用于检测GPIb-凝血酶相互作用的调节因子的方法和用于进行该方法的测定试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于凝血诊断（coagulation diagnostics)的领域并且涉及用于检测样品 中的GPIb-凝血酶相互作用的调节因子的方法。
【背景技术】
[0002] 凝血酶（因子IIa)参与血浆血液凝固的多重性激活和抑制机制，并且因此是二 期止血（secondary hemostasis)(其主要包括血纤蛋白的形成）的核心酶。较差的研宄 和理解的是凝血酶在一期止血（primary hemostasis)(其包括作为内皮损伤的结果的 血小板的激活和血小板的附着）中的作用。已知的是凝血酶是血小板激活因子并刺激 血小板的聚集。血小板表面上最重要的凝血酶受体是，第一，PAR受体（蛋白酶激活的受 体）和第二，糖蛋白Ib-V-IX受体复合物。糖蛋白Ib-V-IX受体复合物包含内在膜蛋白 (integral membrane protein)糖蛋白Ib (GPIb)、内在膜蛋白糖蛋白IX(GPIX)和糖蛋白 V(De Candia, E. , Mechanisms of platelet activation by thrombin:A short history. Thrombosis Research 2012,129 :250 - 256)〇
[0003] GPIb是由具有约145kDa的表观分子质量的重链（同义词：α链或者GPIb a ) 和具有约22kDa的表观分子质量的轻链（同义词：β链或者GPIb β)组成的双链分子， 其通过二硫键连接至彼此（Lopez，J.A.et al. ,Cloning of the a chain of human platelet glycoprotein Ib :A transmembrane protein with homology to leucine-richa2_glyc〇Pr〇tein.Proc. Natl. Acad. Sci USA 1987,84:5615 - 5619)。
[0004] GPIba蛋白包含用于凝血酶的结合位点并且因此引起凝血酶结合至糖蛋白 Ib-V-IX受体复合物。GPIba链的片段是糖萼蛋白（glycocalicin)，其水解地切割自血 小板膜中的完整的受体蛋白。糖萼蛋白在血浆中是可检测的。血浆中的游离糖萼蛋白的 升高的浓度表示血小板功能的破坏（Beer, J.H.et al.，Glycocalicin:A New Assay-The Normal Plasma Levels And Its Potential Usefulness in Selected Diseases. Blood 1994, 83(3) :691 - 702)。
[0005] 由于凝血酶和血小板在动脉血栓形成（thrombose)的发展中起着主要作用并且 由于用于预防性和治疗性应用的血小板聚集的抑制因子正被同时研宄和使用，因此，凝血 酶和血小板的相互作用的具体研宄是有极大益处的。
[0006] 因此期望具有这样的方法：其允许检测患者样品中血小板-凝血酶相互作用的调 节因子（调节子，调节剂，modulator)即，抑制因子（抑制子，抑制剂，inhibitor)或者激活 因子（激活子，活化剂，activator)。这样的方法将允许监测血小板抑制因子疗法或者甚至 检测生理学破坏性因子，如，激活性或者抑制性自身抗体。
【发明内容】
[0007] 本发明的目标是提供用于专门检测样品中的GPIb-凝血酶相互作用的调节因子 的方法。
[0008] 通过以下实现该目标：使样品与分离的GPIba蛋白并且与分离的凝血酶接触并 且测定GPIba蛋白和凝血酶之间的复合物的形成，GPIba蛋白是突变的，与人类GPIba蛋 白的野生型序列相比，包含至少氨基酸残基1 - 268并且具有在位置233、235、237和239中 的至少一个处的替换Xaa(SEQ ID NO: 1)。
[0009] 术语"GPIb -凝血酶相互作用的调节因子"包含影响GPIb -凝血酶相互作用的物 质。GPIb-凝血酶相互作用的抑制因子减少凝血酶与GPIba蛋白的结合。GPIb-凝血酶 相互作用的激活因子增强凝血酶与GPIb a蛋白的结合。
[0010] 如果样品包含激活因子，那么与标准样品相比，复合物的形成被增强。
[0011] 如果样品包含抑制因子，例如
