哺乳动物细胞因子、相关试剂和方法

专利名称：哺乳动物细胞因子、相关试剂和方法
技术领域：
本发明涉及与在控制哺乳动物细胞(例如哺乳动物免疫系统的细胞)生物学和生理学方面起作用的蛋白质相关的组合物以及方法。具体而言，本发明提供可用于例如调节各种细胞类型(包括造血细胞)的活化、发育、分化和功能的纯化基因、蛋白质、抗体、相关试剂和方法。
背景技术：
重组DNA技术一般是指这样的技术，所述技术通过将得自供体源的遗传信息整合到载体中用于后续加工，诸如通过引入到宿主中，由此使所转移的遗传信息在该新环境中复制和/或表达。通常，该遗传信息以互补DNA(cDNA)的形式存在，所述互补DNA衍生自编码所需蛋白产物的信使RNA(mRNA)。该载体通常是一种质粒，该质粒具有将用于随后复制的cDNA加入宿主中的能力，在某些情况下，实际有能力控制该cDNA的表达，并由此指导在该宿主中合成所编码的产物。
一段时间以来，已经知道哺乳动物的免疫应答基于称为“免疫网络”的一系列复杂的细胞相互作用。参见例如Paul，(1998)FundamentalImmunology(第4版)Raven Press，NY。最近的研究已经提供了对该网络内部运作的新的了解。尽管已经清楚许多免疫应答实际上确实围绕淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞和其它细胞的网络样相互作用运转，但免疫学家现在一般坚持这样一种观点称为淋巴因子、细胞因子或单核因子的可溶性蛋白，在控制这些细胞相互作用中起关键作用。因此，人们对细胞调节因子的分离、特征鉴定和作用机制相当感兴趣，对这些信息的了解将导致在许多医学异常(例如免疫系统失调)的诊断和治疗方面取得相当大的进展。这些因子中的某些因子是造血生长因子，例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。参见例如Thomson(1998编辑)TheCytokine Handbook(第3版)Academic Press，San Diego；Mire-Sluis和Thorpe，(1998编辑)CytokinesAcademic Press，San Diego；Metcalf和Nicola(1995)The Hematopoietic Colony Stimulating FactorsCambridgeUniversity Press；和Aggarwal和Gutterman(1991)Human CytokinesBlackwell Pub。免疫系统细胞的细胞因子表达，在免疫应答的调节中起重要作用。大多数细胞因子是多效的，具有多种生物活性，包括抗原呈递、活化、CD4+T细胞亚群的增殖和分化、B细胞的抗体应答和过敏表现。另外，细胞因子可以用于范围广泛的直接或间接涉及免疫系统和/或造血细胞的退行性病症或异常病症的诊断和治疗。
淋巴因子显然以多种方式介导细胞活性。已经表明，它们支持多能造血干细胞的增殖、生长和/或分化为大量的祖细胞(progenitor)，所述祖细胞包括构成复杂的免疫系统的多样化的细胞谱系。所述细胞组分之间正常和平衡的相互作用是健康的免疫应答所必需的。当连同其它因子一起给予淋巴因子时，不同的细胞谱系常常以不同方式应答。
对免疫应答尤为重要的细胞谱系包括两类淋巴细胞B细胞，它们可以产生和分泌免疫球蛋白(具有识别并结合外源物质以实现将其去除的能力的蛋白质)；和各种亚群的T细胞，它们分泌淋巴因子，并诱导或抑制B细胞和构成免疫网络的各种其它细胞(包括其它T细胞)。这些淋巴细胞与许多其它细胞类型相互作用。
根据以上所述，可明显看出，新的淋巴因子(例如与G-CSF和/或IL-6相关的淋巴因子)的发现和研制，可能有助于用于范围广泛的直接或间接涉及免疫系统和/或造血细胞的退行性病症或异常病症的新疗法。特别是，对于增加或增强已知淋巴因子有益活性的淋巴因子的发现和研制应该是非常有利。最初，新基因IL-B30根据其预测的结构被鉴定为潜在的细胞因子，并且被分为象IL-6和G-CSF一样的长链细胞因子(国际专利申请PCT/US98/15423(WO 99/05280)。IL-6和相关细胞因子如制癌蛋白M、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)和cardiothrophin-1对血细胞生成、血小板生成、急性期应答的诱导、破骨细胞生成、神经元分化和存活以及心肥大具有生物活性。IL-B30在小鼠中的转基因表达诱导出与IL-6在小鼠中过量表达后观察到的相似表型，包括发育不良、系统性炎症、不育症和死亡。IL-B30看来是一种参与炎症的新细胞因子。
发明概述本发明部分基于IL-B30(在本文中也称为IL-B30蛋白)的生理学作用及其在免疫应答中作用的发现。特别是，已经阐明了IL-B30在涉及炎症、传染病、血细胞发育(hematopoietic development)和病毒感染的途径中的作用。本发明具体涉及包含IL-12 p40亚基与白介素-B30(IL-B30)组合的组合物及其生物活性。本发明包括编码两种多肽或融合蛋白的核酸、其生产方法和应用。部分根据本发明的核酸与本文所公开的互补DNA(cDNA)序列的同源性和/或根据功能分析，鉴定了本发明的核酸。也提供多肽、抗体和使用它们的方法，包括使用核酸表达法。提供对依赖生长因子生理学或免疫应答的控制进行调节或干涉的方法。
本发明部分基于这样一种发现先前例如在USSN 08/900,905和09/122,443中描述的天然形式的IL-12的p40亚基也与IL-B30细胞因子相关。因此，这两种多肽一起共表达，导致功能性受体结合和信号。
本发明提供多种组合物，所述组合物包含a)一种大致纯的包含得自IL-12 p40的多个至少7个连续氨基酸的不同区段的多肽和一种大致纯的包含得自IL-B30的多个至少7个连续氨基酸的不同区段的多肽；b)一种大致纯的包含得自IL-12 p40的至少11个连续氨基酸的多肽和一种大致纯的包含得自IL-B30的至少11个连续氨基酸的多肽；c)一种大致纯的多肽，所述多肽包含IL-12 p40的多个至少7个连续氨基酸的不同区段和IL-B30的多个至少7个连续氨基酸的不同区段；或d)一种大致纯的多肽，所述多肽包含IL-12 p40的一个至少11个连续氨基酸的区段和IL-B30的一个至少11个连续氨基酸的区段。各种实施方案包括这样的组合物a)其中所述多个至少7个连续氨基酸的不同区段包括一个至少9个连续氨基酸的区段；b)其中所述多个至少7个连续氨基酸的不同区段是两个至少9个连续氨基酸的区段；c)其中所述IL-12 p40的至少11个连续氨基酸的区段至少有15个连续氨基酸；d)其中所述IL-B30的至少11个连续氨基酸的区段至少有15个连续氨基酸；e)还包含一种选自水性化合物的载体，包括水、盐水和/或缓冲液；f)配制用于经口、直肠、鼻、局部或胃肠外给药；或g)所述组合物是无菌组合物。其它实施方案包括那些组合物a)其中所述多肽中的至少一种i)是可检测标记的；ii)是重组产生的；iii)未经糖基化；iv)是变性的；v)连接于固体基质；或vi)与另一化学部分缀合；b)包含一种大致纯的IL-12 p40多肽和一种大致纯的IL-B30多肽；c)包含一种大致纯的含与IL-B30融合的IL-12 p40的多肽；或d)与IL-18、IL-12、放射或化学疗法、免疫佐剂或抗病毒剂联合。试剂盒实施方案包括那些试剂盒，所述试剂盒包括这样一种所述组合物和a)一个包含所述多肽的区室；或b)关于所述试剂盒中试剂的使用或处理的说明。
本发明的核酸组合物包括例如一种分离或重组的核酸，所述分离或重组的核酸编码a)一种大致纯的包含得自IL-12 p40的多个至少7个连续氨基酸的不同区段的多肽和一种大致纯的包含得自IL-B30的多个至少7个连续氨基酸的不同区段的多肽；b)一种大致纯的包含得自IL-12 p40的至少11个连续氨基酸的多肽和一种大致纯的包含得自IL-B30的至少11个连续氨基酸的多肽；c)一种大致纯的多肽，所述多肽包含IL-12 p40的多个至少7个连续氨基酸的不同区段和IL-B30的多个至少7个连续氨基酸的不同区段；或d)一种大致纯的多肽，所述多肽包含IL-12 p40的一个至少11个连续氨基酸的区段和IL-B30的一个至少11个连续氨基酸的区段。各种实施方案包括这样一种核酸a)其中所述多个至少7个连续氨基酸的不同区段包括一个至少9个连续氨基酸的区段；b)其中所述多个至少7个连续氨基酸的不同区段是两个至少9个连续氨基酸的区段；c)其中所述IL-12 p40的至少11个连续氨基酸的区段至少有15个连续氨基酸；d)其中所述IL-B30的至少11个连续氨基酸的区段至少有15个连续氨基酸；e)其中所述IL-12 p40得自灵长类；f)其中所述IL-B30得自灵长类；g)所述核酸是一种表达载体；h)所述核酸还包含一个复制起点；i)所述核酸包含一个可检测标记；j)所述核酸包含合成核苷酸序列；k)所述核酸小于6kb，最好小于3kb；或l)所述核酸得自灵长类。也提供包含所述重组核酸的细胞，包括其中所述细胞是原核细胞、真核细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、小鼠细胞、灵长类细胞或人类细胞。试剂盒实施方案包括那些试剂盒，所述试剂盒包括一种所述核酸和a)一个包含所述核酸的区室；b)一个还包含一种灵长类IL-12 p40多肽的区室；c)一个还包含一种灵长类IL-B30多肽的区室；或d)关于所述试剂盒中试剂的使用或处理的说明。
另一方面，本发明提供一种核酸，所述核酸a)在50℃和低于1M盐的30分钟洗涤条件下与灵长类IL-12 p40的天然成熟编码部分杂交；和b)在50℃和低于1M盐的30分钟洗涤条件下与灵长类IL-B30的天然成熟编码部分杂交。各种实施方案包括这样一种所述核酸，其中a)用于IL-12 p40的所述洗涤条件是60℃和低于400mM的盐；b)用于IL-B30的所述洗涤条件是60℃和低于400mM的盐；c)所述核酸在一个至少50个核苷酸的序列段内表现出与编码灵长类IL-12p40的序列有同一性；和/或d)所述核酸在一个至少50个核苷酸的序列段内表现出与编码灵长类IL-B30的序列有同一性。优选实施方案包括这样一种核酸，其中a)用于IL-12 p40的所述洗涤条件是65℃和低于150mM的盐；b)用于IL-B30的所述洗涤条件是65℃和低于150mM的盐；c)所述核酸在一个至少90个核苷酸的序列段内表现出与编码灵长类IL-12 p40的序列有同一性；和/或d)所述核酸在一个至少90个核苷酸的序列段内表现出与编码灵长类IL-B30的序列有同一性。
提供与例如TNFα拮抗剂、IL-12拮抗剂、IL-10或类固醇联合的所述IL-12 p40/IL-B30组合物的拮抗剂。
本发明也提供一种结合化合物，例如包含得自一种抗体的抗原结合部位的结合化合物，所述结合化合物与所述的IL-12 p40/IL-B30组合物特异性地结合，但不与或者IL-12 p40或IL-B30多肽特异性地结合，所述组合物，a)包含一种大致纯的多肽，所述多肽包含大致纯的IL-12 p40多肽和一种大致纯的IL-B30多肽；或b)包含一种大致纯的多肽，所述多肽包含与IL-B30融合的IL-12 p40。其它结合化合物包括那些化合物，其中a)所述结合化合物在一个容器中；b)所述结合化合物是Fv、Fab或Fab2片段；c)所述结合化合物与另一化学部分缀合；或d)所述抗体i)是针对IL-12 p40/IL-B30组合物产生的；ii)是经免疫选择的；iii)是一种多克隆抗体；iv)表现出与抗原的Kd至少为30mM；v)连接于固体基质，包括微珠或塑料膜；vi)处于无菌组合物中；或vii)是可检测标记的，包括放射性标记或荧光标记。某些优选形式包括组合物，所述组合物包含a)一种无菌结合化合物，如已描述的；或b)所述结合化合物和一种载体，其中所述载体是i)一种水性化合物，包括水、盐水和/或缓冲液；和/或ii)配制用于经口、直肠、鼻、局部或胃肠外给药。另外，提供试剂盒实施方案，所述试剂盒包括所述结合化合物和a)一个包含所述结合化合物的区室；或b)关于所述试剂盒中试剂的使用或处理的说明。
此外，本发明提供生产抗原抗体复合物的方法，所述方法包括在合适条件下使灵长类IL-12 p40/IL-B30组合物与一种所述结合化合物接触，由此让所述复合物形成。各种方法包括那些方法，其中a)从其它细胞因子中纯化所述复合物；b)从其它抗体中纯化所述复合物；c)所述接触是与包含一种细胞因子的样品接触；d)所述接触使得可以定量检测所述抗原；e)所述接触是与包含所述抗体的样品接触；或f)所述接触使得可以定量检测所述抗体。
本发明也提供调节细胞或组织的生理学或发育的方法，所述方法包括使所述细胞与IL-12 p40/IL-B30组合物或其拮抗剂接触。一种优选方法是调节细胞的生理学或发育的方法，所述方法包括使所述细胞与IL-12 p40/IL-B30组合物接触，并且所述接触导致IFNγ的产生增加。通常，所述细胞在宿主生物体内，并且所述生物表现出Th1应答增强，例如选自以下的一种效应抗肿瘤效应、佐剂效应、抗病毒效应或拮抗过敏的效应。通常，所述接触与以下联合IL-18、IL-12、放射疗法或化学疗法、免疫佐剂或抗病毒治疗剂。
在另一实施方案中，所述拮抗剂是抗IL-12受体亚基β1的抗体。因此，本发明也包括一种已描述的方法，其中所述接触是与拮抗剂接触，并且所述接触导致IFNγ的产生相对减少。因此，本发明提供调节宿主生物体内细胞生理学或发育的方法，所述方法包括将所述拮抗剂给予所述生物，其中所述接触导致自身免疫病或慢性炎症的缓解。
对所述两种亚基相关性的鉴定，提供了增加以下物质分泌的方法a)一种灵长类IL-B30，这种方法包括表达所述多肽与IL-12 p40；或b)一种灵长类IL-12 p40，这种方法包括表达所述IL-12 p40与IL-B30。最好是，或者a)所述增加是增加至少3倍；或者b)所述表达是表达一种编码IL-B30和IL-12 p40的重组核酸。
提供筛选结合所述IL-12 p40/IL-B30组合物的受体的方法，例如所述方法包括使所述复合物与表达所述受体的细胞在允许所述复合物与所述受体结合的条件下接触，由此形成一种可检测的相互作用。最好是，所述相互作用导致所述细胞内的一种生理学反应。
本发明也提供调节动物体内白细胞运输或激活的方法，所述方法包括使所述动物体内的单核细胞/巨噬细胞谱系细胞与治疗量的哺乳动物IL-B30蛋白的激动剂接触；或者与治疗量的哺乳动物IL-B30蛋白的拮抗剂接触。优选实施方案包括其中所述哺乳动物IL-B30蛋白是一种灵长类蛋白质；和/或所述拮抗剂是与哺乳动物IL-B30结合的抗体。某些实施方案包括其中所述单核细胞/巨噬细胞谱系细胞包括小神经胶质细胞或树突细胞，或其中所述动物表现出炎症、白细胞增生性病症、神经变性性病症或创伤后病症的体征或症状。优选实施方案包括其中所述体征或症状是在肺组织、肝组织、神经组织、淋巴组织、骨髓组织、胰腺、胃肠组织、甲状腺组织、肌肉组织或皮肤或白纤维组织中。
其它方法包括其中所述调节是抑制白细胞的功能；和/或其中所述给予是给予所述激动剂。所述激动剂最好是哺乳动物IL-B30。
某些实施方案包括其中所述动物正经历以下病症的体征或症状自身免疫、炎症、组织特异性自身免疫、变性性自身免疫、类风湿性关节炎、骨关节炎、动脉粥样硬化、多发性硬化、脉管炎、迟发型过敏反应、皮肤移植、移植、脊柱损伤、中风、神经变性、传染病、局部缺血、癌症、肿瘤、多发性骨髓瘤、Castleman病、绝经后骨质疏松或IL-6相关病症。所述给药可以与以下药物联合给予抗炎细胞因子激动剂或拮抗剂、镇痛药、消炎药或类固醇。
提供各种其它方法，其中所述调节是增强所述白细胞的功能和/或所述给予是给予所述拮抗剂。所述拮抗剂最好是一种与哺乳动物IL-B30结合的抗体；或所述哺乳动物IL-B30的一种突变蛋白，所述突变蛋白与所述哺乳动物IL-B30竞争与IL-B30受体的结合，但基本上没有信号。在各种实施方案中，所述方法适用于所述动物经历伤口愈合或凝血块形成的体征或症状的情况。所述给药通常与以下联合一种血管生成因子；一种生长因子，包括FGF或PDGF；一种抗生素；或一种凝血因子。
最后，本发明提供通过给予IL-B30或其激动剂诱导记忆T细胞增殖的方法。
优选实施方案的详细描述本文引用的所有参考文献均通过引用结合到本文中，其程度与具体而单独地表明每个单独的出版物或专利申请通过引用结合到本文中的程度一样。
大纲I.一般描述II. 纯化的IL-12 p40/IL-B30复合物A. 物理特性B. 生物特性III. 物理变异体A. 序列变异体、片段B. 翻译后变异体1.糖基化2.其它IV. 功能变异体A. 类似物、片段1.激动剂2.拮抗剂B. 模拟物1.蛋白质2.化学药品C. 物种变异体V.抗体A. 多克隆抗体B. 单克隆抗体C. 片段、结合组合物VI. 核酸A. 天然分离物；方法B. 合成基因C. 分离方法VII.制备p40/IL-B30复合物、模拟物A.重组方法B.合成方法C.天然纯化VIII.应用A.诊断应用B.治疗应用IX. 试剂盒A.核酸试剂B.蛋白试剂C.抗体试剂X. 分离p40/IL-B30复合物的受体I.一般描述本发明提供有关使哺乳动物蛋白质配对以制备可溶性细胞因子的描述和内容，所述可溶性细胞因子例如可以在免疫细胞或其它细胞之间介导信号的分泌型分子。参见例如Paul，(1998)FundamentalImmunology(第4版)，Raven Press，N.Y.。某些可溶性因子由异源二聚体多肽构成，例如IL-6和IL-12。有可能是生理学形式的二聚体形式以及片段或拮抗剂将可用于例如对表达受体的细胞进行生理调节。包含p40/IL-B30复合物的功能细胞因子有可能对造血细胞有或者刺激效应或者抑制效应，造血细胞包括例如淋巴样细胞，诸如T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、树突细胞、造血祖细胞等。所述蛋白质也可用作抗原，例如免疫原，用于产生针对所述蛋白质各种表位(线性表位和构象表位)的抗体。
