功能阻断性抗-ed-b-纤连蛋白抗体的鉴别与鉴定的制作方法

专利名称：：功能阻断性抗-ed-b-纤连蛋白抗体的鉴别与鉴定的制作方法功能阻断性抗-ED-B-纤连蛋白抗体的鉴别与鉴定发明描述本发明要求2005年7月ll日提交的US临时申请60/697，565的申请日，所述文献包含在此作为申请。本发明涉及重组多肽，特别是结合纤连蛋白的ED-B-同种型并可阻断其功能的抗体或抗体片段。另外，本发明揭示了所述多肽的诊断和药物学应用。在肿瘤发生和进展期间，其中生长有肿瘤的胞外基质(ECM)通过已经存在的ECM的蛋白酶解降解而被修饰。这个过程产生肿瘤诱导的基质，其与正常组织中存在的ECM不同。肿瘤诱导的ECM看起来是肿瘤生长和肿瘤血管发生的最佳环境(l-4)。在肿瘤血管发生中，新血管从现有的血管中形成。这个过程需要ECM的蛋白酶解，新血管结构中内皮细胞的靶向生长和分化，这是为肿瘤进一步生长所必需的(5)。纤连蛋白是基质糖蛋白的一个重要类别。其主要作用包括促进细胞与众多不同的胞外基质粘附。纤连蛋白在培养的未转化细胞表面上的存在以及其在转化细胞上的不存在的事实使得可以鉴别纤连蛋白为重要的粘附蛋白。其与众多不同分子例如胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和纤维蛋白相互作用，并因此调节细胞形态及细胞骨架的产生。另外，其与胚胎发生期间的细胞迁移和细胞分化相关。再者，其对于创伤愈合很重要，其使得巨噬细胞及其它免疫细胞可以在所述的区域内迁移，并且通过使得血小板可以与血管损伤区域粘附而形成血凝块。纤连蛋白是两个相似肽的二聚体，从而每个链的长度均为大约60-70nm。目前已经鉴别了至少20条不同的纤连蛋白链，其均是通过对单一纤连蛋白基因的RNA转录体进行可变剪接而产生的。纤连蛋白是高分子量且调节粘附的糖蛋白，在脉管系统中发挥重要作用。另外，纤连蛋白在血管发生期间对于内皮细胞具有趋化作用，调节生长因子的功能并支持内皮细胞的线性生长(6-9)。对纤连蛋白的蛋白酶解产物进行的分析示出所述多肽由6个重度折叠的结构域(heavilyfoldeddomains)组成，每个结构域均含有所谓的重复序列("重复")，其氨基酸序列的相似性使得可以将其分为3个类型(1、n和m型)。所述二聚体两个链的中心区域由所谓的III型重复节段组成，平均长度为90个氨基酸(10)。结构研究表明每个III型重复均由7个P链组成，其折叠成2个反平行的折叠层，较短的环形区域暴露作为潜在的蛋白质-蛋白质相互作用的位点(ll)。这些m型重复使得纤连蛋白可以作为粘附分子，与称作"整联蛋白"的细胞表面分子相互作用。术语"整联蛋白"在1987年首次使用(12)，用于描述在胞外基质与胞内细胞骨架之间作为介质并因此诱导细胞粘附和迁移的一组相关的异源二聚体细胞表面分子。这些异源二聚体受体"整合"或介导来自胞外环境的具有特异性细胞功能的信号。到目前为止，已知可以与20种以上a亚单位特异性且非共价相互作用的17种p亚单位，特别是形成20个不同家族(13)。在m型纤连蛋白第10个重复(m-10)中发现的序列RGDS特别介导纤连蛋白与至少8种不同整联蛋白的相互作用。此外，已经示出至少4种整联蛋白可以RGDS-非依赖性途径与纤连蛋白特异性相互作用(13)。除了III7-、1118-、III9-和III10序列之外，m型的重复序列还包含EIIIB和EmA(ED-B和ED-A)重复。ED-B-纤连蛋白在成人的正常组织中不能检测到(唯一的例外是繁殖期子宫内膜)，但是除了ED-B在间质局部表达之外，其在胎儿组织和肿瘤生长中强烈表达。此外，ED-B-纤连蛋白局部定位于血管周围，在血管发生期间新形成。为此，ED-B-纤连蛋白是(肿瘤)血管发生过程的一种特异性标记蛋白(14)。ED-B结构域是高度保守的完全的m型同源成分，由91个氨基酸组成。人与大鼠之间的同源程度为100%，人与鸡之间的同源程度为96%。在文献中，对于ED-B结构域的功能所知甚少。有几个出版物(15-17)推测其对于不同细胞的一般粘附介导作用。迄今为止仍未揭示对于内皮细胞的特异功能。在WO02/20563中，揭示了重组ED-B示出在体外的特异性促血管发生作用(i)bFGF-刺激的人皮肤微血管内皮细胞(HDMVEc)的增殖由重组ED-B增强，(ii)所述蛋白质介导HDMVEC的粘附，及(m)重组ED-B刺激胶原凝胶中HDMVEc的侵润和分化(管形成)。另外，这些ED-B介导的作用可以被衍生自ED-B结构域的合成肽特异性阻断。因此所述肽序列代表内皮细胞表面上ED-B特异性受体的结合区，利用a^-整联蛋白的亲和层析方法鉴别。0C2pr整联蛋白与ED-B结构域之间的特异性相互作用在先前的文献中未描述。在WO02/20563中还揭示了由ED-B-纤连蛋白结构域特异性调节的蛋白质，其包含0C2Pp整联蛋白、局部粘附激酶和CD6配体(ALCAM)、玻连蛋白受体的a链、整合的oc-8亚单位或者卵泡抑素相关蛋白的前体。具有部分重叠性质的许多整联蛋白受体由内皮细胞表达(lit.:D.G.StupackandD.A.Cheresh,SciSTKE，2002Feb12;2002)。这些表达方式示出不同的整联蛋白(例如avP3和oc5pl)介导相似的生物学现象(粘附、迁移和存活)，并因此代表内皮细胞的维护其行为和存活的冗余系统。先前已知a2pi与其天然配体胶原相互作用。这种相互作用的阻断可导致抗血管发生作用(Y.Funahashietal.CancerRes.62:6116-6123,2002)。本发明的一个目的因此是制备功能阻断性结合分子，例如特异性阻断ED-B结构域的受体结合位点的抗体。这些结合分子对于(肿瘤)内皮细胞具有抗血管发生作用。与相对广泛表达的(X2Pr整联蛋白相反，所述ED-B结构域代表这种结合分子的理想及特异性的靶分子。ED-B的结构难以产生单克隆和多克隆抗体，因此认为ED-B在体内免疫原性较低。抗体BC-1(J.CellBiol.108(1989),1139-1148)与纤连蛋白的隐蔽表位反应，其仅当存在ED-B时存在，因此不直接与ED-B反应。抗体L19(Tarlietal.Blood94(1999)，192-198及WO01/62800)是利用重组ED-B作为免疫原产生的，其无生物学活性，即其不能在有效程度识别细胞粘附ED-B。令人惊奇地，现在发现可以产生功能阻断性ED-B结合分子，例如阻断ED-B功能的抗体MOR03255，其极大程度抑制细胞粘附ED-B，且使得体内肿瘤生长显著降低。本发明的结合分子产生的ED-B阻断显然不能代偿胶原-整联蛋白的代偿机制。利用HuCAI^-GOLD抗体文库-具有例如1.6x10E10个Fab片段形式的不同抗体的抗体文库，从HuCAL-共有序列(WO97/08320;Knappik，A.;Ge,L.;Honegger,A.;Pack,P.;Fischer,M.;Wellnhofer,G.;Hoess，A.;Wolle,J.;Plunckthun,A.andVirnekas,B.(2000)J.Mol.Biol.296:57-86)中通过相应于所有六个CDR区域中的人抗体多样性的多样化方式产生，通过噬菌体展示方法加以变化的CysDisplay方法(WO01/05950)严密测试—在本发明的试验中鉴别了选择性结合ED-B结构域的功能阻断性Fab抗体片段。这些抗体片段的效力可以在体外粘附测试中示出，所述测试反应了重组ED-B与分离的HDMVEc之间的特异性相互作用。与ED-B结构域的结合亲和性可以通过结合分子中的特异性改变而显著改良。在动物模型中也示出所述结合分子在体内抑制肿瘤的生长。本发明的第一方面因此是一种多肽，其(i)特异性结合纤连蛋白的ED-B结构域，并且(ii)抑制ED-B结构域与其受体之间的相互作用。本发明的多肽要选是抗体或抗体片段。本发明所用术语"抗体"包含多克隆、单克隆、嵌合、人化或人抗体，以及重组抗体例如单链抗体，或者结合抗原的抗体片段例如单价抗体片段，例如Fab片段或scFv片段，或者二价抗体片段，例如F(ab')2片段。在文中为本发明所必需的是所述抗体含有符合上述条件的一或多个抗原结合位点，即特异性结合ED-B结构域并抑制ED-B结构域与其受体、特别是其内皮细胞上的受体之间的相互作用。这些抗原结合性质优选通过组合VH和VL区而实现，其中这些区域形成所谓的骨架区(FR1、FR2、FR3和FR4)以及介导抗原结合的CDR区(对于VH区为H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3;对于VL区为L國CDR1、L國CDR2、L國CDR3)。本发明的多肽优选与ED-B结构域具有亲和性，相应于KD值《l^m,优选Ko值《100nM、10nM、1nM、最优选KD值《0.1nM，所述亲和性可以利用实施例中所述81八《^6@系统确定。