[0012] ?治疗上给予的凝血酶抑制因子，例如来自外位点（exosite) I抑制因子（例如， 水輕素）或者外位点Π 抑制因子（例如，肝素）的组（Ruggeri，Z. M. et al.，Unravelling the mechanism and significance of thrombin binding to platelet glycoprotein lb. Thrombosis and Haemostasis 2010，104.5:894 _ 902)或者
[0013] ?生理性凝血酶抑制因子，如，例如，防止凝血酶与GPIbcx的结合的抗凝血酶自身 抗体，或者
[0014] ?治疗给予的GPIb α抑制因子，如，例如，抗GPIb α抗体，例如抗体4H12 (US 5486361)或者抗体 SZ2(Ruan, C. et al. , A murine antiglycoprotein Ib complex monoclonal antibody,SZ2, inhibits platelet aggregation induced by both ristocetin and collagen. Blood 1987, 69 (2) :570 - 577)或者 H6B4-Fab，人源化单克隆 抗 GPIba 抗体的 Fab 片段（Firbas，C.et al·，Targeting von Willebrand factor and platelet glycoprotein Ib receptor.Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 2010, 8 (12):1689 - 1701)，或者GPG-290、重组的、包含结合至人类IgGl的GPIb α的氨基末端氨基酸I - 290的 嵌合抗体（Yeung, J. &Holinstat，M.，Newer agents in antiplatelet therapy:a review. Journal of Blood Medicine 2012, 3:33 - 42)，或者
[0015] ?生理性GPIb α抑制因子，如，例如，防止GPIb α与凝血酶的结合的抗GPIb α自 身抗体，或者
[0016] ?升高的糖萼蛋白浓度，其与GPIba蛋白竞争结合至凝血酶，
[0017] 那么，与标准样品相比，复合物的形成减少。
[0018] 因此，本发明提供用于检测样品中GPIb -凝血酶相互作用的调节因子的方法，使 该样品与分离的GPIb α蛋白并且与分离的凝血酶接触，并且确定GPIb α蛋白与凝血酶之 间的复合物的形成。使用的GPIba蛋白是突变的，并且与人类GPIba蛋白的野生型序列 相比，包含至少氨基酸残基1 - 268并且具有在位置233、235、237和239中的至少一个处的 替换 Xaa(SEQ ID N0:1)。
[0019] 有利的是所述方法处理而不需要使用血小板。从动物或者人类血液制备血小板试 剂代价高和不方便并且不能保证始终如一的质量。
[0020] 术语"样品"包括生物液体、尤其来自人类和动物的生物液体，如血液、血浆或者血 清。
[0021] 术语"标准样品"包括参考材料，当其在根据本发明的方法中用作样品时，产生对 应于健康个体的或者健康个体的群体的GPIb-凝血酶相互作用的测定值，该个体或者群 体不具有受GPIb-凝血酶相互作用的调节因子影响的GPIb-凝血酶相互作用。合适的参 考材料是，例如，由体液组成的库，例如来自一般至少20明显健康个体的标准血浆库或者 标准血清库。
[0022] 在根据本发明的方法中使用的GPIba蛋白可以是重组地或者合成地生产的 GPIba蛋白。适于生产重组GPIba蛋白的是已知的原核的或者真核表达系统，如，例 如，在细菌（例如，大肠杆菌（E. coli))中、在酵母（例如，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris))中、在植物、动物或者人类细胞培养 物中表达的。适于生产合成的GPIba蛋白的是用于体外蛋白合成的已知的技术，如，固相 合成（例如，梅里菲尔德（Merrifield)合成法）。优选地，在根据本发明的方法中使用的 GPIba蛋白是重组生产的GPIba蛋白，其是在人类细胞的培养物中、优选地在人类胚肾细 胞（HEK细胞）的培养物中生产的。
[0023] 优选地，以这样的量将GPIba蛋白添加到测定体积中使得获得测定体积中的 0. 5 - 50 μ g/mL GPIb