IL-12 p40亚基已有描述。参见例如Seiler等，美国专利5547852；Scott和Trinchieri，美国专利5571515；Gately等，美国专利5650492；Liesehke和Mulligan，美国专利5891680；Warne等，美国专利5744132；和登记号gbM86671、gbAF133197、gbU16674、gbU83184、embY07762、embY11129.1、gbM65272、gbAF007576、gbU19841、gbU11815、gbU57752、gbAF004024、gbU49100、gbU19834和embX97019。从人基因组序列中鉴定出编码IL-B30的序列。所述分子命名为huIL-B30。啮齿动物序列例如得自小鼠的序列也有描述。参见例如USSN08/900,905和09/122,443。本发明包括包含这两种多肽(例如p40和IL-B30)组合的组合物以及编码这两种序列的核酸构建体。也提供识别所述组合的抗体以及例如协同产生所述两种信息或多肽的方法。
人IL-B30基因编码一种小的具有约198个氨基酸的可溶性细胞因子样蛋白质。所述psort预测的信号序列可能是大约17个残基，可能从Met至大约Ala。参见表1和SEQ.ID.NO1和2。IL-B30表现出长链细胞因子成员特征性的结构基序。比较可得自GenBank的序列，例如IL-B30、G-CSF和IL-6。也参见USSN 08/900,905和09/122,443。表1得自灵长类(例如人)的编码IL-B30的核酸(SEQ ID NO1)。翻译的氨基酸序列为SEQ ID NO2。ATG CTG GGG AGC AGA GCT GTA ATG CTG CTG TTG CTG CTG CCC TGG ACA 48Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr-21 -20 -15 -10GCT CAG GGC AGA GCT GTG CCT GGG GGC AGC AGC CCT GCC TGG ACT CAG 96Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln-5 1 5 10TGC CAG CAG CTT TCA CAG AAG CTC TGC ACA CTG GCC TGG AGT GCA CAT144Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His15 20 25CCA CTA GTG GGA CAC ATG GAT CTA AGA GAA GAG GGA GAT GAA GAG ACT192Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr30 35 40ACA AAT GAT GTT CCC CAT ATC CAG TGT GGA GAT GGC TGT GAC CCC CAA240Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln45 50 55GGA CTC AGG GAC AAC AGT CAG TTC TGC TTG CAA AGG ATC CAC CAG 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IFNγ激活巨噬细胞，刺激杀肿瘤活性和杀微生物活性。它也调节I类和II类MHC分子的表达，包括正调节单核细胞/巨噬细胞以及树突细胞上的II类分子，以及诱导表皮细胞、内皮细胞和其它细胞上的表达，使得它们能够呈递抗原。所述细胞因子是Th1样细胞因子，它促进Th1样CD4+T细胞的发育，但抑制Th2样T细胞的发育。它是一种对IL-4诱导的B淋巴细胞合成IgE和IgG4的强有力的相对特异性的抑制剂，虽然在较高浓度下它非特异性的抑制所有抗体同种型的产生。IFNγ增强NK细胞和CTL介导的针对细胞内生物和肿瘤的细胞毒性免疫应答。同IL-12一样，IFNγ倾向于促进细胞介导细胞毒性应答，而抑制过敏性炎症和IgE的合成。参见例如Karupiah，(1997编辑)Gamma Interferon in Antiviral DefenseChapman和Hall；Jaffe，(1992编辑)Anti-Infective Applications of Interferon-GammaMarcel Dekker (ISBN0824786882)；Sutterwala等，(1999)J.Leukoc.Biol.65543-551；Billiau等，(1998)Ann.NY Acad.Sci.85622-32；和Gessani等，(1998)CytokineGrowth Factor Rev.9117-123。
IL-B30激动剂或拮抗剂也可以用作功能拮抗剂或受体拮抗剂，例如它们阻断IL-6或IL-12与其相应受体的结合，或介导相反的作用。因此，IL-B30及其拮抗剂可以用于治疗异常医学病症，包括免疫失调，例如T细胞免疫缺陷、慢性炎症或组织排斥，或用于心血管病症或神经生理学病症。激动剂有可能用于增强细胞介导免疫的治疗方面，例如用于抗肿瘤、辅助剂(adjuvant)和抗病毒情况，或拮抗过敏反应。拮抗剂有可能用于阻断这类增强的免疫，例如用于细胞引起自身免疫病或慢性炎症的情况下。
天然抗原能够介导导致靶细胞中生物应答或生理应答的各种生物化学应答。优选的实施方案可能来自人类，但在自然界中存在其它灵长类或其它物种的对应物。其它哺乳动物物种(例如灵长类、犬科动物、猫科动物和啮齿动物)中的其它蛋白质的序列也应该可利用。
特别是，已经证实了IL-12 p40亚基与IL-B30的相关性。IL-12 p40分子和IL-B30分子应该是一起进化的。假如这两种分子在功能上相关，则它们可能以IL-12的方式一起作用。参见例如Trinchieri(1998)Adv.Immunol.7083-243；Gately等，(1998)Ann.Rev.Immunol.16495-521；和Trinchieri(1998)Int.Rev.Immunol.16365-396。
然而，作为复合物，预期所述复合物与该细胞因子受体家族的两个tall信号受体相互作用。这在IL-12受体亚基β1的情况下已得到证实。可以测试其它相关受体与所述可溶性复合物的结合。已经构建了稳定表达各种这些能够进行信号转导的tall受体的一系列细胞，例如BAF/3。
IL-12 p40和IL-B30(或单一的组合构建体)在同一细胞中的转染子的上清液，用来测试这些不同细胞，以观察是否有增殖性应答或其它信号应答。就这一点而论，所述细胞因子的大多数生理效应可能是由于所述蛋白质的复合物所致。因此，以下有关由所述细胞因子引起的生物学描述中的许多，可能实际上是包含所述亚基组合的复合物在生理上实现的。
以下的描述也适用于IL-12 p40/IL-B30复合物。构建了IL-12 p40亚基与所述IL-B30的融合体，例如超IL-6(hyper IL-6)。参见例如Fischer等，(1997)Nature Biotechnol.15142-145；Rakemann等，(1999)J Biol. Chem.2741257-1266；和Peters等，(1998)J.Immunol.1613575-3581；所述文献通过引用结合到本文中。此外，所述细胞因子复合物与包含IL-12受体亚基β1的受体的匹配，使得可以将抗该亚基的抗体鉴定为所述细胞因子复合物受体的拮抗剂。II.纯化的p40/IL-B30复合物人IL-B30的氨基酸序列作为一个实施方案示于SEQ ID NO2中。可以用采用所提供的序列的标准方法，例如PCR技术或通过杂交，分离其它天然存在的编码该蛋白的核酸。在提供所述细胞因子亚基的序列信息以便于鉴别该蛋白抗原与其它蛋白并例举多种变异体方面，这些从氨基至羧基提供的氨基酸序列是重要的。此外，所述肽序列使得可以制备肽，以产生识别区段的抗体，而核苷酸序列使得可以制备寡核苷酸探针，这两种都是用于检测或分离例如克隆编码这种序列的基因的策略。
当用于蛋白质方面时，本文所用的术语“人可溶性IL-B30”’将包括其氨基酸序列相应于得自SEQ ID NO2的可溶性多肽的蛋白质。其有效片段(significant fragment)通常保留相似的功能，例如抗原性。优选实施方案包括特定长度的多个不同的(例如非重叠)区段。通常，所述多个为至少2个、更通常为至少3个、优选5个、7个或甚至更多个。尽管可以列举最小的长度，但更长的各种大小的长度也可能是合适的，例如一个7个氨基酸长度的区段和两个12个氨基酸长度的区段。相似的特征适用于IL-12 p40多肽，也适用于任一种或这两种的多核苷酸。
例如抗体的结合组分通常以高亲和性与IL-12 p40/IL-B30复合物结合，所述高亲和性例如至少约100nM，通常优于约30nM，优选优于约10nM，更优选优于约3nM。在非人类的哺乳动物物种(例如其它灵长类、有蹄类动物或啮齿动物)中会发现相应蛋白(counterpart protein)复合物。例如鸟类或两栖类的非哺乳动物物种也应该具有结构上或功能上相关的基因和蛋白。
本文所用的术语“多肽”包括有效片段或区段，包括一段至少约8个氨基酸的氨基酸残基序列段，一般至少约12个氨基酸，通常至少约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，在特别优选的实施方案中，为至少约30个或30个以上的氨基酸，例如35、40、45、50个氨基酸等。在或者所述IL-B30或IL-12 p40亚基的所有实际的组合中，这类片段可以具有实际上在所有位置开始和/或结束的末端，例如于残基1、2、3等开始，和于例如残基175、174、173等结束。特别感兴趣的肽具有相应于结构域边界的末端，例如所述IL-B30的螺旋A、B、C和/或D或IL-12 p40的Ig结构域。参见下文。
术语“结合组合物”是指与IL-12 p40/IL-B30复合物特异性地结合(例如在抗体-抗原相互作用中)、但不与单独的所述各个组分特异性结合的分子。特异性的范围可以更宽或更窄，例如对特定实施方案具有特异性，或对数组相关实施方案具有特异性，例如对灵长类、啮齿动物具有特异性等。耗竭或吸收可以提供所需的选择性，例如以耗竭与单独的任一种多肽组分结合的抗体。也提供了与IL-12 p40/IL-B30复合物特异性缔合(associate)(或者共价或者非共价的)的化合物，例如蛋白质，包括在天然生理相关的蛋白质-蛋白质相互作用中的特异性缔合。所述分子可以是聚合物或化学试剂。功能类似物可以是具有结构修饰的蛋白质，或者它可以是具有与所述合适结合决定簇相互作用的分子形状的分子。所述化合物可以用作受体结合相互作用的激动剂或拮抗剂，参见例如Goodman等(编辑)，Goodman & Gilman’sThePharmacological Bases of Therapeutics(当前版)Pergamon Press。
例如在蛋白质方面，大致纯通常是指该蛋白没有其它污染蛋白、核酸或来源于所述原始来源生物的其它生物物质。可以用标准方法，通常根据重量分析纯度，纯度通常为至少约40％，一般至少约50％，常常至少约60％，通常至少约80％，优选至少约90％，在最优选实施方案中，纯度至少约95％。通常加入载体或赋形剂。包含大致纯的IL-12p40和IL-B30的组合物将不具有大量的天然与所述两种多肽的复合物不相连的外来多肽。
多肽或片段的溶解性取决于环境和所述多肽。许多参数影响多肽的溶解性，包括温度、电解质环境、所述多肽的大小和分子特征以及所述溶剂的性质。通常，使用所述多肽的温度范围为约4℃至约65℃。使用时的温度常常高于约18℃。对于诊断目的，所述温度通常约为室温或更高的温度，但低于该测定中组分的变性温度。对于治疗目的，所述温度常常为体温，对于人和小鼠而言通常为约37℃，尽管在某些情况下，在原位或体外所述温度可以升高或降低。
所述多肽的大小和结构应该一般为大致稳定状态，通常不是变性状态。在四级结构中所述多肽可以与其它多肽结合，例如以赋予溶解性，或与脂质或去污剂结合。特别是，优选由所述两种多肽结合构成的复合物，如融合组合物。
所述溶剂和电解质通常是为保存生物活性所用类型的生物相容的缓冲液，通常接近生理水性溶剂。所述溶剂常常具有中性pH，通常为约5和10之间，最好为约7.5。在某些情况下，加入一种或多种去污剂，通常为温和的非变性去污剂，例如CHS(胆固醇半琥珀酸酯(cholesteryl hemisuccinate))或CHAPS(3-[3-胆酰氨基丙基)二甲铵基]-1-丙磺酸盐(3-[3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate))，或去污剂的浓度足够低，以致避免显著破坏所述蛋白的结构或生理特性。在其它情况下，可以使用强去污剂实现显著变性。
通常在免疫测定中测定与针对限定免疫原产生的抗体(例如多克隆抗体)特异性结合或特异性免疫反应的IL-B30多肽，所述限定免疫原例如由SEQ ID NO2或其片段的氨基酸序列组成的免疫原、或由SEQ ID NO1产生的多肽。在本发明的范围中包括本文描述的那些核酸序列，包括功能变异体，所述核酸序列编码与针对本文在结构和功能上限定的原型IL-B30多肽产生的多克隆抗体选择性结合的多肽。所述免疫测定通常使用针对例如含SEQ ID NO2蛋白的复合物产生的多克隆抗血清。选择或耗竭这种抗血清，以便使其对合适的其它密切相关家族成员(最好是得自同一物种的)的交叉反应性低，并且在用于免疫测定之前通过免疫吸收或耗竭，除去任何这类交叉反应性。特别是，与单独的IL-12 p40或IL-B30多肽结合的抗体是免疫耗竭的靶。也可以分离和鉴定合适的选择性血清制剂。
为了产生用于免疫测定的抗血清，如本文所述分离出包含所述蛋白质(例如SEQ ID NO2的蛋白质)的复合物(compls)。例如，可以在哺乳动物细胞系中产生重组蛋白。用包含SEQ ID NO2蛋白的复合物，采用标准佐剂例如弗氏佐剂和标准的小鼠免疫方案(参见Harlow和Lane)，免疫合适的宿主，例如小鼠近交品系，如Balb/c。或者，可以将衍生自本文所公开序列的基本全长的合成肽构建体用作免疫原。收集多克隆血清，并且在免疫测定中测定针对所述免疫原蛋白的效价，所述免疫测定例如用在固相支持体上固定化的所述免疫原的固相免疫测定，以及进行合适的耗竭或选择。选择效价为104或更高的多克隆抗血清，并且用竞争性结合免疫测定，例如Harlow和lane(参见上文，第570-573页)中描述的竞争性结合免疫测定，测试其针对其它密切相关家族成员(例如LIF、CT-1、CNTF)或IL-6家族其它成员的交叉反应性。最好是在这种测定中结合所述靶使用至少两种个别IL-6/IL-12家族成员。这些长链细胞因子家族成员可以作为重组蛋白产生，并且用本文所述的标准分子生物学技术和蛋白质化学技术将其分离。因此，可以鉴定并产生对IL-12 p40/IL-B30家族成员亚类具有所需选择性或特异性的抗体制剂。或者，可以制备与包含所述IL-12 p40和IL-B30的复合物的融合多肽形式结合的抗体。
竞争性结合形式的免疫测定可以用于交叉反应性的测定。例如，可以将所述融合蛋白固定化至固相支持体上。加入到所述测定中的蛋白质与所述选择性抗血清竞争与固定化抗原的结合。将上述蛋白质与所述选择性抗血清竞争与所述固定化蛋白结合的能力与所述融合蛋白的能力进行比较。采用标准计算法，计算上述蛋白的交叉反应性百分比。选择并合并与上文所列每种蛋白质的交叉反应性低于10％的那些抗血清。然后，通过用以上所列蛋白进行免疫吸收，从合并的抗血清中除去所述交叉反应性选择性抗体。
经免疫吸收和合并的抗血清然后如上文所述用于竞争性结合免疫测定中，以比较第二种蛋白质与所述免疫原融合蛋白。为了进行这种比较，将两种蛋白质在宽范围的浓度下分别进行测定，测定每种蛋白质抑制50％的所述选择性抗血清与固定化融合蛋白结合所需的量。如果第二种蛋白质的所需量低于融合蛋白所需量的2倍，则认为第二种蛋白质与针对所述免疫原产生的选择性抗体特异性地结合。III.物理变异体本发明也包括包含蛋白质或肽的复合物，所述蛋白质或肽与IL-12p40/IL-B30抗原的氨基酸序列具有大致氨基酸序列同一性。所述变异体包括物种变异体、多态变异体或等位基因变异体。
通过使残基匹配最优化，必要时，根据需要引入空位，测定氨基酸序列的同源性或序列同一性。也参见Needleham等(1970)J.Mol.Biol.48443-453；Sankoff等，(1983)Time Warps，String Edits，andMacromolecules；The Theory and Practice of Sequence Comparison的第1章，Addison-Wesley，Reading，MA；和IntelliGenetics(Mountain View，CA)的软件包；和the University of Wisconsin Genetics Computer Group(Madison，WI)的软件包。当将保守取代认为是匹配时，序列同一性会有所变化。保守取代通常包括以下组内的取代甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。保守性可以应用于生物学特征、功能特征或结构特征。同源的氨基酸序列通常计划包括蛋白质序列中的天然多态或等位基因变异和种间变异。典型的同源蛋白或肽与所述IL-B30的氨基酸序列的同一性将从25-100％(如果可以引入空位)至50-100％(如果包括保守取代)。同一性的测量结果将至少为约35％，一般至少为约40％，常常至少为约50％，典型的至少为约60％，通常至少为约70％，优选至少为约80％，而更优选至少为约90％。