本发明的多肽特征在于其特异性结合纤连蛋白的ED-B结构域，例如其与其它纤连蛋白结构域、特别是与纤连蛋白结构域6(FN6)和域纤连蛋白结构域7-8-9(7-8-9)以明显较低的亲和性结合。在一个优选的实施方案中，本发明的多肽与纤连蛋白ED-B结构域以与FN6和域7-8-9的亲和性高至少2倍、特别是至少5倍、尤其是至少10倍的亲和性结合，可以例如通过实施例所述的结合测试方法确定。在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽示出在体外抑制重组ED-B与HDMVEc细胞的粘附，优选在每种情况中以10Kig/ml浓度抑制至少50n/。，优选至少75%。此外，优选本发明的多肽示出在体内抑制肿瘤生长，所述肿瘤是在实验动物例如无毛小鼠中植入F9-畸胎癌细胞(ATCCCRL-1720)而产生的肿瘤。本发明的多肽优选选自包含如下结构的抗体和抗体片段(a)VH区(i)其由核酸序列SEQIDNO.l(MOR02610)、SEQIDN0.5(MOR02611)、SEQIDNO,9(MOR02613)、SEQIDNO.l3(MOR02614)、SEQIDN0.17(MOR02616)、SEQIDN0.21(MOR02618)、SEQIDN0.25(MOR02619)、SEQIDN0.29(MOR02622)、SEQIDN0.33(MOR02715)、SEQIDN0.37(MOR02718)、SEQIDN0.41(MOR02721)、SEQIDN0.45(MOR02722)编码，或者上述VH区之一的至少一个H-CDRl-、H-CDR-2-禾口/或H-CDR3区，或者(ii)通过至少一个H-CDR区中的改变衍生自(i)所述VH区，和/或(b)VL区(i)其由核酸序列SEQIDN0.3(MOR02610)、SEQIDNO.7(MOR02611)、SEQIDNO.11(MOR02613)、SEQIDNO.15(MOR02614)、SEQIDN0.19(MOR02616)、SEQIDNO.23(MOR02618)、SEQIDNO.27(MOR02619)、SEQIDNO.31(MOR02622)、SEQIDN0.35(MOR02715)、SEQIDNO.39(MOR02718)、SEQIDNO.43(MOR02721)、SEQIDNO.47(MOR02722)编码，或者上述VL区之一的至少一个L-CDRl-、L-CDR2-和/或L-CDR3-区，或者(ii)通过至少一个L-CDR区中的改变衍生自(i)所述VH区。优选VL区中L-CDR3区改变和/或VH区中H-CDR2区改变。例如，本发明的多肽具有衍生自所述VL区且由核酸序列SEQIDNO.27(MOR02619)或SEQIDNO.35(MOR02715)编码的VL区。特别优选的是包含VH区的多肽，所述VH区(i)由核酸序列SEQIDNO,25(MOR02619)或SEQIDNO.33(MOR02715)编码，或者上述VH区之一的至少一个H-CDR1、H-CDR-2和/或H-CDR3区，或者(ii)通过至少一个H-CDR区中的改变衍生自(i)所述VH区。所述多肽优选具有通过H-CDR2区中的改变衍生且由核酸序列SEQIDNO.25(MOR02619)或SEQIDN0.33(MOR02715)编码的VH区。这种情况特别优选的是这样的多肽，其包含(a)VH区(i)其由核酸序列SEQIDNO.63(MOR03243)、SEQIDNO.67(MOR03245)、SEQIDN0.71(MOR03246)、SEQIDNO.75(MOR03251)、SEQIDNO.79(MOR03252)、SEQIDNO.81(MOR03253)、SEQIDNO.83(MOR03255)、SEQIDNO.85(MOR03257)、SEQIDNO.87(MOR03258)编码，或者上述VH区之一的至少H-CDR2区，或者(ii)通过至少一个H-CDR区中的改变衍生自(i)所述VH区，和/或(b)VL区(i)其由核酸序列SEQIDN0.65(MOR03243)、SEQIDN0.69(MOR03245)、SEQIDN0.73(MOR03246)、SEQIDNO.77(MOR03251aswellasMOR03252、MOR03253、MOR03255andMOR03257)、SEQIDNO.89(MOR03258)编码，或者上述VL区之一的至少L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区，或者(ii)通过至少一个L-CDR区中的改变衍生自(i)所述VH区。本发明多肽的具体例子如下所述—种多肽，其包含由SEQIDNO.l编码的VH区及由SEQIDNO.3(MOR02610)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDN0.5编码的VH区及由SEQIDNO.7(MOR02611)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。—种多肽，其包含由SEQIDN0.9编码的VH区及由SEQIDNO.ll(MOR02613)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDN0.13编码的VH区及由SEQIDN0.15(MOR02614)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDN0.17编码的VH区及由SEQIDN0.19(MOR02616)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。—种多肽，其包含由SEQIDNO,21编码的VH区及由SEQIDN0.23(MOR02618)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDNO,25编码的VH区及由SEQIDNO,27(MOR02619)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。—种多肽，其包含由SEQIDNO,29编码的VH区及由SEQIDN0.31(MOR02622)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。—种多肽，其包含由SEQIDN0.33编码的VH区及由SEQIDN0.35(MOR02715)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。—种多肽，其包含由SEQIDN0.37编码的VH区及由SEQIDN0.39(MOR02718)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。—种多肽，其包含由SEQIDN0.41编码的VH区及由SEQIDN0.43(MOR02721)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDNO,45编码的VH区及由SEQIDN0.47(MOR02722)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDN0.25编码的VH区及由SEQIDN0.49(MOR03055)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDN0.25编码的VH区及由SEQIDN0.51(MOR03066)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQID>3.25编码的\01区及由5￡0IDNO,53(MOR03075)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDNO,25编码的VH区及由SEQIDN0.55(MOR03069)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDN0.25编码的VH区及由SEQIDN0.57(MOR03071)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDN0.33编码的VH区及由SEQIDN0.59(MOR03064)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDN0.33编码的VH区及由SEQIDN0.61(MOR03062)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。—种多肽，其包含由SEQIDN0.63编码的VH区及由SEQIDN0.65(MOR03243)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDN0.67编码的VH区及由SEQIDN0.69(MOR03245)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。