抑菌活性；c.取抑菌圈直径大于或等于10mm的菌株，在用葡萄糖做碳源pH5的沙氏液体培养基 中35°C培养120 h ；d.4000r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为90%，4°C 静置过夜，10000 r/min离心30 min，将沉淀用PBS缓冲液溶解后，再用分子截留量3500道 尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥。
全文摘要
本发明公开一种操作简单、成本低廉的螠蛏共附生菌株抑菌活性蛋白的制备方法，依次按如下步骤进行取干净、新鲜的螠蛏肉研磨后，将200mL研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，37℃恒温培养2天；挑取单菌落反复划线培养至纯菌株，用滤纸片法检测纯菌株的抑菌活性；取抑菌圈直径大于或等于10mm的菌株，在用葡萄糖做碳源pH5的沙氏液体培养基中35℃培养120h；4000r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为90%，4℃静置过夜，10000r/min离心30min，将沉淀用PBS缓冲液溶解后，再用分子截留量3500道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥。
文档编号C07K14/415GK102093473SQ20101059147
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者孙秋颖, 张付云, 李云冰, 李妍, 王斌 申请人:大连海洋大学