通过核苷酸置换、核苷酸缺失、核苷酸插入和短的核苷酸序列段倒位，可以容易地修饰分离的IL-12 p40或IL-B30 DNA。这些修饰产生编码这些抗原、其衍生物或具有相似生理、免疫原性、抗原性或其它功能活性的蛋白质的新的DNA序列。这些经修饰的序列可以用来产生突变抗原，或增强表达。增强的表达可以包括基因扩增、转录增加、翻译增加和其它机制。“突变IL-B30”包括这样的多肽，它们在其它方面属于以上提出的IL-B30的序列同一性定义内，但其氨基酸序列无论由于缺失、置换，还是由于插入，均不同于通常在自然界中发现的IL-B30的氨基酸序列。这通常包括与具有SEQ ID NO2序列的蛋白质具有显著同一性、并且与那些序列享有各种生物活性(例如抗原性或免疫原性)的蛋白质，在优选实施方案中，包含所公开的天然全长序列的大部分。通常最好使用全长序列，尽管截短的变体也是有用的，同样，通常最需要从天然来源发现的基因或蛋白。相似的概念适用于不同的IL-B30蛋白，特别是在各种温血动物(例如哺乳动物和鸟类)中发现的那些IL-B30蛋白。这些描述一般是指包括各种IL-B30蛋白，但不限于具体论述的特定的灵长类实施方案。
也可以通过插入或缺失氨基酸，进行IL-12 p40或IL-B30诱变。可以产生置换、缺失、插入或任何组合，以得到最终的构建体。插入包括氨基末端或羧基末端的融合。可以于靶密码子进行随机诱变，然后对所表达的突变体筛选所需活性。于序列已知的DNA的预定位点制备置换突变的方法是本领域众所周知，例如通过M13引物诱变或聚合酶链式反应(PCR)技术。参见例如Sambrook等(1989)；Ausubel等(1987和增补本)；和Kunkel等(1987)Methods in Enzymol.154367-382。优选实施方案包括例如1重、2重、3重、5重、7重置换等，最好是核苷酸水平或氨基酸水平的保守置换。所述置换最好远离保守的半胱氨酸，通常在远离螺旋结构域的区域中。这种变异体可以用来产生特异性抗体，并且通常享有许多或所有生物学特性。对所述细胞因子结构的识别提供了对于可以被修饰以实现受体相互作用中所需变化的残基的结构和位置的重要的了解。此外，IL-12 p40与IL-B30蛋白的相互作用需要在相互作用表面中的互补结构特性。结构分析将进一步提供对在复合物形成以及复合物与受体相互作用中关键性的表面残基的预测。
本发明也提供重组蛋白，例如采用这些蛋白区段的异源融合蛋白。异源融合蛋白是天然情况下通常不以同一方式融合的蛋白或区段的融合体。相似的概念适用于异源核酸序列。
另外，可以组合来自其它蛋白的相似的功能域而制备新的构建体。例如，可以在不同的新融合多肽或片段之间“交换”靶结合区段或其它区段。参见例如Cunningham等(1989)Science2431330-1336；和O’Dowd等(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992。
由Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.221859-1862描述的亚磷酰胺法将产生合适的合成DNA片段。或者通过合成互补链并使所述链在合适的条件下一起退火，或者通过用DNA聚合酶与合适的引物序列，加入互补链(例如PCR技术)，通常可获得双链片段。
在与细胞因子IL-6家族的比较中，可以将结构分析应用于该基因。该家族包括例如IL-6、IL-11、IL-12、G-CSF、LIF、OSM、CNTF和Ob。人和小鼠IL-B30序列与IL-6家族其它成员的序列比对应该使得能够定义结构特性。特别是，可以用例如RASMOL程序确定β-折叠和α-螺旋残基，参见Bazan等(1996)Nature379591；Lodi等(1994)Science2631762-1766；Sayle和Milner-White(1995)TIBS20374-376；和Gronenberg等(1991)Protein Engineering4263-269。也参见Wilkins等，(1997编辑)Proteome ResearchNew Frontiers inFunctional GenomicsSpringer-Verlay NY。用于置换的优选残基包括预测与受体相互作用的表面暴露的残基。应该保留功能的其它残基将是保守置换，特别是对于远离表面暴露残基的位置。IV.功能变异体对IL-12 p40/IL-B30复合物的生理反应的阻断，可以是由于竞争性抑制所述配体与其受体的结合所致。所述受体的一个亚基的鉴定便于进一步鉴定(如已描述的)抗所述亚基的抗体以及应用所述抗体以阻断与所述复合物的结合和/或信号。
本发明的体外测定通常使用分离的复合物、蛋白质、包含这些蛋白的受体结合区段的可溶性片段、或连接至固相基质的片段。这些测定也将使得可以对或者结合区段突变和修饰、或者细胞因子突变和修饰(例如IL-12 p40/IL-B30复合物类似物)的效应进行诊断测定。
本发明也设想了使用竞争性药物筛选测定，例如其中抗所述细胞因子复合物的中和抗体或受体结合片段与测试化合物竞争。
IL-12 p40/IL-B30抗原的“衍生物”包括天然存在形式的氨基酸序列突变体、糖基化变异体、以及与其它化学部分的共价或聚集缀合物。例如通过采用标准方法将官能团(functionality)与在IL-12 p40/IL-B30复合物氨基酸侧链或于N末端或C末端发现的基团连接，可以制备共价衍生物。参见例如Lundblad和Noyes(1 988)Chemical Reagents forProtein Modification，第1-2卷，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL；Hugli(1989编辑)Techniques in Protein Chemistry，Academic Press，San Diego，CA；和Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking，CRC Press，Boca Raton，FL。
具体地说，糖基化改变包括例如通过在多肽合成和加工期间、或在进一步加工步骤中修饰多肽糖基化模式而造成的糖基化改变。参见例如Elbein(1987)Ann.Rev.Biochem.56497-534。也包括具有相同一级氨基酸序列、具有其它微小修饰的肽形式，所述微小修饰包括磷酸化氨基酸残基，例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
也提供所述IL-12 p40和IL-B30之间的融合多肽。许多细胞因子受体或其它表面蛋白是多聚体的，例如同二聚体实体，重复构建体可能具有各种优点，包括减轻对蛋白酶剪切的敏感性。典型的实例是报道多肽(例如荧光素酶)与蛋白区段或结构域(例如受体结合区段)的融合体，使得可以容易地确定所述融合配体的存在或位置。参见例如Dull等的美国专利第4,859,609号。其它基因融合配偶体包括细菌β-半乳糖苷酶、trpE、A蛋白、β-内酰胺酶、α淀粉酶、乙醇脱氢酶、酵母α交配因子和检测或纯化标记，诸如His6序列的FLAG序列。参见例如Godowski等(1988)Science241812-816。也提供与其它治疗实体的融合构建体，所述其它治疗实体例如待共同给予的、但可被蛋白酶剪切的治疗实体。
融合肽通常通过或者重组核酸法或通过合成多肽法制备。用于核酸操作和表达的技术一般描述于例如Sambrook等(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual(第2版)，第1-3卷，Cold Spring HarborLaboratory；和Ausubel等(1993编辑)Current Protocols in MolecularBiology，Greene and Wiley，NY。用于多肽合成的技术描述于例如Merrifield(1963)J.Amer.Chem.Soc.852149-2156；Merrifield(1986)Science232341-347；Atherton等(1989)Solid Phase Peptide SynthesisAPractical Approach，IRL Press，Oxford；和Grant(1992)Synthetic PeptidesA User’s Guide，W.H.Freeman，NY。可以将重折叠方法应用于合成蛋白。
本发明也设计了氨基酸序列改变或糖基化改变以外的IL-12 p40或IL-B30蛋白衍生物的应用。这类衍生物可以包括与化学部分或蛋白载体的共价或聚集缀合物。共价或聚集衍生物可用作免疫原、免疫测定中的试剂，或用于诸如亲和纯化结合配偶体(例如其它抗原)的纯化方法中。通过用本领域熟知的方法将IL-12 p40或IL-B30共价结合于诸如溴化氰活化的SEPHAROSE的固相支持体，或通过采用或不采用戊二醛交联而将其吸附至聚烯烃表面上，可以将IL-12 p40或IL-B30固定化，以用于抗IL-12 p40或IL-B30抗体或替代的结合组合物的测定或纯化。所述IL-12 p40、IL-B30或融合蛋白也可以用可检测基团标记，例如用于诊断测定。通过将或者针对多肽或序列组分或互补结合配偶体(例如受体的结合部分)的抗体固定化，可以实现IL-12 p40/IL-B30复合物的纯化。
本发明的溶解的IL-12 p40/IL-B30多肽或片段可以用作免疫原，用于产生特异性结合的抗血清或抗体。经纯化的抗原可以用来筛选单克隆抗体或抗原结合片段，包括天然抗体的抗原结合片段，例如Fab、Fab’、F(ab)2等。经纯化的IL-12 p40/IL-B30抗原也可以用作试剂，以检测对存在水平提高的所述细胞因子复合物应答而产生的抗体，所述细胞因子复合物可以是异常或特定的生理学病症或疾病病症的诊断性指示物(diagnostic)。本发明考虑了针对SEQ ID NO1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列或含所述氨基酸序列的蛋白质片段而产生的抗体。特别是，本发明考虑了对特定结构域(例如所述IL-B30的螺旋A、B、C或D、或IL-12 p40的Ig结构域)具有结合亲和性的抗体或针对所述特定结构域产生的抗体。
本发明考虑了其它密切相关物种变异体的分离。DNA印迹分析和RNA印迹分析将确立相似的遗传实体存在于其它哺乳动物中。有可能IL-B30广布于物种变异体中，例如啮齿动物、兔形目动物、食肉动物、偶蹄类、奇蹄类和灵长类的变异体。
本发明也提供分离一组相关抗原的方法，其中所述相关抗原在结构、表达和功能方面表现出不同和相似性。所述分子的其它不同物种变异体或多态变异体的分离和特征鉴定，将大大促进所述分子许多生理效应的阐明。特别是，本发明提供用于鉴定不同物种中其它同源遗传实体的有用探针。
所述分离的基因将使得可以转化缺乏IL-B30表达的细胞，例如缺乏相应蛋白并表现出阴性背景活性的或者物种类型或者细胞。这应该使得可以与未转化对照细胞相比分析IL-B30的功能。
采用现代分子生物学标准技术，特别是比较相关类别的成员时，剖析影响通过这些抗原介导的各种生理功能的关键结构元件是可能的。参见例如在Cunningham等(1989)Science 2431339-1336中描述的同系物扫描诱变技术；和O’Dowd等(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992和Lechleiter等(1990)EMBO J.94381-4390中所用的方法。
胞内功能有可能涉及受体信号。然而，蛋白内化可以发生在某些情况下，可能发生胞内组分和细胞因子之间的相互作用。通过诱变或直接生化方法，例如交联或亲和法，可以鉴别IL-B30与互作组分相互作用的具体区段。也可应用采用晶体学方法或其它物理方法的结构分析。对信号转导机制的进一步研究，将包括可以通过亲和法或遗传方法(例如突变体的互补分析)分离的结合组分的研究。
我们将继续对IL-B30表达和控制的进一步研究。与所述抗原结合的控制元件应该表现出有差别的生理、发育、组织特异性或其它表达模式。对例如控制元件的上游或下游遗传区很感兴趣。
对所述IL-B30抗原的结构研究将导致设计新的抗原，特别是对该分子表现出激动剂或拮抗剂特性的类似物。这可以与先前描述的筛选方法结合，以分离表现出所需活性谱的抗原。V.抗体可以产生针对其天然存在形式和重组形式的所述p40/IL-B30蛋白各种表位的抗体，所述蛋白包括物种、多态或等位基因变异体和它们的片段。另外，可以产生针对其活性形式或者无活性形式的IL-B30的抗体，所述IL-B30包括天然形式或变性形式。也考虑了抗独特型抗体。
通过用所述抗原的预定片段与免疫原性蛋白的缀合物免疫动物，可以产生针对所述片段的抗体，包括结合片段和单链形式的抗体。从分泌所需抗体的细胞制备单克隆抗体。可以根据与正常或缺陷型IL-B30的结合来筛选这些抗体，或根据例如通过受体介导的激动剂或拮抗剂活性进行筛选。例如由于抗体立体阻断与受体的结合，抗体可以是激动剂或拮抗剂。这些单克隆抗体通常以至少约1mM的KD结合，其结合KD更通常至少约300μM，典型的至少约100μM，更典型至少约30μM，优选至少约10μM，更优选至少约3μM或更好。
本发明的抗体也可用于诊断应用。作为捕获抗体或非中和抗体，可以根据其结合所述抗原而不抑制与受体结合的能力来筛选所述抗体。作为中和抗体，它们可以用于竞争性结合测定。它们也可用于检测或定量测定IL-B30蛋白或其受体。参见例如Chan(1987编辑)ImmunologyA Practical Guide，Academic Press，Orlando，FL；Price和Newman(1991编辑)Principles and Practice of Immunoassay，StocktonPress，N.Y.；和Ngo(1988编辑)Nonisotopic Immunoassay，Plenum Press，N.Y.。交叉吸收或其它试验将鉴定出表现出不同特异性谱(例如特有的或共享的物种特异性)的抗体。
此外，包括抗原结合片段在内的本发明抗体可能是有效的拮抗剂，它们与所述抗原结合，并抑制与例如可能引发生物学反应的受体的功能结合。它们也可以用作非中和抗体，可以将其与毒素或放射性核素偶联，使得当所述抗体与抗原结合时，杀伤例如在其表面表达该抗原的细胞。此外，这些抗体可以或者直接或者借助接头间接缀合于药物或其它治疗剂，可以实现药物导向。
抗原片段可以连接至其它物质上，特别是连接至多肽，作为待用作免疫原的融合或共价连接的多肽。抗原及其片段可以融合或共价连接至多种免疫原，诸如匙孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、破伤风类毒素等。有关制备多克隆抗血清的方法的描述，参见Microbiology，HoeberMedical Division，Harper和Row，1969；Landsteiner(1962)Specificity ofSerological Reactions，Dover Publications，New York；Williams等(1967)Methods in Immunology and Immunochemistry，第1卷，Academic Press，New York；和Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，CSH Press，NY。
在某些情况下，最好从各种哺乳动物宿主制备单克隆抗体，所述哺乳动物宿主诸如小鼠、啮齿动物、灵长类、人类等。在例如Stites等(编辑)Basic and Clinical Immunology，(第4版)，Lange MedicalPublications，Los Altos，CA和其中引用的参考文献；Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，CSH Press；Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice(第2版)，Academic Press，New York中；和特别是在Kohler和Milstein(1975)Nature256495-497中(该文献论述了产生单克隆抗体的一种方法)，可以找到有关制备这类单克隆抗体的技术的描述。
其它合适的技术涉及将淋巴细胞体外暴露于抗原性多肽，或者暴露于噬菌体或相似载体中抗体文库的选择。参见Huse等(1989)“在噬菌体λ中产生免疫球蛋白所有组成组分的大联合文库”，Science2461275-1281；和Ward等(1989)Nature341544-546。本发明的多肽和抗体可以经修饰或不经修饰而使用，包括嵌合抗体或人源化抗体。通常通过或者共价或者非共价连接提供可检测信号的物质，标记所述多肽和抗体。种类繁多的标记和缀合技术是已知的，并且在科学文献和专利文献中有广泛的报道。合适的标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁性微粒等。指出这类标记应用的专利包括美国专利第3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241号。也可以产生重组免疫球蛋白，参见Cabilly的美国专利第4,816,567号；Moore等的美国专利第4,642,334号；和Queen等(1 989)Proc.Natl Acad.Sci.USA8610029-10033。