—种多肽，其包含由SEQIDN0.71编码的VH区及由SEQIDN0.73(MOR03246)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。—种多肽，其包含由SEQIDN0.75编码的VH区及由SEQIDN0.77(MOR03251)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。—种多肽，其包含由SEQIDN0.79编码的VH区及由SEQIDN0.77(MOR03252)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDN0.81编码的VH区及由SEQIDN0.77(MOR03253)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDNO,83编码的VH区及由SEQIDN0.77(MOR03255)编码的VR区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。一种多肽，其包含由SEQIDN0.85编码的VH区及由SEQIDN0.77(MOR03257)编码的VR区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。—种多肽，其包含由SEQIDNO,87编码的VH区及由SEQIDN0.89(MOR03258)编码的VR区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。本发明多肽的VH和VR链的产生方法如下所述VH链>l区构架从第l-78位核苷酸延伸(即26个氨基酸)；FR1的最后一个密码子(氨基酸)总是TCC(Cys)。>所述"CDR1区"可以是两种不同长度，即30个核苷酸(10个氨基酸)(可能存在于VH1A、VH1B、3、4和5家族)或者36个核苷酸(12个氨基酸)(可能存在于VH2、VH4和VH6家族)。>2区构架总是具有33个核苷酸(即1l个氨基酸);FR2的第一个密码子(氨基酸)总是TGG(Trp);最后两个密码子总是CTC.GAG(LeuGlu)。>所述"CDR2区"可以是三种不同长度，即57个核苷酸(19个氨基酸)(可能存在于VH2和VH4家族)、60个核苷酸(20个氨基酸)(可能存在于VH1A、VH1B、3和5家族)，或者63个核苷酸(21个氨基酸)(可能存在于VH6家族)。>3区构架总是具有96个核苷酸(即32个氨基酸);FR3的第三个密码子(氨基酸)总是ACC(Thr);最后五个密码子总是TAT.TAT.TGC.GCG.CGT(TyrTyrCysAlaArg)。>所述"CDR3区"可以是几种不同长度，艮Pl2-69个核苷酸(4-23个氨基酸)(在VH2和VH4所有家族中)、60个核苷酸(20个氨基酸)(可能存在于VH1A、VH1B、3和5家族)，或者63个核苷酸(21个氨基酸)(可能存在于VH6家族)。>4区构架总是具有33个核苷酸(S卩11个氨基酸)，且在所有七个家族中是相同的TGG.GGC.CAA.GGC.ACC.CTG.GTG.ACG.GTT.AGC.TCA。VLK链>l区构架从第l-69位核苷酸延伸(即23个氨基酸)；FR1的最后一个密码子(氨基酸)总是TGC(Cys)。>所述"CDR1区"可以是4种不同长度，即24个核苷酸(8个氨基酸)(可能存在于Vk1和Vk3家族)、27个核苷酸(9个氨基酸)(可能存在于Vk3家族)、39个核苷酸(13个氨基酸)(可能存在于Vk2家族)，或者42个核苷酸(14个氨基酸)(可能存在于Vk4家族)；第一个密码子(氨基酸)总是AGA(Arg);CDRl区的倒数第二个密码子(氨基酸)总是CTG(Leu)。>2区构架总是具有33个核苷酸(即11个氨基酸);FR2的前两个密码子(氨基酸)总是TGG.TAC(TrpTyr);倒数第二个密码子总是CCG(Pro)。>所述"CDR2区"总是具有33个核苷酸(即11个氨基酸)，其中前三个密码子(氨基酸)总是CTA.TTA.ATT(LeuLeuIle)。>3区构架总是具有96个核苷酸(即32个氨基酸);FR3的前三个密码子(氨基酸)总是GGG.GTC.CCG(GlyValPro);最后三个密码子总是TAT.TAT.TGC(TyrTyrCys)。>所述"CDR3区"总是具有24个核苷酸(g卩8个氨基酸)，其中第二个密码子(氨基酸)总是CAG(Gln)。>4区构架总是具有39个核苷酸(g卩13个氨基酸)，且在所有四个家族中是相同的ACC.TTT.GGC.CAG.GGT,ACG,AAA.GTT.GAA.ATT.AAA.CGT.ACG。>l区构架从第l-66位核苷酸延伸(即22个氨基酸)；FR1的最后一个密码子(氨基酸)总是TGT(Cys)。>所述"CDR1区"可以具有三种不同长度，即33个核苷酸(11个氨基酸)(可能存在于VA3家族)、39个核苷酸(13个氨基酸)(可能存在于VX1家族)，或者42个核苷酸(14个氨基酸)(可能存在于VX1和V人2家族)。>2区总是具有33个核苷酸(g卩ll个氨基酸)；FR2的前两个密码子(氨基酸)总是TGG.TACCTrpTyr》第三个密码子总是GCG(Ala)。>所述"CDR2区"总是具有33个核苷酸(g卩ll个氮基酸)，其中第三个密码子(氨基酸)总是ATT(Ile)，最后三个密码子总是CGT.CCC.TCA(ArgProSer)。>3区构架总是具有96个核苷酸(即32个氨基酸)，其中FR3的第一个密码子(氨基酸)总是GGC(Gly)，最后四个密码子总是GAT.TAT.TAT.TGC(AspTyrTyrCys)。>所述"CDR3区"可具有三种不同长度，即24个核苷酸(8个氨基酸)、27个核苷酸(9个氨基酸)或者30个核苷酸(10个氨基酸)。>4区构架总是具有39个核苷酸(即13个氨基酸)，且在所有三个家族中是相同的GTG.TTT.GGC.GGC.GGC.ACG.AAG.TTA.ACC.GTT,CTT.GGC.CAG.为了治疗或诊断目的，例如在体外或体内诊断中，可以使用本发明的多肽。对于治疗性应用，本发明多肽可以是与治疗活性成分结合的形式，所述治疗活性成分例如选自放疗剂或者化疗剂，例如低分子量的活性成分或者生物学抑制细胞的活性成分或者胞毒性活性成分。所述治疗活性成分与所述多肽的结合可以根据已知方法进行，优选通过与所述蛋白质的反应性氨基、羧基、羟基和/或硫醇基团共价结合，任选根据己知方法使用同源-或者异源-双官能团接头。此外，所述多肽也可以是融合蛋白形式，除了抗体例如IgG分子或其片段形式，所述多肽含有与其融合的细胞因子，例如IL2、1112或TNF(x-多肽。另外，所述融合蛋白可以是双特异性抗体形式，其中除了结合ED-B结构域之外，优选结合另一种抗原。双特异性抗体的其它抗体特异性是结合针对螯合剂的结构域，所述螯合剂是以下物质的螯合剂诊断或治疗相关的放射性核素，例如a-、B-或者Y-发射体，如^Y，诊断性NIR(近红外线)-染料，具有治疗效力的染料，免疫学效应细胞上的表面分子(例如NK细胞、胞毒性T细胞或者NKT细胞)，血管发生相关的整联蛋白、特别是阻断其功能的结合结构域(例如a"B3、a^3、a;^、a2B2)，灭活型抗VEGF-结合结构域和针对VEGF受体1、2和3的灭活型结合结构域。对于诊断性应用，所述多肽可以是与诊断性可检测的标记基团结合的形式，所述标记基团例如是迸行体外或体内诊断的标记基团。所述标记基团的例子是放射性标记基团、NMR-、染料-、酶-及荧光-(例如近红外光谱中的荧光)标记基团。对于治疗性应用，所述多肽优选被配制为药物组合物，其含有本发明多肽作为活性成分，任选含有另外的活性成分以及药物学常用载体、佐剂和/或稀释剂。所述药物组合物含有治疗有效量的活性成分，所述治疗有效量可以由本领域技术人员通过简便的体外测试方法确定，例如在合适的细胞培养物或动物模型中测试。所述组合物的给予优选通过注射或输注方式进行，但是也可以采用其它类型的给予方式。优选静脉内和/或皮下注射给予方式。给予的活性成分的剂量依赖于疾病的类型和严重性以及治疗患者的状况。所述治疗组合物优选在一段较长时间例如至少2-4周内分几次给予。给予抗体或抗体结合物的相关已知方法参见例如Ferarra,N.etal.,NatureReviewsDrugDiscovery,Volume3，May2004,391-400andSalgaller，M丄.,CurrentOpinioninMolecularTherapeutics20035(6):657-667所述，或者参见现有的给予药物抗体如Rituximab,CAMPATH,Remicade等的方法。本发明的另一方面提供了包含本发明多肽作为诊断试剂的诊断组合物。