本发明的抗体也可以用于分离所述蛋白的亲和层析。可以制备其中将所述抗体连接至固相支持体的柱子。参见例如Wilchek等(1984)Meth.Enzymol.1043-55。相反，可以用蛋白质耗竭或交叉吸收，以选择性地制备特异性结合组合物。
针对每种IL-B30产生的抗体也可以用来产生抗独特型抗体。这些抗体可用于检测或诊断与所述相应抗原表达相关的各种免疫学病症。VI.核酸所述肽序列和相关试剂可用于例如从天然来源检测、分离或鉴定编码IL-12 p40和IL-B30两者的DNA克隆。通常，这可用于从哺乳动物分离基因，相似的方法将适用于分离来自其它物种的基因，所述其它物种例如温血动物，诸如鸟类和哺乳动物。交叉杂交将使得可以从同一物种分离(例如多态变异体)或从其它物种分离IL-12 p40或IL-B30。许多不同方法可用来成功地分离合适的核酸克隆。这类基因使得可以构建共表达构建体或融合构建体。
纯化的蛋白或多肽可用于通过标准方法产生抗体，如上所述。可以将合成肽或纯化蛋白呈递给免疫系统，以产生单克隆或多克隆抗体。参见例如Coligan，(1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene；和Harlow和Lane，(1989)AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press。
例如，特异性结合组合物可以用来筛选由表达IL-12 p40和IL-B30两者的细胞系制备的表达文库。可以通过各种染色或免疫荧光方法，进行胞内表达的筛选。结合组合物可以用来亲和纯化或分选出表达表面融合蛋白的细胞。
所述肽区段也可以用来选择或鉴定合适的寡核苷酸，以筛选文库。可以用所述遗传密码选择可用作筛选探针的合适的寡核苷酸。参见例如GenBank和SEQ ID NO1。与聚合酶链式反应(PCR)技术结合，合成寡核苷酸将可用于从文库选择正确的克隆。互补序列也可以用作探针、引物或反义链。各种片段应该是特别有用的，例如与锚定载体或poly-A互补PCR技术或与其它肽的互补DNA偶联。
本发明考虑了使用分离的DNA或片段，以编码相应IL-12 p40和IL-B30多肽的生物活性复合物，特别是缺乏编码所述序列非翻译部分的部分。另外，本发明包括编码生物活性融合蛋白或多肽、并且能够在合适条件下与本文所述DNA序列杂交的分离或重组的DNA。所述生物活性蛋白或多肽可以是完整的抗原或片段，并且具有公开于例如SEQ ID NO2的氨基酸序列，特别是成熟的分泌型多肽。此外，本发明包括其编码的蛋白表现出与分泌型IL-12 p40/IL-B30复合物具有高度同一性的分离的或重组的DNA或其片段的应用。所述分离的DNA可以在5’侧翼和3’侧翼具有相应的调节序列，例如启动子、增强子、poly-A添加信号和其它序列。或者，通过将编码区段有效连接至异源启动子，例如通过将启动子插入内源基因上游，可以实现表达。参见例如Treco等，WO96/294 11或USSN 08/406,030。
“分离的”核酸是基本上与天然伴随天然序列的其它外来组分(例如来自起源物种的核糖体、聚合酶和/或侧翼基因组序列)分离的核酸，例如RNA、DNA或混合聚合物。该术语包括已经从其天然存在的环境中取出的核酸序列，包括重组的或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。大致纯的分子包括分离形式的所述分子，例如不同于分离的染色体的分离形式。一般而言，所述核酸在载体或小于约50kb的片段中，所述片段常常小于约30kb，通常小于约10kb，最好小于约6kb。
分离的核酸一般是分子的均一组合物，但在某些实施方案中，将含有少量异质性。这种异质性通常发现于所述聚合物末端或对于所需生物功能或活性不重要的部分。
“重组的”核酸或者根据其生产方法或者根据其结构来定义。根据其生产方法，重组核酸例如是通过应用重组核酸技术的方法产生的产物，所述重组技术例如涉及在所述核苷酸序列中人的干涉，通常为人工选择或人工产生。或者，它可以是通过产生包含天然相互不相邻的两种片段的融合体的序列而制备的核酸，但是指排除天然产物，例如天然存在的突变体。因此，例如，包括通过用任何非天然存在的载体转化细胞而制备的产物，也包括包含用任何合成寡核苷酸方法所衍生序列的核酸。通常进行这样一种方法，以使一个密码子被编码同一种氨基酸或保守氨基酸的丰余密码子取代，通常同时引入或去除一个序列识别位点。
或者，进行该方法，以将所需功能的核酸区段连接在一起，以产生包括所需功能组合的单一的遗传实体，其中所述功能组合是未在通常可得到的天然形式中发现的组合。限制性酶的识别位点常常是这类人工操作的靶，但可以通过设计，加入其它位点特异性靶，例如启动子、DNA复制位点、调节序列、控制序列或其它有用的特征。相似的概念将用于重组(例如融合)多肽。具体包括合成的核酸，它由于遗传密码的丰余性而编码与这些抗原片段相似的多肽；和来自各种不同物种或多态变异体的序列的融合体。
在核酸方面，有效“片段”是一连续的区段，它至少为大约17个核苷酸，一般至少为约22个核苷酸，常常至少为约29个核苷酸，更通常至少约35个核苷酸，典型至少为约41个核苷酸，通常至少为约47个核苷酸，更优选至少为约55个核苷酸，在特别优选的实施方案中，将至少为约60个或更多个核苷酸，例如67、73、81、89、95个等，包括上百和/或上千个核苷酸。
编码IL-B30蛋白的DNA对于鉴定编码相关或相似蛋白的基因、mRNA和cDNA种类、以及鉴定编码来自不同物种的同源蛋白的DNA特别有用。在包括灵长类、啮齿动物、犬科动物、猫科动物和鸟类在内的其它物种中会有同系物。各种IL-B30蛋白应该是同源的，在本文中包括这些蛋白。然而，如果这些序列的同源性足够大，则甚至可以在合适条件下采用这些序列，容易地分离与所述抗原进化关系更遥远的蛋白。灵长类IL-B30蛋白特别有价值。同IL-12 p40一样，所述蛋白是所述融合构建体或联合组合物的主要的靶。
得自基因组序列(例如含有内含子)的重组克隆，将可用于转基因研究，包括例如转基因细胞和生物，也可以用于基因治疗。参见例如Goodnow，(1992)“转基因动物”，Roitt(编辑)Encyclopedia ofImmunology，Academic Press，San Diego，第1502-1504页；Travis，(1992)Science2561392-1394；Kuhn等，(1991)Science254707-710；Capecchi(1989)Science2441288；Robertson，(1987编辑)Teratocarcinomas andEmbryonic Stem CellsA Practical Approach，IRL Press，Oxford；和Rosenberg，(1992)J.Clinical Oncology10180-199。
在核酸序列比较方面，大致同源性例如同一性是指当进行比对时，或者所述区段或者其互补链，在插入或缺失适当的核苷酸进行最佳比对时，至少大约50％的核苷酸相同，相同的核苷酸一般至少为约58％，经常至少为约65％，常常至少为约71％，典型至少为约77％，通常至少为大约85％，优选至少为大约95％至98％或更多，而在特定实施方案中，高达大约99％或更多的核苷酸相同。或者，当所述区段在选择性杂交条件下与一条链或其互补链杂交时，存在着大致同源性，一般使用IL-12 p40和/或IL-B30的序列，例如SEQ ID NO1中的序列。通常，当在一段至少大约30个核苷酸的序列段中有至少大约55％同一性时，将发生选择性杂交，优选在约25个核苷酸的序列段中同一性至少为大约75％，最优选在约20个核苷酸中同一性至少为大约90％。参见Kanehisa，(1984)Nuc.Acids Res.12203-213。如上所述的同一性比较的长度可以为更长的序列段，在某些实施方案中为一段至少为大约17个核苷酸、一般至少为大约28个核苷酸、通常至少为大约40个核苷酸、优选至少为大约75-100个或更多的核苷酸的序列段。
关于杂交方面的同源性，严格条件将是通常在杂交反应中控制的盐、温度、有机溶剂和其它参数的严格性的组合条件。严格性温度条件通常包括超过大约30℃的温度，通常为超过大约37℃的温度，典型的为超过大约55℃的温度，更典型为超过大约60℃或65℃的温度，优选为超过大约70℃的温度。严格性的盐条件一般为低于大约1000mM，通常低于大约400mM，典型的低于大约250mM，优选低于大约150mM，包括约100、50或甚至20mM。然而，参数的组合比任何单个参数的测量值重要得多。参见例如，Wetmur和Davidson，(1968)J.Mol.Biol.31349-370。严格条件下的杂交得到的本底应该是本底的至少2倍，最好至少3-5倍或更高。
对于序列比较，通常一个序列用作参比序列，将测试序列与其比较。当使用一种序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入计算机中，必要时指定亚序列坐标，并且指定序列运算规则程序的参数。然后，该序列比较算法根据指定的程序参数，计算测试序列相对于参比序列的序列同一性百分率。
可以用如下进行用于比较的序列的光学序列比对(opticalalignment)例如用Smith和Waterman，(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源性算法、用Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性序列比对算法、通过Pearson和Lipman，(1988)Proc.Natl Acad.Sci.USA852444的相似性搜索方法、通过计算机实现这些算法(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)、或通过目测检查(一般参见Ausubel等，见上文)。
有用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP采用渐进成对序列比对创建一组相关序列的多序列比对，以显示关系和序列同一性的百分率。它也绘出一个进化树或分枝图(dendrogram)，显示用来产生所述序列比对的成簇关系。PILEUP采用Feng和Doolittle，(1987)J.Mol.Evol.35351-360的渐进序列比对法的简化方法。所用的方法类似于Higgins和Sharp，(1989)CABIOSS151-153描述的方法。该程序可以对多达300个序列进行比对，每个序列的最大长度为5,000个核苷酸或氨基酸。多序列比对法以两个最为相似的序列的成对序列比对开始，产生一个聚类的(a cluster of)双重比对序列。然后将该聚类与下一个最为相关的序列或下一聚类比对序列进行序列比对。通过简单地扩展两个单独序列的成对序列比对，对两个聚类序列进行序列比对。通过一系列渐进成对序列比对，得到最终的序列比对。通过指定特定序列以及序列比较区的其氨基酸或核苷酸坐标，并且指定该程序的参数，运行该程序。例如，可以将参比序列与其它测试序列比较，以采用以下参数测定序列同一性关系的百分率默认空位加权值(default gap weight)(3.00)、默认空位长度加权值(default gap length weight)(0.10)和加权末端空位(weighted end gaps)。
适用于测定序列同一性和序列相似性百分率的算法的另一实例是BLAST算法，该算法在Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215403-410中有描述。公众可从National Center for Biotechnology Information(httpwww.ncbi.nlm.nih.gov/)得到进行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过在查询序列中鉴别长度为W的短字串，来鉴定高分值序列对(HSP)，当与一数据库序列中相同长度的字进行比对时，它们或者匹配，或者满足某一正的最低分值T。T称为邻近字串最低分值(Altschul等，参见上文)。这些起始的邻近字串选中用作种子，起始搜索以寻找含所述字串选中的较长的HSP。然后，只要累积比对分值可以增加，则将所述字串选中沿每个序列在两个方向上延伸。在以下情况下每个方向上所述字串选中的延伸停止累积比对分值从其最大所得值下降了数量X；由于累积了一个或多个负分值的残基比对，累积分值转为零或零以下；或达到任一序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定了该序列比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用时，默认字长(W)为11，BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.NatlAcad.Sci.USA8910915)序列比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，并且比较两条链。
除计算序列同一性百分率外，BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl Acad.Sci.USA905873-5787)。BLAST算法提供的相似性的一种测量是最小和概率(P(N))，这提供偶然发生两个核苷酸序列或氨基酸序列之间匹配的概率的指标。例如，如果在测试核酸与参比核酸的比较中，最小和概率低于约0.1，更优选低于约0.01，最优选低于约0.001时，认为该核酸与参比序列相似。
两个多肽的核酸序列大致相同的再一指标是第一种核酸编码的多肽与第二种核酸编码的多肽免疫交叉反应，如以下所述。因此，例如在一种多肽与第二种多肽仅由于保守取代而不同时，这两种多肽通常是大致相同的。两个核酸序列大致相同的另一指标是所述两种分子在严格条件下相互杂交，如下所述。
通过密切相关物种的交叉物种杂交，可以克隆并分离来自其它哺乳动物物种的IL-B30。在远缘物种之间的同源性可能相对低，因此最好是相对密切相关的物种的杂交。或者，表现出物种特异性较低的抗体制备物的制备，可用于表达克隆方法中。VII.制备p40/IL-B30组合；模拟物通过化学合成、筛选cDNA文库或筛选由种类繁多的细胞系或组织样品制备的基因组文库，可以获得编码所述IL-12 p40或IL-B30或其片段的DNA。参见例如Okayama和Berg，(1982)Mol.Cell.Biol.2161-170；Gubler和Hoffman，(1983)Gene25263-269；和Glover，(1984编辑)DNA CloningA Practical Approach，IRL Press，Oxford。或者，本文提供的序列提供有用的PCR引物，或使得可以合成制备或用其它方法制备编码IL-12 p40或IL-B30的合适基因；包括天然存在的实施方案。
该DNA可以在种类繁多的宿主细胞中表达，用于合成全长IL-12p40和IL-B30或片段，所述全长IL-12 p40和IL-B30或片段进而可以例如用来产生多克隆或单克隆抗体；用于结合研究；用于构建和表达修饰的分子；和用于结构/功能研究。
本文所用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、整合型DNA片段和能够将DNA片段整合到宿主基因组中的其它载体。参见例如Pouwels等，(1985和增补本)Cloning VectorsA Laboratory Manual，Elsevier，N.Y.；和Rodriguez等，(1988编辑)VectorsA Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses，Buttersworth，Boston，MA。
对于本发明的目的，当DNA序列在功能上相互相关时，则将它们有效连接。例如，如果DNA作为前蛋白表达或参与将多肽导向细胞膜或指导分泌所述多肽，则将前序列(presequence)或分泌前导序列的DNA有效连接至所述多肽。如果启动子控制所述多肽的转录，则将该启动子有效连接至编码序列；如果将核糖体结合位点定位以允许翻译，则将核糖体结合位点有效连接至编码序列。通常，有效连接是指连续的并且符合读框，然而，某些遗传元件诸如阻抑物基因不是邻接的，但仍结合于操纵基因序列，进而控制表达。参见例如Rodriguez等，第10章，第205-236页；Balbas和Bolivar，(1990)Methods inEnzymology18514-37；和Ausubel等，(1993)Current Protocols inMolecular Biology，Greene and Wiley，NY。在此特别感兴趣的是这两种编码序列的共表达。
合适表达载体的代表性实例包括pCDNA1；pCD，参见Okayama等，(1985)Mol.Cell Biol.51136-1142；pMClneo Poly-A，参见Thomas等，(1987)Cell51503-512；和杆状病毒载体，诸如pAC 373或pAC610。参见例如Miller，(1988)Ann.Rev.Microbiol.42177-199。
通常最好在提供特定或限定糖基化模式的系统中表达IL-12 p40和/或IL-B30多肽。参见例如Luckow和Summers，(1988)Bio/Technology647-55；和Kaufman，(1990)Meth.Enzymol.185487-511。
可以将所述IL-12 p40和/或IL-B30或其片段工程改造为连接于细胞膜的磷脂酰肌醇(PI)，但可以通过用磷脂酰肌醇切割酶(例如磷脂酰肌醇磷脂酶-C)处理从细胞膜上去除。这释放出生物活性形式的所述抗原，使得可以用蛋白质化学的标准方法进行纯化。参见例如Low，(1989)Biochim.Biophys.Acta988427-454；Tse等，(1985)Science2301003-1008；和Brunner等，(1991)J.Cell Biol.1141275-1283。
既然已经特征鉴定出所述IL-12 p40和IL-B30，而可以通过合成肽的常规方法制备其片段或衍生物。这些包括诸如在以下文献中描述的方法Stewart和Young，(1984)Solid Phase Peptide Synthesis，PierceChemical Co.，Rockford，IL；Bodanszky和Bodanszky，(1984)The Practiceof Peptide Synthesis，Springer-Verlag，New York；Bodanszky，(1984)ThePrinciples of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，New York；和Villafranca，(1991编辑)Techniques in Protein Chemistry II，Academic Press，SanDiego，Ca。VIII.应用本发明提供可供用于例如IL-12 p40/IL-B30复合物介导的病症或以下在诊断试剂盒描述的本文其它方面描述的诊断应用的试剂。所述基因可以用于司法科学，例如以辨别啮齿动物与人类，或用作辨别表现出差异表达或修饰模式的不同细胞的标记。所提供的组合物在例如体外测定、科学研究以及核酸、多肽或抗体的合成或生产中是有用的试剂。
本发明也提供具有显著经济潜力和/或治疗潜力的试剂。所述IL-12 p40/IL-B30复合物(天然存在的或重组的)、其片段及其抗体与鉴定为对所述复合物或其各个组分具有结合亲和性的化合物，应该可用作教授分子生物学、免疫学或生理学技术的试剂。例如在生产或使用蛋白质、抗体、克隆方法、组织学等的实际实验室练习中，可以用所述试剂制备合适的试剂盒。
所述试剂也可以用于治疗与异常生理学或发育(包括炎症)相关的病症。它们可以用于有关可能与特定治疗策略的成功相关的互作组分存在与否的体外测试。特别是，采用本文提供的组合物，通过合适的治疗方法将可达到对各种例如造血细胞或淋巴细胞生理的调节。参见例如Thomson，(1994编辑)The CytokineHandbook(第2版)AcademicPress，San Diego；Metcalf和Nicola，(1995)The Hematopoietic ColonyStimulating FactorsCambridge University Press；和Aggarwal和Gutterman，(1991)Human CytokinesBlackwell Pub.。
所述细胞因子复合物可以诱导多种IFNγ水平，这一观察结果提供了有用的有关治疗潜力的了解。特别是，IFNγ的产生导致细胞介导免疫的增强。参见例如Paul，(1998)Fundamental Immunology(第4版)Raven Press，NY；和Delves和Roitt(1 998编辑)The Encyclopedia ofImmunologyAcademic Press(ISBN0122267656)。因此，细胞应答的增强可用于增强抗肿瘤活性方面，增强疫苗应答(体液免疫和细胞免疫)，增强抗病毒效应，以及拮抗某些发育窗中的过敏反应。参见例如Rose和Mackay(1998编辑)The Autoimmune Diseases(第3版)Academic Press，San Diego；和Kay，(1997编辑)Allergy and AllergicDiseases Blackwell Science，Malden MA。相反，拮抗剂可用来阻断或防止这类IFNγ的增强，由此降低细胞增强的强度。这些可用于例如自身免疫情况(例如多发性硬化或银屑病)或慢性炎症(例如类风湿性关节炎或炎性肠病)。参见例如Samter等(编辑)Immunological Diseases第1和2卷，Little，Brown and Co.。初步结果提示，在慢性炎症的维持中所述p40/IL-B30的作用更为重要。因此，在最初发生所述病症之后，阻断可能是有效的。
对于这类治疗靶，所述激动剂或拮抗剂将与现有治疗剂(例如炎症的其它调节剂)联合使用。因此，所述激动剂通常将与例如IL-18、IL-12、放射治疗或化学治疗、疫苗佐剂和/或抗病毒治疗剂联合。或者，所述拮抗剂可以与TNFα拮抗剂、IL-12拮抗剂、IL-10和/或类固醇联合。也可以使用所述细胞因子的病毒同系物。
例如，与IL-12 p40/IL-B30异常表达或异常信号相关的疾病或病症，应该是激动剂或拮抗剂的可能靶。所述新细胞因子应该在影响免疫应答(例如炎症和/或自身免疫失调)的造血细胞例如淋巴细胞的调节或发育中起作用。或者，它可能影响血管生理学或发育或神经元作用。相对于所述病症起始或维持的治疗剂的定时给予也可能是重要的。特别是，所述细胞因子复合物应该在不同方面介导所述细胞的细胞因子合成、增殖等。IL-12 p40/IL-B30的拮抗剂，诸如天然存在形式的突变蛋白变异体或封闭性抗体，可以提供一种选择性和有效的阻断免疫应答的方法，以在诸如炎性应答或自身免疫性应答的情况下阻断免疫应答。也参见Samter等，(编辑)Immunological Diseases第1和2卷，Little，Brown and Co.。
治疗应用的具体靶包括例如肺病(哮喘和纤维变性)、EAE模型(它可能是多发性硬化的有用模型)、糖尿病和肠部炎症。有关哮喘参见例如Barnes等，(1998)Mol.Med.Today4452-458；Pauwels等，(1998)Clin.Exp. AllergyAug.28 suppl 31-5；Durham，(1998)Clin.Exp.AllergyJun.28 Suppl 211-16；Leung，(1997)Pediatr.Res.42559-568；Pretolani等，(1997)Res.Immunol.14833-38；Lamkhioued等，(1996)Ann.NY Acad.Sci.796203-208；Erb等，(1996)Immunol.Cell.Biol.74206-208；和Anderson等，(1994)Trends Pharmacol.Sci.15324-332；有关肺纤维化参见例如Coker等，(1998)Eur.Respir.J.111218-1221；和Bienkowski等，(1995)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.209118-140；有关EAE模型(多发性硬化的模型)参见例如Pearson和McDevitt，(1999)Curr.Top.Microbiol.Immunol.23879-122；Miller和Shevach，(1998)Res.Immunol.149753-759；Hoffman和Karpus，(1998)Res.Immunol.149790-794(论述846-847和855-860)；Segal，(1998)Res.Immunol.149811-820(论述850-851和855-860)；Liblau等，(1997)Immunol.Today18599-604；Gold等，(1997)Crit.Rev.Immunol.17507-510；Spack，(1997)Crit.Rev.Immunol.17529-536；和Leonard等，(1997)Crit.Rev.Immunol.17545-553；有关糖尿病参见例如Almawi等，(1999)J.Clin.Endocrinol.Metab.841497-1502；Rabinovitch等，(1998)Biochem.Pharmacol.551139-1149；和Rabinovitch，(1998)Diabetes Metab.Rev.14129-151；和有关肠部炎症参见例如Leach等，(1999)Toxicol.Pathol.27123-133；Braun等，(1999)Curr.Opin.Rheumatol.1168-74；Rugtveit等，(1997)Gastroenterology1121493-1505；Strober等，(1997)Immunol.Today1861-64；和Ford等，(1996)Semin.Pediatr.Surg.5155-159。
P40/IL-B30对记忆激活细胞的刺激导致包括粘着分子在内的表型的改变。在用p40/IL-B30刺激后CD69L高度表达，而CD54显著减少。这些粘着分子表达的改变可能使得可以调节记忆细胞例如通过毛细血管后微静脉(HEV)进入初级和次级淋巴结的T/DC细胞富含区。记忆细胞也被触发变为对IL-12刺激敏感。因此，在抗原诱导IL-12后不久快速产生IFN且其产量高。因此，p40/IL-B30可以通过提高应答速率、增加记忆细胞数或这两者，加速记忆细胞的免疫应答。所述p40/IL-B30可能对记忆细胞具有差别的特异效应，而对原初细胞的效应较低或没有效应。相反，在许多慢性炎症例如类风湿性关节炎、炎性肠病、银屑病等中，所述活动性病灶依赖于记忆性CD45Rb低细胞。因此，拮抗剂可能有效地阻断这种慢性期炎症。
在通过RNA印迹分析表现出产生IL-12 p40和/或IL-B30 mRNA的每种细胞类型中的各种异常病症是已知的。参见Berkow(编辑)TheMerck Manual of Diagnosis and Therapy，Merek & Co.，Rahway，N.J.；Thorn等，Harrison’s Principles of Internal Medicine，McGraw-Hill，N.Y.；和Weatherall等，(编辑)Oxford Textbook of Medicine，Oxford UniversityPress，Oxford。许多其它医学病症和疾病涉及被巨噬细胞或单核细胞活化，许多这些病症和疾病对用本文提供的激动剂或拮抗剂的治疗有反应。参见例如Stites和Terr(1991编辑)Basic and Clinical ImmunologyAppleton和Lange，Norwalk，Connecticut；和Samter等(编辑)，Immunological DiseasesLittle，Brown and Co.。这些医学难题应该易于采用本文提供的组合物预防或治疗。
可以纯化IL-12 p40/IL-B30细胞因子复合物、拮抗剂、抗体等，然后将其给予兽医学患者或人类患者。例如在常规药学上可接受的载体或稀释剂(例如免疫原性佐剂)中，可以将这些试剂联合另外的有效成分或惰性成分以及生理上无毒的稳定剂、赋形剂或防腐剂，用于治疗用途。可以将这些组合物过滤除菌，将这些组合物通过在剂量管制瓶中冻干或贮存于稳定化水性制剂中，以剂量形式放置。本发明也设想了包括非补体结合形式在内的抗体或其结合片段的应用。
可以用IL-12 p40/IL-B30、融合蛋白或其片段进行药物筛选，以鉴定对IL-12 p40/IL-B30具有结合亲和性或对IL-12 p40/IL-B30功能具有其它相关生物学效应的化合物，包括相关组分的分离。然后，可以利用后续的生物测定，确定候选化合物是否具有内在刺激活性，并且是否由此因为它阻断所述细胞因子复合物的活性而成为阻断剂或拮抗剂。同样，具有内在刺激活性的化合物，可以激活所述信号途径，并由此因为它刺激所述细胞因子复合物的活性而成为激动剂。本发明还设想了抗IL-12 p40、IL-B30或所述复合物的封闭性抗体作为拮抗剂的治疗应用和刺激性抗体作为激动剂的治疗应用。该方法应该对于其它IL-12 p40或IL-B30的物种变异体特别有用。
有效治疗所需的试剂量将取决于许多不同的因素，包括给药方法、靶部位、所述患者的生理状况和给予的其它药物。因此，应该逐步增加治疗剂量，以优化安全性和效力。通常，体外所用的剂量可以在原位给予这些试剂有用的量方面提供有用的指南。治疗特定病症的有效剂量的动物试验将提供进一步的人用剂量的预测性指标。例如在Gilman等，(1990编辑)Goodman and Gilman’sThe PharmacologicalBases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press；和Remingon’sPharmaceutical Sciences，第17版，(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Penn中，描述了各种考虑。其中以及下文讨论了给药方法，例如经口、静脉内、腹膜内或肌内给药、透皮扩散和其它给药方法。药学上可接受的载体将包括水、盐水、缓冲液和例如在Merck Index，Merck & Co.，Rahway，New Jersey中描述的其它化合物。通常预计具有合适载体的剂量范围为低于1mM浓度的量，通常低于约10μM浓度，常常低于约100nM，优选低于约10pM(皮摩尔浓度)，最优选低于约1fM(费摩尔浓度)。缓释制剂或缓释装置通常用于持续给药或长期给药。参见例如Langer，(1990)Science2491527-1533。
IL-12 p40、IL-B30、细胞因子复合物、融合蛋白、其片段、其抗体或抗体片段、拮抗剂和激动剂，可以直接给予待治疗宿主，或根据所述化合物的大小，可能最好在给予它们之前，将它们缀合于诸如卵清蛋白或血清白蛋白的载体蛋白。治疗制剂可以以许多常规剂量制剂给予。尽管有可能单独给予所述有效成分，但最好将其作为药用制剂存在。制剂通常包含至少一种以上定义的有效成分与其一种或多种可接受的载体。在与其它成分相容并且对所述患者无害的意义上，每种载体应该是药学上和生理上可接受的。制剂包括适用于经口、直肠、鼻、局部或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)给药的制剂。所述制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以用药学领域熟知的许多方法制备。参见例如Gilman等，(1990编辑)Goodman and Gilman’sThePharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press；和Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，(1990)，Mack PublishingCo.，Easton，Penn.；Avis等，(1993编辑)Pharmaceutical Dosage FormsParenteral Medications，Dekker，New York；Lieberman等，(1990编辑)Pharmaceutical Dosage FormsTablets，Dekker，New York；和Lieberman等，(1990编辑)Pharmaceutical Dosage FormsDisperse Systems，Dekker，New York。本发明的疗法可以与其它药剂结合使用，其它药物诸如其它细胞因子，包括IL-6或G-CSF或其相应的拮抗剂。
天然存在形式和重组形式的本发明IL-B30均尤其可用于能够筛选对所述蛋白有结合活性的化合物的试剂盒和测定方法。最近数年来已经开发了几种自动测定方法，以便使得可以在短时间内筛选数万种化合物。参见例如Fodor等，(1991)Science251767-773，该文献描述了用于测试在固相支持体上合成的多种限定聚合物的结合亲和性的方法。如本发明提供的大量纯化、可溶性IL-12 p40/IL-B30细胞因子复合物的可得性，可以大大促进合适测定的开发。
可以用其它方法来确定IL-12 p40/IL-B30复合物-受体相互作用中的关键残基。可以进行突变分析，例如参见Somoza等，(1993)J.Exptl.Med.178549-558，以确定所述相互作用和/或信号中关键的具体残基。PHD(Rost和Sander，(1994)Proteins1955-72)和DSC(King和Stemberg，(1996)Protein Sci.52298-2310)可以提供对α-螺旋(H)、β-链(E)或卷曲螺旋(coil)(L)的二级结构的预测。螺旋A和D在受体相互作用中通常最为重要的，而D螺旋是更为重要的区域。
例如，一旦已经例如通过四级结构数据确定了所述抗原和/或受体的结构，则通常可以发现拮抗剂。采用纯化的IL-12 p40/IL-B30复合物，由于高度自动化测定方法的开发，对潜在的互作类似物进行测试现在是可能的。特别是，通过采用本文描述的筛选技术，将发现新的激动剂和拮抗剂。特别重要的是发现对一系列IL-12 p40/IL-B30分子具有组合结合亲和性的化合物，例如，可以用作所述细胞因子复合物物种变异体的拮抗剂的化合物。
一种药物筛选方法利用表达IL-20 p40/IL-B30的重组DNA分子稳定转化的真核或原核宿主细胞。可以分离表达与其它分子分离的IL-12p40/IL-B30的细胞。这种有活力形式或固定形式的细胞，可以用于标准结合配偶体的结合测定法。也参见Parce等，(1989)Science246243-247；和Owicki等，(1990)Proc.Natl Acad.Sci.USA874007-4011，该文献描述了测定细胞应答的灵敏方法。