另外，所述诊断组合物仍可含有另外的常用诊断试剂、载体、佐剂和/或稀释剂。所述诊断组合物含有足够量的所述多肽，以使得可以通过各自的方式例如体内或体内诊断方式进行诊断检测。在这方面，参考已知的使用标记抗体的体内和体外诊断方法。所述药物和诊断组合物可以用于治疗和诊断ED-B表达例如基质和/或血管周围ED-B表达相关的所有疾病。这种疾病的例子是过度增殖性疾病，例如与血管发生相关的疾病，特别是癌症、眼底病、增生性瘢痕等，与肌成纤维细胞功能失调相关的疾病，例如子宫内膜异位症、动脉硬化斑等，或者炎症疾病，例如银屑病、Crohn's病、风湿性关节炎或者多发性硬化。本发明的药物或诊断组合物可以含有一或多种活性多肽，例如结合ED-B结构域的不同区域的多肽的组合。所述组合物适用于人和兽医药领域。本发明另一方面提供了编码本发明的肽或融合多肽的核酸。这个核酸可以是单链或双链DNA或RNA。所述核酸优选与表达监测序列可操纵地连接，从而可以在合适的宿主细胞或者合适的宿主生物体中表达。所述核酸可以存在于适于导入宿主细胞或宿主生物体中的载体上。所述载体可以例如是适于导入原核细胞中的原核细胞载体，例如质粒或噬菌体。相反，所述载体也可以是适于导入真核宿主细胞或宿主生物体中的真核细胞载体，例如质粒、人工染色体或病毒载体。合适的载体为本领域技术人员所已知，例如Sambrooketal.(1989)，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress禾口Ausubeletal.(1989)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons所描述。本发明另一方面提供了用本发明的核酸或载体转化的细胞，例如原核细胞或真核细胞，例如人细胞。本发明再一方面提供了用本发明的核酸或载体转化的非人生物体，例如转基因动物。在这种情况中，本发明范围内术语"转化"的含义包含将外源核酸导入细胞或生物体的所有可能方式，包括转染或说明书第16/30页感染。通过在所述多肽表达的条件下培养本发明的细胞或非人生物体，然后从例如所述细胞、培养基、生物体或生物体的排泄物中获得所述表达的多肽。另外，通过如下的附图和实施例对本发明加以解释。图l图示出鉴别功能活性抗体的抑制试验。将得自皮肤微血管的人内皮细胞(人真皮微血管内皮细胞，HDMVEc)与ED-B特异性Fab抗体片段一起保温。结合的细胞数通过结晶紫染色法观测并在光度计中测量。高显色强度是指有较多的粘附细胞且无结合阻断抗体。低显色强度是指有较少的粘附但具有结合阻断抗体。图2示出通过Fab片段展示法鉴别ED-B-纤连蛋白-功能阻断抗体的扫描图。第一步，用重组ED-B进行淘选程序。对以此方式获得的抗体片段进行特异性试验(ELISA)、功能性粘附试验以及免疫组织化学研究。然后，确定进行这些试验的抗体的亲和性。接着，对CDR结构域进行改变以改良亲和性，其中亲和性成熟1是指L-CDR3结构域中的改变，亲和性成熟2是指H-CDR2结构域中的改变。将通过亲和性成熟之后获得的抗体进行上述试验，然后测试体内效力。图3示出使用通过用重组ED-B淘选产生的抗体Fab片段进行ELISA特异性试验的结果。ED-B是指与重组ED-B结合，6-FN是指与重组纤连蛋白-结构域6结合，结构域7-8-9是指与重组纤连蛋白结构域7-8-9(无ED-B)结合，结构域7-EDB-8-9是指与重组纤连蛋白结构域7-8-9(有ED-B)结合。ED-B与6-FN或7-8-9的比率产生所研究抗体的特异性。AP-39是指生物学失活的抗-ED-BscFv抗体L19的共价二聚体。图4示出用所研究的抗体进行粘附试验的结果。所述试验测试了25pg/ml浓度的所述Fab片段或者0.4ng/ml浓度的Fab对于HDMVEc细胞与ED-B包被的平板粘附的抑制作用。所示值是3次确定的结果。图5示出在MOR02616的实施例中，功能阻断性抗ED-B-Fab片段的免疫组织化学反应模式。图5A和5C示出了阴性对照组(阴性HuCAL-Fab)的结果，图5B和5D示出了抗体MOR02616对于人成神经细胞瘤细胞-IRM异体移植物(图5A和5B)以及对于小鼠F9-畸胎癌细胞(图5C和5D)的结果。将细胞的冰冻切片(厚度10pm)通风干燥，然后置于冰冻的丙酮中IO分钟。接着，将该切片于PBS中洗涤，与2吗/m啲MOR02616或者阴性对照在室温保温60分钟。将二抗-过氧化物酶标记的多克隆山羊抗人F(ab)2抗血清(于PBS中1:100稀释，Dianova)与作为生色底物的二氨基联苯胺(SigmaChemicals)组合使用。图6示出通过成熟优化的抗体Fab片段的ELISA特异性试验的结果。所述试验的实施程序在图3中描述。图7示出了通过成熟优化的抗体Fab片段MOR03255于F9-畸胎癌细胞的冰冻切片上(图7A)及于无毛小鼠中SKMEL-28人黑素瘤细胞异体移植物上(图7B)的免疫组织化学反应模式。所述试验的实施程序在图5中描述。图8示出本发明的抗体Fab片段与对照抗体L19和Ly60.3的粘附试验结果。所述试验的实施程序与在图4中所述程序非常相似。所述抗体浓度为lpl/ml、10nl/ml或20pl/ml。图9示出本发明的抗体-Fab片段在人血浆或PBS中在37。C保温4小时后的稳定性。免疫反应性在ELISA中确定，浓度范围是0.039-5pg/ml。将在不保温的条件下人血浆中浓度0.62pg/ml的信号作为100Q/。值。图10示出抗ED-B功能阻断性Fab抗体片段于MOR03255实施例中的治疗效力。图11示出编码本发明抗体的VH和VL区的核苷酸序列。实施例l.材料和方法l.l蛋白质与抗体根据标准方法(例如Sambrooketal.，MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourPress),产生纯化的重组纤连蛋白结构域ED-B(His)6、纤连蛋白结构域6(6FN)、纤连蛋白结构域7-8-9及结构域7-ED-B-8國9。根据标准方法产生小鼠抗纯化的ED-B受体的抗体，即给予在Freimd's完全佐剂中的50吗纯化的受体，3周后给予在Freund，s不完全佐剂中的25ng纯化的受体，再3周后所有应用在不完全佐剂中经腹膜内给予。在第三次免疫接种后14天，经框后窦(postorbitalsinus)取血样。血浆纤连蛋白购自Sigma公司。1.2ED-B特异性噬菌体的选择根据HuCAL^GoldPhage选择方案进行选择。将HuCAI^GoldLibrary再分为6个构架特异性集合。所述ED-B-特异性噬菌体在固定于96孔平板(Maxisorb，Nunc,Rochester,NY，USA)中的重组蛋白质的三次连续的选择循环中浓縮。为了淘选A，将所述平板用1吗/孔的ED-B(His6)(10pg/ml于紐1^&@中)在37。C包被2小时。为了淘选B，将所述平板用于PBS中相同浓度的ED-B(pH7.2，具有lmmol的MgCl2/lmmol的CaCl2)在4。C包被过夜。将所述平板用在PBS中的5%脱脂奶粉溶液、0.05%Tween20(Sigma,St丄ouis,MO,USA)(封闭液)封闭，与预先已经与l体积的封闭液保温的lX1013HuCALGold噬菌体一起保温。为了淘选B，将所述噬菌体另外与0.5pg/ml纤连蛋白-结构域6预保温，以减少特异于纤连蛋白3型结构域重复的保守结构的结合分子的选择。在与所述噬菌体在室温保温2小时之后，将孔用PBS、0.05。/。Tween20洗涤5次，并再用PBS洗涤5次。剩余的噬菌体用于10mmol的tris/HCl(pH8.0)中的20mmol的二硫苏糖醇(DTT)在室温洗脱10分钟。然后，与大肠杆菌TG-1(Stratagene,OD6Q(^0.5)—起保温以进行感染。接着，将孔与大肠杆菌TG-1—起保温作为另外的洗脱步骤。1.3噬菌粒回收，噬菌体扩增和纯化将DieHuCALGold噬菌体在具有34jig/ml氯霉素和1。/。葡萄糖的2XTY培养基(2XTY-CG)中扩增。在用辅助噬菌体(VCSM13)在37。C及大约为0.5的OD60()条件下感染后，离心并再悬浮于2XTY-CG/50pg/ml卡那霉素中，将细胞用0.2511111101的1丁0诱导并在22°<:培养过夜。利用聚乙二醇从上清中沉淀出噬菌体(Ausubeletal.(1998),CurrentProtocolsofMicrobiology),将其再悬浮于PBS中并用于随后的选择循环。1.4选择的Fab片段的亚克隆及可溶的Fab片段的表达将选择的HuCAI^Gold噬菌体的Fab编码插入体亚克隆在表达载体pMORPHx9-FS中。选择的HuCALGold克隆的质粒-DNA制品用限制酶XbalI/EcoRI切割，从而切掉所述Fab编码插入体(ompA-VL和phoA-Fd)。在这个载体中表达的Fab分子含有两个C末端标记(FLAGTM和Strep-tag11)，以进行检测和纯化。1.5HuCALGold抗体在大肠杆菌中的表达和纯化在具有0.751的2XTY培养基和34pg/ml氯霉素的摇瓶中进行pMORPHx9-FS-编码的Fab片段在大肠杆菌TG-lF细胞中的表达。在用0.75mmol的IPTG诱导后，将细胞在30。C培养16小时。或者，将得自第二成熟集合2的Fab克隆用0.1mmol的IPTG诱导，然后在22。C培养。通过渗透休克法从细胞沉淀中产生周质提取物，Fab片段通过Strep-Tacti^层析法(IBA,G6ttingen，Germany)分离。表观分子量通过具有校准标准的大小排阻层析法(SEC)确定。浓度通过UV光谱法确定。1.6通过ELISA鉴别ED-B结合的Fab片段将96孔MaxisorbELISA平板用IOOnl的ED-B溶液(10吗/ml于包被缓冲液(PBSpH7.4，lmmol的CaCl2，1mmol的MgCl2)中)在4。C包被过夜。加入粗溶解产物或者纯化的Fab分子；未结合的Fab分子通过用洗涤缓冲液(PBSpH7.4，0.05%Tween20)洗涤5次而除去。通过与抗人Fab抗体-过氧化物酶结合物(Dianova)保温，随后用可溶的过氧化物酶底物(Roche)显色及在370nm测量而检测所述Fab片段。表达ED-B特异性Fab分子的克隆通过固定的ED-B上阳性ELISA信号对应在6FN的较弱或无信号而鉴别。1.7在生理学温度条件下通过ELISA确定血浆稳定性基本如上述用ED-B(2.5ng/ml)进行包被。将Fab片段在人血浆(GermanRedCross;Batch9985550)中在50吗/ml浓度下37。C保温4小时。在保温后，根据ELISA所需，将Fab分子稀释为浓度为在具有P/。牛血清白蛋白的PBS中5.0、2.5、1.25、0.62、0.31、0.156、0.078和0.039pg/ml，以确定信号强度的线性区域。使用抗-FlagM2抗体(SigmaF3165)和二级抗小鼠抗体-碱相结合物确定功能性Fab分子，随后用Attophos(Roche)显色，并在535nm进行测量。1.8HDMVEc细胞培养及细胞粘附试验将分离自幼儿包皮的人真皮微血管内皮细胞(HDMVEc)在用0.1。/。凝胶(Sigma)包被的容器中的EGM-MV培养基(Clonetics,Inc.)中培养，所述培养基中添加了10%胎牛血清、2mmol谷氨酰胺、20吗/ml肝素和3ng/ml的bFGF。为了进行粘附试验，使用经培养传代不超过8代的细胞。在96孔ELISA平板中，将ED-B(10吗/ml)或血浆纤连蛋白(2.5pg/ml)在PBS(pH7.4)、0.9mmol的CaCl2、0.5mmol的MgCl2中在4。C固定过夜，并用在PBS(pH7.4)中的l。/。RSA、0.9mmol的CaCl2、0.5mmol的MgCl2在37。C封闭l小时。将细胞用0.15吗/ml钙黄绿素在37。C标记30分钟，于粘附培养基(MCDB131，2mmol谷氨酰胺，0.1%RSA，20pg/ml肝素)中洗涤一次。将lX105个细胞与在每种情况中指定浓度的抗体在37。C保温20分钟，于粘附培养基中稀释(终体积为100pl)。在37'C将细胞悬浮液加入在的ED-B-包被的平板2小时。将细胞在PBS(pH7.4)、0.9mmol的CaCl2、0.5mmol的MgCl2中洗涤2次后，利用平板荧光计(激发485nm;发射530nm)检测粘附细胞。作为对照，(A)确定不添加特异性抗体条件下与配体包被的平板结合的细胞，(B)确定无配体包被的条件下与孔粘附的细胞，在最后提及的对照中获得的值作为细胞粘附的最小值。1.9通过逐步CDR盒置换选择的Fab分子的亲和性成熟为了增加选择的抗体的亲和性和生物学活性，使用三核苷酸定点诱变方法通过盒诱变方法优化CDR区。为此，将来自噬菌粒载体pMORPH-23中表达载体pMORPHx9的Fab片段使用EcoRI/Xbal限制位点克隆。为了优化选择的Fab片段的亲和性，对每个成熟集合进行两个连续步骤。第一步，产生抗体片段-噬菌体文库，其中起始克隆的L-CDR3区通过7X108(集合1)和3.8X108(集合2)各个轻链-CDR序列的库(repertoire)而改变。然后，将通过第一个成熟步骤亲和性得以改良的衍生物暴露于第二个成熟循环，H-CDR-2区域由多种多样的元件置换。在这种方式中，每种情况产生具有lX108个单独克隆的两个噬菌体文库。通过转化进大肠杆菌TOP10F中产生亲和性成熟文库。噬菌体如上述产生。在严格条件下第一次成熟进行三次循环，第二个步骤进行两次循环，以选择具有改良的亲和性的Fab片段。1.10通过表面等离子共振(BIAcore芍确定亲和性为了确定KD值，使用Fab片段的单体部分(至少80n/。单体含量，通过分析性SEC确定；Superdex75,AmershamPharmacia)。使用标准的EDC-NHS-胺-结合化学方法，将Fl-芯片(Biacore,Sweden)用大约200RU的ED-B(30吗/ml，10mmol乙酸盐缓冲液，pH4.0)包被，参考流动池用相应量的人血清白蛋白(20Mg/ml，lOmmol乙酸盐缓冲液，pH4.5)包被。抗原密度降低为大约IOORU以进行二次成熟的Fab鉴定。使用10mmo1的HC1进行再生。所有动力学测量均在PBS缓冲液(136mmol的NaCl，2.7mmol的KCl，10mmol的Na2HP04，1.76mmol的KH2P04.pH7.4)中迸行，流速为20pl/分钟，使用1.5-500nmol浓度的Fab。在每种情况中注射时间为l分钟。利用BIA评估软件3.1评估所有sensogramso縮写EDC:l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；NHS:N-羟基琥珀酰亚胺；RU:共振单位。2.结果2.1人ED-B抗体的产生进行两种不同的淘选分析。第一种分析(淘选方法A)中的ED-B包被是根据从其中ED-B以使得HDMVEc细胞与固定的抗原粘附的构象存在的生物学试验已知的条件进行。在第二种淘选分析(B)中，进一步加入过量的6FN阻断噬菌体，以避免选择与纤连蛋白-结构域6交叉反应的结合分子。总之，从1315个原始采样中发现23个不同的HuCAL-Fab分子，其符合与ED-B结合但是与6FN不结合的标准。另外，检测抗体结合重组表达的纤连蛋白的能力，所述重组表达的纤连蛋白在其天然排列中包含结构域7、8和9，有和无插入的ED-B结构域(见图3)。所有检测的抗体均示出特异性识别7-ED-B-8-9构建体，但是与无ED-B结构域的相应构建体不反应。2.2ED-B特异性结合分子的功能鉴定对在ELISA中特异性鉴别的抗体进行纯化并测试其阻断HDMVEc细胞与ED-B包被的平板粘附的能力。检测在存在两种浓度的ED-B特异性Fab片段的条件下HDMVEc细胞的粘附，与非特异性HuCAL-对照Fab分子和阳性小鼠对照血清进行对比。在2.1段落中描述的23个Fab分子中的12个分子示出在固定的ED-B中细胞粘附受抑制。六个最有效的Fab分子的代表性选择示于图4。在25iig/ml浓度，细胞粘附被抑制50%至几乎100%抑制。在0.4pg/ml浓度，仅几个Fab分子例如MOR02610、MOR02616、MOR02715和MOR02718示出可再现的细胞粘附抑制作用。功能阻断性Fab抗体片段通过免疫组织化学方法针对其在F9-小鼠-畸胎癌细胞和人IRM30成神经细胞瘤-异体移植冷冻切片上的定位加以鉴定。所有测试的抗体均示出在两个组织切片上的血管定位，但是在正常组织上无血管染色(例如在正常的和硬化的肝脏和皮肤上)。在图5B和5D中，示出了通过MOR02616的血管周围近腔染色、增殖的内皮和肿瘤基质。可以检测到指数生长中的肿瘤的新血管结构附近ED-B的集合，但是在正常血管附近未检测到这种情况。使用相同浓度的溶菌酶阴性对照抗体未观测到染色(图5A和5C)。12个选择的结合分子的性质通过BIAcore分析加以确定(见表l)。亲和性(Kon)为15-500nmol。二价L19衍生物AP39(ED-B的无生物学活性的比较抗体)的亲和性经确定为2.4nmol。表l还示出了CDR序列(仅L-CDR3和H-CDR3)及构架组合。对不同批次的Fab分子进行至少两次单独测量蛋白质表达和蛋白质纯化。所述Fab分子的结合率(Kon)和解离率(Koff)在独立的纵列中示出。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>2.3通过优化L-CDR3和H-CDR2区对功能阻断性ED-B抗体进行亲和性成熟以两个步骤进行Fab分子的亲和性成熟。首先，使L-CDR3序列多样化，然后置换在第一步中获得的改良的Fab分子的H-CDR2序列。产生进行每个步骤的两个亲和性成熟文库。在两个单独的集合中进行优化。