用于药物筛选的另一技术涉及提供对IL-12 p40/IL-B30具有合适结合亲和性的化合物的高通量筛选的一种方法，该技术详细描述于Geysen的欧洲专利申请84/03564，该专利申请公布于1984年9月13日。首先，在例如塑料钉或某些其它合适表面的固体基质上合成大量的不同小肽测试化合物，参见Fodor等，(1991)。然后，使所有钉与溶解的未经纯化、或溶解的纯化p40/IL-B30反应，然后洗涤。下一步涉及测定结合的p40/IL-B30。
合理的药物设计也可以基于所述p40/IL-B30和其它效应物或类似物的分子形状的结构研究。效应物可以是对结合应答而介导其它功能的其它蛋白，或为通常与p40/IL-B30相互作用的其它蛋白，例如受体。用于确定哪些位点与特定的其它蛋白相互作用的一种方法是物理结构测定，例如X射线晶体学或二维NMR技术。这些将为哪些氨基酸残基形成分子接触区(例如针对其它细胞因子-受体模型建模的)提供指南。有关蛋白质结构测定的详细描述，参见例如Blundell和Johnson，(1976)Protein Crystallography，Academic Press，New York。IX.试剂盒本发明也考虑了p40/IL-B30蛋白、其片段、肽和它们的融合产物在用于检测另一p40/IL-B30或结合配偶体存在的多种诊断试剂盒和方法中的应用。通常，所述试剂盒将具有含限定p40、p40/IL-B30或IL-B30肽或基因区段或者识别一种或另一种例如p40/IL-B30融合片段或抗体的试剂的区室。
用于测定测试化合物对IL-12 p40/IL-B30的结合亲和性的试剂盒，通常包含一种测试化合物；一种标记化合物，例如对p40/IL-B30具有已知结合亲和性的一种结合配偶体或抗体；一种p40/IL-B30源(天然存在的或重组的)；和用于将结合的标记化合物与游离标记化合物分离的工具，例如用于将该分子固定化的固相。一旦筛选出化合物，则可以在本领域熟知的合适的生物测定中评估对该抗原具有合适结合亲和性的那些化合物，以确定它们是作为p40/IL-B30信号途径的激动剂还是作为拮抗剂起作用。重组IL-12 p40/IL-B30融合多肽的可得性也提供了很好确定的校准这类测定的标准。
用于测定样品中例如p40/IL-B30浓度的优选试剂盒，通常包含一种对所述抗原具有已知结合亲和性的标记化合物，例如结合配偶体或抗体；一种细胞因子源(天然存在的或重组的)和一种将结合标记化合物与游离标记化合物分离的工具，例如用于将所述p40/IL-B30固定化的固相。通常提供含试剂的区室和说明。
包括抗原结合片段在内的所述p40/IL-B30或片段的特异性抗体，可用于检测水平提高的p40、IL-B30、p40/IL-B30和/或其片段存在的诊断应用。这类诊断测定可以使用裂解液、活细胞、固定细胞、免疫荧光、细胞培养物、体液，还可以涉及血清中与所述抗原相关的抗原的检测等。诊断测定可以是均相(在游离试剂和抗原结合配偶体复合物之间无分离步骤)或异相(有分离步骤)的。存在各种商业测定，诸如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、酶倍增免疫测定(enzyme-multiplied immunoassay)技术(EMIT)、底物标记荧光免疫测定(SLFIA)等。参见例如Van Vunakis等，(1980)MethEnzymol.701-525；Harlow和Lane，(1980)AntibodiesA LaboratoryManual，CSH Press，NY；和Coligan等，(1 993编辑)Current Protocols inImmunology，Greene and Wiley，NY。
抗独特型抗体可以相似地用来诊断抗p40/IL-B30抗体的存在，因此可以诊断各种异常状态。例如，p40/IL-B30的超量产生可能导致产生可能是异常生理状况诊断标志的各种免疫反应，所述异常生理状况特别是增生性细胞病症(诸如癌症)或异常活化或分化。
通常，用于诊断测定的试剂在试剂盒中供应，以便使该测定的灵敏度最佳化。对于题述发明，根据所述测定的性质，提供所述方案和所述标记(或者标记或未标记的抗体或结合配偶体，或者标记的p40/IL-B30)。这通常与其它添加剂结合，所述添加剂诸如缓冲液、稳定剂、信号产生必需的物质，诸如酶的底物等。所述试剂盒最好也含有正确使用和使用后正确处理内容物的说明。所述试剂盒通常具有每种有用试剂的区室。当所述试剂可以在水性介质中重建，提供进行该测定的合适试剂浓度时，所述试剂最好是作为干燥的冻干粉提供。
所述药物筛选和所述诊断测定的许多上述组分可以不经修饰而使用，或以多种方式进行修饰。例如，通过共价或非共价结合直接或间接提供可检测信号的部分，可以达到标记。在这些测定中的许多测定中，可以或者直接或间接标记所述结合配偶体、测试化合物、p40/IL-B30或其抗体。用于直接标记的可能标记包括标记基团诸如125I的放射性标记；酶，诸如过氧化物酶和碱性磷酸酶；和能够监测荧光强度、波长变化或荧光偏振变化的荧光标记(美国专利第3,940,475号)。用于间接标记的可能标记包括将一种组分生物素化，然后与偶联于一种上述标记基团的抗生物素蛋白连接。
也有许多将结合p40/IL-B30与游离p40/IL-B30分离、或者将结合测试化合物与游离测试化合物分离的方法。所述p40/IL-B30可以固定化于各种基质上，然后进行洗涤。合适的基质包括诸如ELISA板的塑料、滤膜和微珠。参见例如Coligan等，(1993编辑)Current Protocols inImmunology，第1卷，第2章，Greene and Wiley，NY。其它合适的分离技术包括但不限于Rattle等，(1984)Clin.Chem.301457-1461中描述的荧光素抗体可磁化微粒法、以及美国专利第4,659,678号中描述的双抗体磁性微粒分离法。
在所述文献中已经广泛报道了用于将蛋白或其片段与各种标记交联的方法，因此在此不需要详细讨论。许多这些技术涉及应用活化羧基，或者通过碳二亚胺或者活性酯形成肽键；通过巯基与活化卤素(诸如氯乙酰)或活化烯烃(诸如马来酰亚胺)反应形成硫醚，以用于交联等。融合蛋白也可供这些应用使用。
本发明的另一诊断方面涉及取自p40/IL-B30序列的寡核苷酸序列或多核苷酸序列的应用。这些序列可以用作探针，以检测怀疑患有异常病症(例如炎症或自身免疫病)的患者样品中所述p40或IL-B30信息的水平。由于所述细胞因子可以是活化的标记或中介体，所以可用来检测多种活化细胞，以确定例如在所述效应变显著和进展为显著之前可能例如以预防方式需要其它疗法的时间。RNA和DNA核苷酸序列的制备、所述序列的标记和所述序列的优选大小在所述文献中有大量的描述和讨论。参见例如Langer-Safer等，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.794381-4385；Caskey，(1987)Science236962-967；和Wilchek等，(1988)Anal.Biochem.1711-32。
也考虑了也用于测试其它分子定性或定量表达的诊断试剂盒。诊断或预后可能取决于用作标记的多种指标的组合。因此，试剂盒可以测试标记组合。参见例如Viallet等，(1989)Progress in Growth Factor Res.189-97。其它试剂盒可以用来评估其它细胞亚群。X.分离p40/IL-B30的受体由于已经分离出特异性配体-受体相互作用的配体，因此存在分离所述受体的方法。参见Gearing等，(1989)EMBO J.83667-3676。例如，可以确定标记所述IL-B30细胞因子、但不干扰与其受体结合的方法。例如，可以将亲和标记融合于所述配体的或者氨基末端或者羧基末端。这种标记可以是FLAG附加表位，或例如Ig或Fc区。例如通过细胞分选，或测定表达这种结合组分的亚群的其它筛选，可以根据所述细胞因子的特异性结合来筛选表达文库。参见例如Ho等，(1993)Proc.Natl Acad.Sci.USA9011267-11271；和Liu等，(1994)J.Immunol.1521821-29。或者，可以使用淘选法。参见例如Seed和Aruffo，(1987)Proc.Natl Acad.Sci.USA843365-3369。
可以应用蛋白质与标记交联的技术来分离所述p40/IL-B30细胞因子复合物的结合配偶体。这应该使得可以鉴定与所述细胞因子例如以配体-受体样方式特异性相互作用的蛋白质。
将进行早期试验，以确定已知的IL-6或G-CSF受体组分是否参与对p40/IL-B30的应答。这些功能受体复合物可能与p40/IL-B30受体复合物共享许多或所有组分的可能性也相当大，其中所述组分或者为特定受体亚基或者为辅助受体亚基。
可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下对本发明进行许多修改和变化，这对于本领域技术人员是显而易见的。提供本文描述的具体实施方案仅仅是举例说明，本发明仅受所附权利要求书的条款以及这些权利要求赋予的等同条款的全部范围限制。
实施例I.一般方法例如在Maniatis等，(1982)Molecular CloningA Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，NY；Sambrook等，(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(第2版)第1-3卷，CSH Press，NY；Ausubel等，BiologyGreene Publishing Associates，Brooklyn，NY；Ausubel等，(1987和增补本)Current Protocols inMolecular BiologyWiley/Greene，NY；Innis等，(1990编辑)PCRProtocolsA Guide to Methods and ApplicationsAcademic Press，NY；Bonifacino等，Current Protocols in Cell BiologyWiley，NY；和Doyle等，Cell and Tissue CultureLaboratory ProtocolsWiley，NY中描述或引用了以下的许多标准方法。用于蛋白纯化的方法包括诸如硫酸铵沉淀、柱层析、电泳、离心、结晶的方法和其它方法。参见例如Ausubel等，(1987和定期增补本)；Deutscher，(1990)“Guide to Protein Purification”，Methods in Enzymology第182卷和该系列中的其它卷；Coligan等，(1995和增补本)Current Protocols in Protein ScienceJohn Wiley and Sons，New York，NY；Matsudaira，(1993编辑)A.Practical Guide to Protein andPeptide Purification for Microsequencing，Academic Press，San Diego，CA；和例如Pharmacia，Piscataway，NJ或Bio-Rad，Richmond，CA的生产商关于蛋白纯化产品使用的文献。与重组技术结合，使得可以与合适区段(附加表位)融合，例如与FLAG序列融合或与可以例如通过蛋白酶可去除序列融合的等同序列融合。参见例如Hochuli(1990)“Purification ofRecombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent”，载于Setlow(编辑)Genetic Engineering，Principle and Methods1287-98，Plenum Press，NY；和Crowe等，(1992)QIAexpressThe High Level Expression & ProteinPurification SystemQUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA。
例如采用可得到的软件程序进行计算机序列分析，所述软件程序包括得自University of Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI、NIH的NCBI以及GenBank、NCBI、EMBO和其它公共序列源的软件程序。其它分析源包括例如RASMOL程序，参见Bazan等，(1996)Nature379591；Lodi等，(1994)Science2631762-1766；Sayle和Milner-White，(1995)TIBS20374-376；和Gronenberg等，(1991)Protein Engineering4263-269；和DSC，参见King和Stemberg，(1996)Protein Sci.52298-2310。也参见Wilkins等，(1997编辑)ProteomeResearchNew Frontiers in Functional GenomicsSpringer-Verlag，NY；Salzberg等，(1998编辑)Computational Methods in Molecular BiologyElsevier，NY；和Birren等，(1997编辑)Genome AnalysisA LaboratoryManualCold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY。
例如在Hertzenberg等，(1996编辑)Weir’s Handbook ofExperimental Immunology第1-4卷，Blackwell Science；Coligan，(1991及新版本)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene，NY；和Methodsin Enzymology第70、73、74、84、92、93、108、116、121、132、150、162和163卷中，描述了标准免疫学技术。例如在Thomson，(1994编辑)The Cytokine Handbook(第2版)Academic Press，San Diego；Metcalf和Nicola，(1995)The Hematopoietic Colony Stimulating FactorsCambridge University Press；和Aggarwal和Gutterman，(1991)HumanCytokinesBlackwell Pub中，描述了细胞因子测定。
血管生物活性的测定是本领域熟知的。它们包括肿瘤或其它组织(例如动脉平滑肌)增生(参见例如Koyoma等，(1996)Cell871069-1078)、单核细胞粘着于血管上皮(参见McEvoy等，(1997)J.Exp.Med1852069-2077)等中的血管生成活性和血管抑制(angiostatic)活性。也参见Ross，(1993)Nature362801-809；Rekhter和Gordon，(1995)Am.J.Pathol.147668-677；Thyberg等，(1990)Atherosclerosis10966-990；和Gumbiner，(1996)Cell84345-357。
例如在Wouterlood，(1995编辑)Neuroscience Protocolsmodules 10，Elsevier；Methods in NeurosciencesAcademic Press；和NeuromethodsHumana Press，Totowa，NJ中，描述了神经细胞生物活性的测定。例如在Meisami(编辑)Handbook of Human Growth and DevelopmentalBiologyCRC Press；和Chrispeels(编辑)Molecular Techniques andApproaches in Developmental BiologyInterscience中，描述了发育系统的方法学。
在Melamed等，(1990)Flow Cytometry and SortingWiley-Liss，Inc.，New York，NY；Shapiro，(1988)Practical Flow CytometryLiss，New York，NY；和Robinson等，(1993)Handbook of Flow Cytometry MethodsWiley-Liss，New York，NY中，描述了FACS分析。II.人p40和/或IL-B30的克隆所述IL-12 p40序列可得自各种序列数据库，如以上描述的数据库。表1提供了所述IL-B30基因的序列。所述序列得自基因组人序列。
这些序列使得可以制备PCR引物或探针，以测定所述基因的细胞分布。所述序列使得可以分离编码所述信息的基因组DNA。
使用所述探针或PCR引物，可以探测各种组织或细胞类型，以确定细胞分布。用例如TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆PCR产物。在自动测序仪(Applied Biosystems)上，从两个末端对所得的cDNA质粒测序。III.p40和IL-B30的细胞表达制备对编码相应基因的cDNA特异性的合适探针或引物。通常，例如通过随机引物标记该探针。在感兴趣的是所述p40/IL-B30复合物的情况下，两种亚基的协同表达是最为重要的。IV.p40/IL-B30蛋白的纯化对许多转染的细胞系筛选以高于其它细胞的水平表达所述细胞因子或复合物的细胞系。或者，可以构建组合重组构建体。对各种细胞系根据其适宜的操作特性进行筛选和选择。分别分离相应的亚基以及其后的组合，可能导致某些二聚体形成。天然IL-B30可以从天然来源分离，或采用合适的表达载体通过表达从转化细胞中分离。可以用腺病毒构建体进行生产/表达。