具有7X108个元件程度多样性的L-CDR3文库l含有4个起始Fab分子MOR02610、MOR02616、MOR02619和MOR02622。L-CDR3文库2具有3.8X108个元件程度的多样性，仅含有MOR02715和MOR02718的衍生物。在每种情况中根据其在粘附试验中的亲和性及生物学活性组合Fab分子。在选择程序期间，所述两个文库单独进行选择。在这种情况中，进行两种淘选方法。淘选方法I使用固定于maxisorb平板上的ED-B进行三次循环，如先前所述。淘选方法n是在溶液中选择生物素酰化的ED-B。在这种情况中，噬菌体-抗原复合物在第一次循环中通过链亲和素包被的颗粒回收，在随后的两次循环中在中性抗生物素蛋白平板上回收。在选择程序中使用严格条件。通过在BIAcore系统中确定Kof^i筛选优化的Fab分子。总之，鉴定了文库l的ll个衍生物。具有最高亲和性的5个衍生物示于表2。在这种情况中，全部改良的克隆均是MOR02619的衍生物，亲和性增加直至7倍。在克隆MOR03075中，发现亲和性为2.4nmo1。从文库2中，详细分析了MOR02715的两个衍生物。对于克隆MOR03062，发现亲和性增加15倍，因此获得单体亲和性为2.4nm。L-CDR3区的氨基酸序列中的改变示于表2a和2b。表2a淘选集MOR0初始克隆LCDR3Kon1/MsKoff1/sjKD[nml相对于亲代克隆合l改良倍数KonKoffKDAP39-生QQTGRI陽-PP6.6E+051.49E-0032.4±0.6物素2619QSWDGAS-TG7.8E+051.2E-0215.4±0.6固体30552619QAWTRAHRYP1.8E+065.1E-033.0±0.52.22.65.4溶解的30662619SSYD-T()VTRUE+064.7E-034.2±0.61.42.83.8溶解的30752619QSWDP-RSFTUE+062.6E-032.4±0.31.45.06.8溶解的30692619WTGM--SYHF1.2E+064.1E-033.3±0.21.53.24.8溶解的30712619LAYK)S-KGH1.9E+065.7E-033.1±0.82.32.35.1表2b淘选集MORO亲代克隆LCDR3Kon1/MslKoff[1/s]KDlnml相对于亲代克隆合2改良倍数KonKofTKDAP39-生物QQTGRI--PP6.75E+051.49E-032.4±0.6素271SQAWDNQGMKY9.9E+054.7E-0253.7±1.7固体30642715QSWDLLAPSV1.5E+061.4E-0210±3.51.73.55.3固体30622715QSWDLSVHQV3.5E+0.61.1E-023.4±0.84.04.215.8经过第一次成熟循环，所有衍生物对于ED-B的特异性(通过ELISA、免疫组织化学和细胞粘附试验)未改变。选择示于表2a和2b的Fab分子进行随后在两个集合中的H-CDR2成熟。在集合1中，五个Fab分子活性相似，但是在H-CDR2中具有不同的L-CDR3区(文库大小为7X107个元件)。对于集合2(文库大小为8.5X1(T个元件)，选择两个Fab分子。如上述单独选择所述文库。亲和性增加的结合分子通过在严格条件下在溶液中进行两次淘选循环加以浓縮。三个Fab分子选自集合l。对于衍生物MOR03243和MOR03245，发现大约为0.7nmol的亲和性。对于衍生物MOR03246，发现0.6nmol的亲和性。相应克隆的H-CDR2序列及亲和性数据示于表3a。表3a<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>[注Sequenz-序列]2.4髙亲和性功能阻断性ED-B抗体的鉴定为了测试通过亲和性成熟获得的抗体是否仍然总是特异于ED-B，进行ELISA形式的特异性测试(图6)、免疫组织化学研究(图7)和粘附试斷图8)。在所有这三个试验中，发现亲和性成熟的Fab分子对于ED-B的特异性保持不变。另外，从图8中看出，两个亲代克隆例如MOR02715和通过亲和性成熟产生的克隆如MOR03062、MOR03255、MOR03064和MOR03259比已知抗体L19具有明显更高的生物学活性(粘附抑制)。另外，测试了人血浆中Fab分子的热稳定性。为此，将所述Fab分子与人血浆在37。C保温4小时，通过ELISA确定发现免疫反应性未明显丧失(图9)。所有选择的Fab分子均能以剂量依赖性方式阻断ED-B上的受体与人微血管内皮细胞的相互作用，这是已知的ED-B抗体L19不具有的性质。由于HDMVEc与胞外基质的粘附是肿瘤血管发生中的早期步骤之意，因此通过本发明的结合分子阻断这个过程可以产生抑制新血管的形成和抑制肿瘤生长的治疗剂。2.5体内作用将F9-畸胎癌细胞(l()6/小鼠，于Matrigel中，有/无100pg的FabMOR03255)经s.c.植入无毛小鼠的侧腰部。3天后，在每种情况中每只小鼠用IOOpg的MOR03255对小鼠进行连续7天治疗。与溶剂对照相对比，两个治疗组均示出肿瘤生长抑制42-64%。试验结果示于图IO。无需进一步详细描述，确信本领域技术人员可以通过前文描述内容最大程度地利用本发明。因此，前述优选的特定实施方案只是例证本发明而无任何限制本发明之意。在前文描述和实施例中，除非特别指出，则所有温度均是摄氏度，所有份和百分比均是重量单位。本文引用的所有申请、专利和出版物的全部内容及相应的2005年10月14日申请的德国申请102004050101.7和2005年7月11日申请的美国临时申请60/697，565的全部内容均并入本文作参考。通过取代本发明在前述实施例中使用的一般或特殊描述的反应物和/或操作条件重复进行所述实施例可获得相似成功。从前面的描述中，本领域技术人员易于确定本发明的基本特征，在不偏离本发明精神和范围的前提下，可以对本发明做各种改变和修改以适应不同的用途和条件。参考文献(1)Browr^LF.;Guidi,A.J.;Schnitt,S.J.;VanDeWater,L.;Iruela-Arispe，M丄.；Yeo,T,K.;Tognazzi,K.;Dvorak,H.F.(1999)Clin.CancerRes.5:1041-1056。(2)Folkman,J.(l995)Nature(Med.)1:27-31。(3)Risau，W.andLemmon，V.(1988)Develop.Biol.125:441-450。(4)VanDenHoff，A.(1988)Adv.CancerRes.50:159-196。(5)Folkman,J.andShing,Y.(1992)J.Biol.Ghem.267:10931-10934。(6)George,E丄.；Baldwin,H.S.;Hynes,R.O.(1997)Blood卯3073-3081。(7)Bowersox,J.C.andSorgente，N.(1982)CancerRes.42:2547-2551。(8)Madri，J.A.;Pratt,B.M.;Tucker,A.M.(1988)J.CellBiol.106:1375-1384。(9)Nicosia,R.F.;Bonnano,E.;Smith,M.(1993)J.Cell.Physiol.154:654-661。(10)Kornblihtt,A.R.;Vibe-Pedersen,K.;andBaralle,F.E.，1983.IsolationandCharacterizationofcDNAClonesforHumanandBovinefibronectins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80，3218-22(11)Leahy,D丄；Hendrickson，W.A.;Aukhil,LandErickson^H.P.,1992.StructureoffibronectinTypeIIIDomainfromTenascinPhasedbyMASAnalysisoftheSelenomethionylProtein.Science,258，987-91。(12)Hynes，R.O.,1987,Cell48,549-550。(13)Plow,E.F.etal.2000，J.Biol.Chem.，275,21785-21788。(14)Castellani,P.;Viale,G.;Dorcaratto,A.;Nicolo,G.;Kaczmarek,J.;Querze,G.;Zardi，L.(1994)Int.J.Cancer59:612-618。(15)Hashimoto画Uoshima,M.;Yan,Y.Z.;Schneider,G,;Aukhil，1.(1997)J.CellScience110:227-2280。(16)Chen,W.andCulp,L.A.(1996)Exp.CellRes.223:9-19。(17)Chen,W.andCulp,L.A.(1998)Clin.Exp.Metastasis16:30-42。权利要求1.一种多肽，其特征在于(i)其特异性结合纤连蛋白的ED-B结构域；(ii)其抑制ED-B结构域与其受体之间的相互作用。2.权利要求1的多肽，其是抗体或抗体片段。3.权利要求1或2的多肽，其呈现对ED-B结构域的亲和性，相应于Ko值《lOOnmol。4.权利要求3的多肽，其呈现对ED-B结构域的亲和性，相应于Ko值《10nmol。5.权利要求3的多肽，其呈现对ED-B结构域的亲和性，相应于KD值《1nmol。6.权利要求l-5任一项的多肽，其对于纤连蛋白ED-B结构域的特异性比对纤连蛋白结构域6和/或纤连蛋白结构域7-8-9的特异性高至少5倍。7.权利要求l-6任一项的多肽，其示出在体外抑制ED-B与HDMVEc细胞、肿瘤细胞和/或基质细胞的粘附。8.权利要求l-6任一项的多肽，其示出在体内抑制肿瘤的生长，所述肿瘤是在测试动物中通过植入F9畸胎癌细胞而产生。9.权利要求l-8任一项的多肽，其选自包含如下结构的抗体或抗体片段(a)VH区(i)其由核酸序列SEQIDNO.l(MOR02610)、SEQIDNO.5(MOR02611)、SEQIDNO.9(MOR02613)、SEQIDNO.13(MOR02614)、SEQIDNO.17(MOR02616)、SEQIDNO.21(MOR02618)、SEQIDNO.25(MOR02619)、SEQIDNO.29(MOR02622)、SEQIDNO.33(MOR02715)、SEQIDNO.37(MOR02718)、SEQIDNO.41(MOR02721)、SEQIDNO.45(MOR02722)编码，或者上述VH区之一的至少一个H-CDRl-、H-CDR-2-和/或H-CDR3-区，或者(ii)通过至少一个H-CDR区中的改变衍生自(i)所述VH区，禾卩/或(b)VL区(i)其由核酸序列SEQIDNO.3(MOR02610)、SEQIDNO.7(MOR02611)、SEQIDNO.ll(MOR02613)、SEQIDN0.15(MOR02614)、SEQIDNO.19(MOR02616)、SEQIDN0.23(MOR02618)、SEQIDN0.27(MOR02619)、SEQIDNO,31(MOR02622)、SEQIDNO.35(MOR02715)、SEQIDNO.39(MOR02718)、SEQIDNO.43(MOR02721)、SEQIDN0.47(MOR02722)编码，或者上述VL区之一的至少一个L-CDRl-、L-CDR2-和/或L-CDR3-区，或者(ii)至少一个L-CDR区中的改变衍生自(i)所述VL区。10.权利要求9的多肽，其具有这样的VL区，所述VL区通过L-CDR3区中的改变衍生自(b)(i)所述VL区。11.权利要求10的多肽，其具有这样的VL区，所述VL区衍生自由SEQIDN0.27(MOR02619)或SEQIDNO.35(MOR02715)的核酸序列编码的VL区。12.权利要求9-U任一项的多肽，其包含(a)VH区(i)其由核酸序列SEQIDNO.25(MOR02619)或SEQIDNO.33(MOR02715)编码，或者上述VH区之一的至少一个H-CDR1、H-CDR-2和/或H-CDR3区；或者(ii)通过至少一个H-CDR区中的改变衍生自(i)所述VH区，和/或(b)VL区(i)其由核酸序列SEQIDNO.49(MOR03055)、SEQIDNO.51(MOR03066)、SEQIDN0.53(MOR03075)、SEQIDNO.55(MOR03069)、SEQIDN0.57(MOR03071)、SEQIDN0.59(MOR03064)、SEQIDN0.61(MOR03062)编码，或者上述VL区之一的至少L-CDR3区，或者(ii)通过至少一个L-CDR区中的改变衍生自(i)所述VH区。13.权利要求9-12任一项的多肽，其具有这样的VH区，所述VH区通过H-CDR2区中的改变衍生自(a乂i)所述VH区。14.权利要求13的多肽，其具有这样的VH区，所述VH区衍生自由核酸序列SEQIDN0.25(MOR02619)或SEQIDNO.33(MOR02715)编码的VH区。15.权利要求9-14的多肽，其包含<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(i)其由核酸序列SEQIDNO.63(MOR03243)、SEQIDNO.67(MOR03245)、SEQIDN0.71(MOR03246)、SEQIDNO.75(MOR03251)、SEQIDN0.79(MOR03252)、SEQIDN0.81(MOR03253)、SEQIDNO.83(MOR03255)、SEQIDN0.85(MOR03257)、SEQIDNO.87(MOR03258)编码，或者至少其H-CDR2区，或者(ii)通过至少一个H-CDR区中的改变衍生自(i)所述VH区，和/或(c)VL区(i)其由核酸序列SEQIDNO.65(MOR03243)、SEQIDNO.69(MOR03245)、SEQIDN0.73(MOR03246)、SEQIDNO,77(MOR03251)、SEQIDNO.89(MOR03258)编码，或者上述VL区之一的至少L-CDRl-、L-CDR2-或L-CDR3区，或者(ii)通过至少一个L-CDR区中的改变衍生自(i)所述VH区。16.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO.l编码的VH区及由SEQIDNO.3(MOR02610)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。17.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.5编码的VH区及由SEQIDNO.7(MOR02611)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。18.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,9编码的VH区及由SEQIDNO.l1(MOR02613)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L曙CDR2或L國CDR3区。19.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,13编码的VH区及由SEQIDNO.15(MOR02614)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。20.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.17编码的VH区及由SEQIDNO.19(MOR02616)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L画CDR3区。21.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.21编码的VH区及由SEQIDNO.23(MOR02618)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。22.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,25编码的VH区及由SEQIDNO.27(MOR02619)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。23.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,29编码的VH区及由SEQIDNO.31(MOR02622)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。24.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,33编码的VH区及由SEQIDNO.35(MOR02715)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L國CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。25.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,37编码的VH区及由SEQIDNO.39(MOR02718)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。