用标准方法可以达到所表达亚基或复合物的纯化，或可以结合工程改造方法，以高效率从细胞裂解液或上清液中有效地纯化所表达的亚基或复合物。特别是，带有或不带有合适接头的p40与IL-B30的融合，可以产生高效加工或纯化方法。对于这类纯化特征可以使用FLAG或His6区段。或者，可以用特异性抗体，使用亲和层析，参见下文。
根据需要，在大肠杆菌(coli)、昆虫细胞或哺乳动物表达系统中产生蛋白质。V.p40/IL-B30特异性抗体的制备将合成肽或纯化蛋白呈递给免疫系统，以产生单克隆或多克隆抗体。参见例如Coligan，(1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene；和Harlow和Lane，(1989)AntibodiesA LaboratoryManualCold Spring Harbor Press。可以应用免疫选择法或耗竭法，以确保所得抗体对多肽复合物所呈递的抗原决定簇是特异性的，而且所述抗原决定簇与各个组分自身所呈递的抗原决定簇不同。可以制备多克隆血清或杂交瘤。在合适的情况下，所述结合试剂或者如上所述进行标记，例如荧光标记或其它标记，或者固定化至基质上用于淘选法。免疫选择、免疫耗竭和相关技术可以根据需要用来制备选择性试剂，例如所述两种亚基间复合物的选择性试剂。VI.IL-12 p40和IL-B30共沉淀在表达载体中制备小鼠IL-12 p40-Ig融合构建体。所述Ig区与A蛋白结合，并且可以沉淀该多肽。也制备了IL-B30Etag(用FLAG基序在N末端附加的表位)构建体，所述多肽可与M2抗体免疫沉淀。将仅带有IL-12 p40-Ig构建体、仅带有IL-B30Etag构建体或带有这两者的所述表达构建体转染到293 T细胞中。细胞用35S甲硫氨酸标记。仅带有IL-12 p40构建体，用A蛋白在细胞上清液中没有检测到可溶性蛋白。同样，仅带有FLAG-IL-B30构建体，用M2抗体在细胞上清液中没有检测到可溶性蛋白。然而，用这两种表达构建体共转染，细胞上清液产生可与或者A蛋白试剂或者M2抗体沉淀的可溶性复合物。对该复合物的PAGE分析表明，A蛋白沉淀的复合物由对应于所述两种预期的多肽IL-12 p40-Ig融合体和FLAG-IL-B30多肽的多肽构成。相应的是，用M2抗体沉淀的复合物由FLAG-IL-B30多肽和IL-12 p40-Ig融合蛋白构成。
用人IL-12 p40表达构建体和人FLAG-IL-B30构建体进行的相似实验提供了预期的结果。用FLAG-IL-B30构建体转染，没有产生显著量的可溶性蛋白。将这两种表达载体共转染到灵长类细胞中，导致有效地分泌可与M2抗体免疫沉淀的复合物。对所得复合物的PAGE分析确证了所述复合物由所述FLAG-IL-B30多肽和所述IL-12 p40多肽构成。VII.受体的鉴定IL-12受体由IL-12受体亚基β1和β2构成。P40/IL-B30的融合构建体与表达受体亚基β1的细胞结合。
IL-12 p40亚基的同二聚体可以阻断IL-12与小鼠亚基β1的结合，但不阻断与亚基β2的结合。所述p40亚基是p40/IL-B30复合物的组分，因此测试IL-12受体亚基β1是否是p40/IL-B30融合构建体受体的组分。抗IL-12受体亚基β1的抗体阻断该融合构建体与表达受体亚基β1的细胞的结合。针对p40/p70复合物的抗体主要识别所述p40亚基，可以阻断p40/IL-B30组合物的效应，提示所述p40组分在受体相互作用中是重要的。这些观察结果提示，受体亚基β1与p40/IL-B30融合构建体结合。测试是否涉及相关受体中共享的共同gp130亚基的类似实验提示，gp130不是p40/IL-B30受体的相关亚基。
鉴定所述受体的一个亚基之后，已经启动了表达克隆工作。表达所述一种亚基、但未显示结合的细胞用来表达克隆另一个亚基。正在筛选其它受体亚基β2的同系物。或者，可以在标准表达克隆方法中使用来自合适细胞的文库。VIII.生物学功能广度的评估例如根据IL-B30和IL-6和G-CSF之间的序列同源性和结构同源性，测试p40/IL-B30复合物的生物活性。最初，检查了已经显示IL-6或G-CSF生物活性的测定。对或者重组复合物或者融合构建体进行测定。融合构建体由这样的构建体构成，所述构建体具有与N末端FLAG表位连接的IL-12 p40信号序列，末端FLAG表位与成熟IL-12 p40序列融合，成熟IL-12 p40序列与合适长度的富含ser/gly的接头序列融合，所述接头序列与成熟的IL-B30序列融合。该构建体既可很好地表达和被分泌，所述附加表位又可使得能够进行纯化和定位。产生小鼠序列和人序列两种形式。既可获得独立的多肽的腺病毒表达构建体，也可获得融合蛋白的腺病毒表达构建体。
靶细胞类型包括淋巴样细胞类型、骨髓样细胞类型、肥大细胞类型、前B细胞类型、前T细胞类型和成纤维细胞-内皮细胞类型。例如，将评估巨噬细胞/单核细胞的细胞表面标记的改变，所述标记例如II类MHC、B7、CD40和相关家族；细胞因子和趋化因子的产生；和抗原呈递能力。将测定CD4+T细胞-原初CD45Rb高和记忆CD45Rb低T细胞的例如生长和激活标记以及效应子功能，例如细胞因子和趋化因子的产生。将评估细胞毒性CD4+、CD8+和NK细胞对产生和功能的效应。将例如在脾细胞和MLN B细胞上测试对抗体产生的效应。将评估树突细胞的产生、成熟和功能，包括因子的产生。也正在开发细胞凋亡测定。
将测试长期骨髓培养物对基质细胞和干细胞生成及分化调节的效应(德克斯特培养法)、对基质细胞和B细胞祖细胞生成及分化的调节(Whitlock-Witte培养法)和对调节原始骨髓样群体和B淋巴样群体潜力的评估。A.对细胞增殖的效应用不同浓度的细胞因子，评估对各种细胞类型增殖的效应。结合相关细胞因子IL-6、G-CSF等进行剂量反应分析。可以使用检测细胞代谢和生长的细胞传感器(Mo1ecular Devices，Sunnyvale，CA)。
人p40/IL-B30融合蛋白增强用抗CD3或者用抗CD3和抗CD28刺激的人PHA未成熟细胞的增殖。抗CD3刺激看来是必不可少的。人p40/IL-B30融合蛋白也增强活化Th1或Th2细胞克隆的增殖，但不增强静息Th1或Th2细胞克隆的增殖。
或者小鼠融合蛋白或者人融合蛋白作用于小鼠靶细胞上。融合蛋白支持用抗CD3刺激时的CD4+CD45Rb低CD62L低CD44高细胞(记忆/活化T细胞)的增殖。融合蛋白的刺激作用不为抗CD28共刺激所增强。这基本上不依赖于IL-2的存在。这提示p40/IL-B30对于具有记忆表型和/或产生或维持免疫记忆的细胞群体的扩充可能是一个重要的因子。这种细胞因子看来选择性地支持具有Th1表型的活化记忆细胞，例如产生IFNγ、但不产生IL-4或IL-5的细胞。B.对原初T细胞分化的效应收集人脐带血细胞，并且分离原初CD4+T细胞。在抗CD3和IL-2以及表达CD32、CD58 CD80的经照射的成纤维细胞存在下，将这些细胞培养例如2周，由此激活T细胞并使其增殖。评估所述T细胞培养物的各种细胞因子对增殖或分化的效应。通过FACS分析评估各种细胞的细胞因子产生。所述p40/IL-B30融合蛋白支持产生IFNγ但不产生IL-4(一种Th1细胞特征性的细胞因子表达分布型)的T细胞的增殖和分化。C.对细胞表面分子表达的效应通过负选择，从正常健康供体的外周血单核细胞纯化单核细胞。简而言之，将3×108经ficoll分带分离的单核细胞与单克隆抗体混合物(Becton-Dickinson；Mountain View，CA)在冰上孵育，所述单克隆抗体混合物包含例如200μlαCD2(Leu-5A)、200μl oCD3(Leu-4)、100μlαCD8(Leu 2a)、100μlαCD19(Leu-12)、100μl αCD20(Leu-16)、100μloCD56(Leu-19)、100μlαCD67(IOM 67；Immunotech，Westbrook，ME)和抗血型糖蛋白抗体(10F7MN，ATCC，Rockville，MD)。洗涤抗体结合细胞，然后与羊抗小鼠IgG偶联的磁珠(Dynal，Oslo，挪威)一起温育，磁珠与细胞之比为20∶1。通过施加磁场，从单核细胞中分离抗体结合细胞。随后，在缺乏或存在IL-B30、IL-6、G-CSF或组合的情况下，在含1％人AB血清的Yssel氏培养基(Gemini Bioproducts，Calabasas，CA)中培养人单核细胞。
通过直接免疫荧光，可以进行细胞表面分子表达的分析。例如，将2×105纯化的人单核细胞在含1％人血清的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中在冰上孵育20分钟。以200×g沉淀细胞。将细胞再悬浮于20ml PE或FITC标记的mAb中。于冰上再孵育20分钟后，细胞在含1％人血清的PBS中洗涤，然后在单独的PBS中洗涤2次。将细胞在含1％低聚甲醛的PBS中固定，并在FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson；Mountain View，CA)上进行分析。使用典型的mAb，例如得自Becton-Dickinson的CD11b(抗macl)、CD11c(一种gp150/95)、CD14(Leu-M3)、CD-54(Leu 54)、CD80(抗BB1/B7)、HLA-DR(L243)以及CD86(FUN1；Pharmingen)、CD64(32.2；Medarex)、CD40(mAb89；Schering-Plough法国)。D.对人细胞产生细胞因子的效应如上所述分离人单核细胞，并在缺乏或存在IL-B30(1/100稀释的杆状病毒表达的物质)的情况下，在含1％人AB血清Yssel氏培养基(Gemini Bioproducts，Calabasas，CA)中培养。另外，在缺乏或存在IL-B30的情况下，用LPS(大肠杆菌0127B8 Difco)刺激单核细胞，并通过ELISA测定细胞培养上清液中细胞因子(IL-1β、IL-6、TNFα、GM-CSF和IL-10)的浓度。
对于细胞因子的胞质内染色，在缺乏或存在IL-B30和LPS(大肠杆菌0127B8 Difco)和10mg/ml布雷菲德菌素A(Epicentre technologiesMadison WI)的情况下，在Yssel氏培养基中培养单核细胞(1×106/ml)12小时。在PBS中洗涤细胞，并在2％甲醛/PBS溶液中于室温下孵育20分钟。随后将细胞洗涤，再悬浮于透化缓冲液(含0.5％皂苷(Sigma)的PBS/BSA(0.5％)/叠氮化物(1mM)溶液)中，于室温下孵育20分钟。将细胞(2×105)离心，于室温下再悬浮于20ml直接缀合的抗细胞因子mAb中达20分钟，所述mAb在透化缓冲液中以1∶10稀释。可以使用以下抗体IL-1α-PE(364-3B3-14)；IL-6-PE(MQ2-13A5)；TNFα-PE(MAb11)；GM-CSF-PE(BVD2-21C11)；和IL-12-PE(C11.5.14；Pharmingen San Diego，CA)。随后，将细胞在透化缓冲液中洗涤2次，在PBS/BSA/叠氮化物中洗涤1次，并在FACScan流式细胞仪(BectonDickinson；Mountain View，CA)上进行分析。
人PHA未成熟细胞对与人p40/IL-B30融合构建体接触应答而产生IFNγ。所述效应与IL-2是协同的。融合产物增强活化T细胞的IFNγ产生，而不增强静息T细胞-静息Th1细胞克隆或静息Th2细胞克隆的IFNγ产生。E.对人外周血单核细胞(PBMC)增殖的效应如已描述的(Boyum等)，通过Ficoll-hypaque离心，从正常健康供体的血沉棕黄层分离总PBMC。在缺乏或存在IL-B30的情况下，将PBMC在96孔板(Falcon，Becton-Dickinson，NJ)中的200μl含1％人AB血清的Yssel氏培养基(Gemini Bioproducts，Calabasas，CA)中培养。将细胞在单独的培养基中或结合100 U/ml IL-2(R&D Systems)的培养基中培养120小时。在培养的最后6小时期间加入3H-胸苷(0.1 mCi)，通过液闪计数测定3H-胸苷的掺入。
可以在许多其它生物测定系统中，例如在T细胞、B细胞、NK、巨噬细胞、树突细胞、造血祖细胞等上，测试所述天然、重组和融合的蛋白的激动剂活性和拮抗剂活性。因为IL-6和G-CSF的结构关系，应该分析与那些活性相关的测定。
在表达IL-6或G-CSF受体的转染细胞和对照上，评估p40/IL-B30的激动剂活性或拮抗剂活性。参见例如Ho等，(1993)Proc.Natl Acad.Sci.USA90，11267-11271；Ho等，(1995)Mol.Cell.Biol.155043-5053；和Liu等(1994)J.Immunol.1521821-1829。
评估p40/IL-B30在对抗原或同种异型刺激物应答的巨噬细胞/树突细胞活化和抗原呈递测定、T细胞细胞因子产生和增殖方面的效应。参见例如de Waal Malefyt等，(1991)J.Exp.Med1741209-1220；deWaal Malefyt等，(1991)J.Exp.Med.174915-924；Fiorentino等，(1991)J.Immunol.147，3815-3822；Fiorentino等，(1991)J.Immunol.1463444-3451；和Groux等，(1996)J.Eep.Med.18419-29。
也将评估p40/IL-B30对NK细胞刺激的效应。测定可以基于例如Hsu等，(1992)Internat.Immunol.4563-569；和Schwarz等，(1994)J.Immunother.1695-104。
将例如通过在Defrance等，(1992)J.Exp.Med.175671-682；Rousset等，(1992)Proc.Natl Acad.Sci.USA891890-1893中描述的方法，包括IgG2和IgA2开关因子测定，分析B细胞生长和分化效应。IX.遗传改变动物的产生和分析可以用标准方法产生转基因小鼠。这种动物可用来测定在特定组织或在整个所述生物中该基因过量表达的效应。这种动物可以提供对该动物或特定组织在各个阶段中发育的有趣的了解。此外，可以评估对生物胁迫的各种应答的影响。参见例如Hogan等，(1995)Manipulatingthe Mouse EmbryoA Laboratory Manual(第2版)Cold Spring HarborLaboratory Press。
可获得用于在各种细胞和器官中表达所述基因的腺病毒技术。参见例如Hitt等，(1997)Adv.Pharmacol.40137-195；和来自QuantumBiotechnologies，Montreal，Canada的文献。动物可以用来测定所述基因对有不同发育或生理功能的动物系统的效应。
将编码IL-B30的0.5 kb cDNA作为EcoRI片段克隆到先前由Niwa等，(1991)Gene108193-200描述的表达载体中，所述表达载体含有CMV增强子β-肌动蛋白启动子和兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。可以按照Mann等，(1993)“Factor Influencing Production Frequency ofTransgenic Mice”，Methods in Enzymology225771-781的描述，通过区带蔗糖梯度离心，完成从载体序列分离所述转基因。合并含有所述转基因的部分，通过Microcon-100滤膜微量离心，然后用微注射缓冲液(5mM Tris-HCl，pH7.4，5mM NaCl，0.1mM EDTA)洗涤5次。
将转基因重悬于微注射缓冲液(5mM Tris-HCl，pH7.4，5mM NaCl，0.1mM EDTA)，至终浓度1-5ng/ml，将其微注射到([C57BL/6J xDBA/2]F1；The Jackson Laboratory)卵中，然后按照Hogan等，(1994)Manipulation of the Mouse Embryo，Plainview，NY，Cold Spring HarborLaboratory Press公开的方法，将卵转移到ICR(Sprague-Dawley)代母的输卵管中。到10天大时，剪下所产动物的一段尾部用于DNA分析。如先前Lira等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，877215-7219的描述，通过聚合酶链式反应(PCR)分析，进行转基因建立者的鉴定。通过小鼠尾部DNA的扩增完成IL-B30转基因小鼠的鉴定。使用内源LDL基因的引物作为扩增反应的内部对照。所述引物扩增IL-B30转基因的200bp区段和所述LDL基因的397bp区段。PCR条件是95℃30秒；60℃30秒；72℃60秒，进行30个循环。将转基因动物保持在无病原体的条件下。IL-B30转基因小鼠的分析用RNA STAT-60，按照生产商(TEL-TEST，Inc.Friendswood，TX)的说明，从组织提取RNA。将总RNA(20mg)变性，吸印到Biotrans膜(ICN Biomedicals，Costa Mesa，CA)上。通过与随机标记的L-30 cDNA(Stratagene，La Jolla，CA)杂交，评价转基因的表达。通过总RNA与随机标记的鼠血红素结合蛋白基因、鼠α-1酸性糖蛋白基因和鼠触珠蛋白基因的PCR区段杂交，评价急性期肝基因表达。