26.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.41编码的VH区及由SEQIDNO.43(MOR02721)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。27.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.45编码的VH区及由SEQIDNO.47(MOR02722)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。28.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,25编码的VH区及由SEQIDNO.49(MOR03055)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。29.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.25编码的VH区及由SEQIDNO.51(MOR03066)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。30.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.25编码的VH区及由SEQIDNO.53(MOR03075)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。31.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,25编码的VH区及由SEQIDNO.55(MOR03069)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。32.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.25编码的VH区及由SEQIDNO.57(MOR03071)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。33.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,33编码的VH区及由SEQIDNO.59(MOR03064)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。34.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,33编码的VH区及由SEQIDNO.61(MOR03062)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。35.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.63编码的VH区及由SEQIDNO.65(MOR03243)编码的VR区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。36.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.67编码的VH区及由SEQIDNO.69(MOR03245)编码的VR区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。37.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.71编码的VH区及由SEQIDNO.73(MOR03246)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。38.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.75编码的VH区及由SEQIDNO.77(MOR03251)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L國CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。39.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,79编码的VH区及由SEQIDNO.77(MOR03252)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L画CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。40.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.81编码的VH区及由SEQIDNO.77(MOR03253)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。41.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,83编码的VH区及由SEQIDNO.77(MOR03255)编码的VL区或者其至少一个H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。42.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.85编码的VH区及由SEQIDNO,77(MOR03257)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。43.权利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.87编码的VH区及由SEQIDNO.89(MOR03258)编码的VL区或者其至少一个H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3区。44.权利要求l-43任一项的多肽，其是与治疗活性成分结合的形式。45.权利要求44的多肽，其中所述治疗活性成分选自放疗剂或者化疗剂。46.权利要求l-43任一项的多肽，其是融合蛋白形式。47.权利要求46的多肽，其是与细胞因子融合的融合蛋白或者是双特异性抗体。48.权利要求l-43任一项的多肽，其是与诊断学可检测的标记基团结合的形式。49.权利要求46的多肽，其中所述诊断学可检测的标记基团选自放射性、NMR-、染料、酶和荧光标记基团。50.药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求l-47任一项的多肽以及药物学常用的载体、佐剂和/或稀释剂。51.权利要求50的组合物，其用于预防或治疗过度增殖性疾病。52.权利要求50或61的组合物，其用于预防或治疗癌症。53.诊断组合物，其包含作为诊断试剂的权利要求1-43、48或49任一项的多肽。54.权利要求53的组合物，其用于诊断过度增殖性疾病或其倾向。55.权利要求53或54的组合物，其用于诊断癌症或其倾向。56.权利要求50-55任一项的组合物，其用于人的药物。57.编码权利要求l-43或46-47任一项的多肽的核酸。58.权利要求57的核酸，其与表达控制序列可操纵地连接。59.载体，其含有权利要求57-58任一项的核酸。60.细胞，其经权利要求57-58任一项的核酸或者权利要求59的载体转化。61.非人生物体，其经权利要求57-58任一项的核酸或者权利要求59的载体转化。62.生产权利要求l-43任一项的多肽的方法，其中将权利要求60的细胞或者权利要求61的非人生物体在使所述多肽表达的条件下培养，并获得表达的多肽。63.权利要求l-47任一项的多肽在生产预防或治疗ED-B-相关疾病的药剂中的应用。64.权利要求62的方法用于生产预防或治疗癌症的药剂的应用。65.权利要求1-43、48或49任一项的多肽在生产诊断ED-B相关疾病或其倾向的检测试剂中的应用。66.权利要求65的应用，其用于生产诊断癌症或其倾向的检测试剂。全文摘要本发明涉及重组多肽，特别是结合纤连蛋白的Ed-B-同种型并可阻断其功能的抗体或抗体片段。另外，本发明还揭示了本发明的多肽的诊断和药物学应用。文档编号G01N33/563GK101356271SQ200580052490公开日2009年1月28日申请日期2005年11月9日优先权日2005年11月9日发明者A·门拉德,A·魏德曼,J·普拉斯勒申请人:拜耳先灵医药股份有限公司;莫弗西斯股份公司