从商业来源购买ELISA试剂盒，按照厂商的说明进行ELISA。鼠IL-2(灵敏度＜3pg/ml)、鼠IL-1b(灵敏度＜3pg/ml)、鼠IFN-γ(灵敏度＜2 pg/ml)和鼠TNF-α(灵敏度＜5.1pg/ml)的ELISA试剂盒购自R&Dsystems(Minneapolis，MN)。鼠IL-6 ELISA试剂盒(灵敏度＜8pg/ml)购自Biosource Intemational(Camarillo，CA)。鼠IL-1αELISA试剂盒(灵敏度＜6pg/ml)购自Endogen(Cambridge，MA)。
用购自PharMingen(San Diego，CA)的抗体对，按照厂商的指南，进行血清免疫球蛋白水平的ELISA分析。抗小鼠IgM(克隆11/41)、抗小鼠IgA(克隆R5-140)、抗小鼠IgG1(克隆A85-3)、抗小鼠IgG2a(克隆R11-89)和抗小鼠IgG2b(克隆R9-91)用作捕获抗体。纯化的小鼠IgM(克隆G155-228)、IgA(克隆M18-254)、IgG1(克隆107.3)、IgG2a(克隆G155-178)和IgG2b(克隆49.2)用来生成标准曲线。生物素抗小鼠IgM(克隆R6-60.2)、生物素抗小鼠IgA(克隆R5-140)、生物素抗小鼠IgG1(克隆A85-1)、生物素抗小鼠IgG2a(克隆R19-15)和生物素抗小鼠IgG2b(克隆R12-3)用作检测抗体。
采用用于人IGF-1、在用酸-乙醇提取血清样品后也识别鼠IGF-1的市售放射免疫测定，按照厂商(Nichols Institute，San Juan Capistrano，CA)提供的说明，测定小鼠血清的IGF-1水平。
处死小鼠后，或者用冷冻切片的冷冻介质将组织速冻，或者通过在10％磷酸缓冲福尔马林中浸渍将组织固定。将福尔马林固定组织按照常规以5mm加工，用苏木精和曙红(H&E)染色。为了进行免疫染色，用丙酮固定速冻的切片并将其风干。
从眶下静脉窦将血液样品收集到无菌、抽空的加有EDTA的试管(Vacutainer Systems，Becton Dickinson，Rutherford，NJ)中。用自动系统(Abbot Cell-Dyn 3500，Abbot Park，IL)测定血液学数值。当由于血小板过于聚集或过大致使仪器不能提供精确的血小板计数时，人工进行血小板计数。采用自动染色器(Bayer Hema-Tek 2000，Elkhart，IN)，将血涂片用Modified Wright-Giemsa stain(Hema-Tek Stain Pack，Bayer Corp.，Elkhart，IN)染色，然后人工检查未成熟的细胞和血小板、红细胞和白细胞形态。骨髓转移清除股骨和胫骨的肌肉，通过用PBS冲洗骨头排出骨髓。将骨髓细胞洗涤1次，静脉注射到已经过致死照射(1000 RAD)的受体小鼠体内。IL-B30转基因小鼠的表型为了分析IL-B30的生物学功能，如Niwa等，(1991)Gene108193-200所述，将该基因在转基因小鼠体内在CMV增强子/肌动蛋白启动子控制之下表达。这种增强子/启动子盒将高水平的转基因表达主要导向骨骼肌和胰腺，但该转基因事实上可以在所有器官和细胞中表达。参见Lira等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA877215-7219。
与对照同窝小鼠相比，IL-B30转基因小鼠发育不良。IL-B30转基因小鼠的体重增重率变化大，但明显低于在对照同窝小鼠中发现的增重率。从IL-B30转基因小鼠和对照同窝小鼠的肌肉或皮肤提取的RNA与IL-B30 cDNA杂交的RNA印迹分析揭示，在所有IL-B30转基因小鼠的肌肉和皮肤中均检测到IL-B30 mRNA，而在对照同窝小鼠中没有检测到IL-B30 mRNA。这证明生长缓慢总是与IL-B30的表达相关。
在所获得的IL-B30转基因小鼠中，25％存活至成年，并且受IL-B30表达的影响，表现为生长减慢、腹胀、毛皮起皱、不育和突然死亡。因此，IL-B30的转基因表达引起阻止IL-B30转基因后代产生的表型。在此介绍的结果得自IL-B30转基因建立者小鼠的初步分析。IL-B30转基因小鼠的组织学分析从IL-B30转基因小鼠收集的组织的显微镜检查表明在包括肺、皮肤、食管、小肠和肝(胆管)、大肠和胰脏在内的多个部位中由轻度至中度的炎症。炎性浸润物由嗜中性粒细胞、淋巴细胞和/或巨噬细胞组成。在某些小鼠中，皮肤炎症与棘皮症和/或溃疡有关。在肺中，支气管周单核细胞浸润物有时是主要的，肺泡壁含有的白细胞数目增加，衬于气道内的上皮增生。在肝中也常见最小的门静脉周单核细胞浸润物。淋巴结皮质有时细胞稀少并且缺乏卵泡发育。
在肝、脾和淋巴结中观察到髓外造血(EMH)。EMH在脾中尤为显著。在T细胞(抗CD3)、B细胞(抗B220)和巨噬细胞(抗F4/80)的免疫组织学染色后，检查了得自三只转基因小鼠和一只对照小鼠的脾。在转基因小鼠中，CD3、B220和F4/80阳性细胞出现在其正常的位置。然而，白髓被红髓中的EMH分隔，红髓中的阳性染色细胞中点缀有用所述各种抗体染色强度较弱或染色非阳性的造血细胞。这些观察结果证明，IL-B30的转基因表达诱导与EMH相关的系统炎症。
为了分析IL-B30对外周血中淋巴细胞和血小板计数的影响，进行了全血分析。与对照同窝小鼠中的最高嗜中性粒细胞计数相比，IL-B30转基因小鼠血液中的嗜中性粒细胞数目增加3-11倍。外周血嗜中性粒细胞的增加通常是炎症，并且与各种组织中观察到的嗜中性粒细胞的浸润有关。因此，骨髓中骨髓细胞(粒细胞)/红细胞类比率增加。
另外，与对照同窝小鼠相比，在IL-B30转基因小鼠中循环血小板数目增加多达3倍。血小板数目增加可能源于或者巨核细胞数目增加，或者源于巨核细胞的血小板产生增加。为了测试任一种可能性，用显微镜分析了得自IL-B30转基因小鼠的外周血、骨髓和脾。在外周血中，常常检查到奇异形态的血小板，包括伸长的和纺锤形血小板。在某些小鼠的骨髓和脾中，巨核细胞由于胞质量增加而变大。相反，在骨髓和脾中巨核细胞数目没有增加。这提示，IL-B30通过促进巨核细胞的血小板产生而增强血小板数目。
所检查的所有IL-B30转基因小鼠也都患有轻度至中度带有裂红细胞的低色小红细胞性贫血和不同程度的再生证据。血细胞比容值比对照平均数低36-70％。低色小红细胞性贫血的存在提示血红蛋白产生缺乏。IL-B30转基因小鼠的细胞因子分布型为了测试在IL-B30转基因小鼠中观察到的系统炎症是否与促炎细胞因子表达的改变有关，我们测定了外周血中IL-1、TNFα、IL-6和IFNγ的浓度。在所测试的所有IL-B30转基因小鼠中，TNFα和IFNγ的水平均增加。另外，在所测试的25％的IL-B30转基因小鼠中，IL-1水平增加。在IL-B30转基因小鼠中发现的IL-1和TNFα的浓度所达到的水平与LPS对急性炎症反应的诱导相关。令人惊讶的是，在IL-B30转基因小鼠的外周血中没有检测到IL-6，即使在炎症条件下IL-6的表达被高度诱导(Reinecker等，(1993)Clin.Exp.Immunology94174-181；Stevens等，(1992)Dig.Dis.Sci.37818-826)，并且可以被TNFα、IL-1和IFNγ直接诱导(Helle等，(1988)Eur.J.Immunol.18957-959。IL-B30转基因小鼠肝中的急性期基因机体对炎症作出反应，急性期反应的特征为在肝中表达特定的血浆蛋白。由于IL-B30转基因小鼠表现出系统炎症特征性的表型，因此我们检查了IL-B30转基因小鼠和对照同窝小鼠肝中的急性期基因表达。急性期肝基因α-1酸性糖蛋白、触珠蛋白和血红素结合蛋白在所测试的所有IL-B30转基因小鼠中均高度表达，而在对照同窝小鼠中没有检测到这些基因的表达。这证明急性期肝基因在IL-B30转基因动物中为组成型表达。IL-B30转基因小鼠的血清免疫球蛋白在免疫应答期间，某些细胞因子诱导B细胞分化和后续的免疫球蛋白合成。为了在IL-B30转基因小鼠中测试免疫球蛋白合成是否改变，测定了外周血中免疫球蛋白同种型的浓度。在7只IL-B30转基因小鼠中的2只中，IgA的浓度与对照同窝小鼠相比增加6-9倍。此外，与对照同窝小鼠相比，在所测试的所有IL-B30转基因小鼠中IgG1、IgG2a和IgG2b的浓度增加2.5-6倍。相反，在所测试的任一只IL-B30转基因小鼠中，都没有检测到IgM或IgE效价的显著增加。事实上，7只IL-B30转基因小鼠中的4只显示出IgM合成水平显著降低。总而言之，一个亚群的IL-B30转基因小鼠显示出免疫球蛋白同种型IgA和IgG的浓度增加6-9倍，而没有检测到免疫球蛋白同种型IgM和IgE浓度的显著增加。IL-B30转基因小鼠中血清IGF-1水平慢性炎症(Kirschner和Sutton，(1986)Gastroenterology91830-836；Laursen等，(1995)Arch.Dis.Child.72494-497)或细胞因子在转基因动物中过量表达(De Benedetti等，(1994)J.Clin.Invest.932114-2119)可以引起与胰岛素样生长因子-1(IGF-1)减少相关的生长减慢。为了测试IL-B30转基因小鼠的生长缓慢是否可以追踪至IGF-1水平降低，分析了转基因小鼠血清样品的IGF-1。在所测试的所有IL-B30转基因小鼠中，血清中的IGF-1量是年龄相当的对照同窝小鼠水平的12-14％。这提示，IL-B30的转基因表达以及后续所产生的炎症反应导致IL-B30转基因小鼠体内的IGF-1减少，并且可能因此是生长缓慢和不育的原因(Gay等，(1997)Endocrinology137(7)2937-2947)。生物活性IL-B30在造血细胞中的表达细胞因子是局部调节免疫系统或介导远程效应的分泌型蛋白。为了测试IL-B30是否作为细胞因子起作用以及是否可以诱导远距离多器官炎症和急性期肝反应，我们将IL-B30转基因骨髓转移到经致死照射的野生型受体小鼠体内。
每周监测骨髓受体的急性期反应的诱导。在IL-B30骨髓受体中早在转移后35天时，可以检测到急性期蛋白SAA浓度的增加，并且SAA水平随时间而增加。在外周血SAA浓度增加的同时，根据出现毛皮起皱和鼻口部和咽喉周围的皮肤发炎来判断，IL-B30骨髓受体的健康状况恶化。相反，野生型骨髓受体血液中的SAA水平没有升高，它们看来也没有病。
当动物出现重病时，将其生命终结。在IL-B30转基因骨髓受体的骨髓和脾中可以检测到IL-B30的表达，但在野生型骨髓受体的器官中没有检测到所述表达。同在IL-B30转基因供体中一样，在IL-B30转基因骨髓受体体内，皮肤、肺、肝和胃肠道发炎，但在野生型骨髓受体中没有发炎。在IL-B30转基因骨髓受体中急性期肝基因(血红素结合蛋白，AGP-1)又是高度表达，但在血清中不能检测到IL-6。这些结果提示，IL-B30是真正的具有远程特性的细胞因子。
IL-B30的转基因表达诱导显著的表型，其特征为转基因动物发育不良、系统炎症、不育和死亡。IL-B30转基因动物患有系统炎症，炎性细胞浸润到肺、肝、皮肤和消化道中。
IL-B30的体内过量表达引起生长减慢和炎症的表型，这明显与IL-6转基因表达的几种模型的表型相似。与IL-6转基因表达或将重组IL-6给予小鼠后的效应相似，由于IL-B30的转基因表达，在动物中观察到嗜中性粒细胞浸润和贫血。同IL-6转基因动物一样，IL-B30转基因建立者的生长减慢与IGF-1水平降低有关，IGF-1可能与在这些动物中观察到的系统炎症有关。
IL-B30转基因动物的这种表型可以是由于或者IL-B30过量表达的直接效应或者由于IL-B30介导的对IL-1和TNFα表达的正调节引起的对IL-6表达的正调节所致。IL-1和TNFα是已知的IL-6的诱导物，在IL-B30转基因小鼠的外周血中发现了TNFα和IL-1的浓度增加。
然而，在IL-B30转基因动物的血液中没有检测到IL-6，这提示IL-B30动物的表型与这种新细胞因子的过量表达直接相关，并且正如其序列同源性所暗示的，IL-B30具有与IL-6相似的生物活性。
IL-6是一种多效细胞因子，具有多种功能，它诱导血小板增多，急性期蛋白合成和B细胞分化。
实际上，IL-B30转基因动物组成型地表达急性期肝基因，如AGP-1、触珠蛋白、血红素结合蛋白和血清淀粉状蛋白A蛋白。在小鼠中由于IL-6转基因过量表达的效应，或在给予重组IL-6之后，已经显示出相似的表型。另外，IL-B30的转基因表达导致不寻常的血小板增多，因为许多所述血小板具有奇异的形态(伸长的外观、尺寸大和/或纺锤形)。我们猜想，IL-B30和/或其它被正调节的细胞因子对正常的血小板产生有影响。这再次提示，IL-B30与IL-6及其相关物共享一种生物活性。
IL-6也已经被鉴定为B细胞分化因子。IL-6的转基因过量表达引起浆细胞瘤，而缺乏IL-6的小鼠表现出IgG应答降低。虽然我们在某些IL-B30转基因小鼠中观察到IgG和IgA产生的增加，但这一观察结果在不同的建立者之间是不一致的。因此，需要进一步的分析，来进一步鉴定IL-B30为潜力的B细胞分化因子。
在IL-B30转基因小鼠中，循环嗜中性粒细胞增加与各种组织中的炎症证据一致，然而，不容易解释红细胞参数的改变。IL-1、TNF-α和IFN-γ是通常称为慢性贫血症(ACD)的综合征的介质，ACD通常表现为正常红细胞性低色非再生性(或最低再生性)贫血症，在多种慢性炎症中可见到。慢性贫血症在某些病人中也可以表现为低色小红细胞。这种综合征是由于铁代谢改变和对红细胞生成素应答减弱所致。外周细胞因子浓度增加提示，在IL-B30小鼠中观察到的低色小红细胞性贫血可能是由于ACD所致。然而，低色小红细胞性贫血的最常见的病因是铁缺乏，这与IL-B30小鼠中观察到的部分骨髓应答(再生)和血小板增多更为一致。由于难以从受影响小鼠获取合适的血液，因此尚未进行进一步的研究，包括对可能使得从铁缺乏性贫血分化为ACD的血清铁蛋白、铁和总铁结合能力的测量。
IL-1和TNF-α是已知的IL-6表达的诱导物，IL-6的表达通常在炎性反应期间被正调节。因此，令人惊讶的是，在IL-B30转基因动物的外周血中不能检测到IL-6。这提示，IL-B30通过尚未鉴定的机制对IL-6表达具有负效应。实际上，IL-B30转基因动物中缺乏IL-6可能解释了在这些动物中观察到的高水平的IL-1和TNF-α，因为IL-6对小鼠体内循环IL-1和TNF-α的浓度具有负效应。在IL-B30转基因小鼠中观察到的高浓度的循环TNF-α也可以是IFN-γ浓度增加的结果。IFN-γ由IL-2活化T细胞或IL-4活化B细胞产生，诱导单核细胞和巨噬细胞中的TNF-α的表达。仍有待检测IFN-γ的表达是否由IL-B30直接介导，或由IL-B30诱导的其它细胞因子直接介导。总之，我们的结果提示，IL-B30与IL-6共享许多生物活性。仍有待了解这些生物活性是否由与IL-6共享的一种共同受体、信号转导元件或转录因子介导。这些问题有希望通过进行之中的采用遗传学方法和生物化学方法的实验来阐明。
本文引用的所有参考文献均通过引用结合到本文中，对于所有的目的，其程度与具体和单独地表明每个单独的出版物或专利申请通过引用结合到本文中的程度一样。
在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多修改和变化，这对于本领域技术人员是显而易见的。提供本文描述的具体实施方案仅仅是举例说明，本发明仅受所附权利要求书的条款以及这些权利要求赋予的等同条款的全部范围的限制。
权利要求
1.一种组合物，所述组合物包含a)以下两者i)一种大致纯的多肽，所述多肽包含得自IL-12 p40的多个至少7个连续氨基酸的不同区段；和ii)一种大致纯的多肽，所述多肽包含得自IL-B30的多个至少7个连续氨基酸的不同区段；b)以下两者i)一种大致纯的多肽，所述多肽包含得自IL-12 p40的至少11个连续氨基酸；和ii)一种大致纯的多肽，所述多肽包含得自IL-B30的至少11个连续氨基酸；c)一种大致纯的多肽，所述多肽包含以下两者i)IL-12 p40的多个至少7个连续氨基酸的不同区段；和ii)IL-B30的多个至少7个连续氨基酸的不同区段；或d)一种大致纯的多肽，所述多肽包含以下两者i)IL-12 p40的一个至少11个连续氨基酸的区段；和ii)IL-B30的一个至少11个连续氨基酸的区段。
2.权利要求1的组合物a)其中所述多个至少7个连续氨基酸的不同区段包括一个至少9个连续氨基酸的区段；b)其中所述多个至少7个连续氨基酸的不同区段是两个至少9个连续氨基酸的区段；c)其中所述IL-12 p40的至少11个连续氨基酸的区段至少有15个连续氨基酸；d)其中所述IL-B30的至少11个连续氨基酸的区段至少有15个连续氨基酸；e)还包含一种选自水性化合物的载体，包括水、盐水和/或缓冲液；f)配制用于经口、直肠、鼻、局部或胃肠外给药；或g)所述组合物是无菌组合物。
3.一种权利要求1的组合物a)其中所述多肽中的至少一种i)是可检测标记的；ii)是重组产生的；iii)未经糖基化；iv)是变性的；v)连接于固体基质；或vi)与另一化学部分缀合；b)包含以下两者i)一种大致纯的IL-12 p40多肽；和i)一种大致纯的IL-B30多肽；c)包含一种大致纯的含与IL-B30融合的IL-12 p40的多肽；或d)与IL-18、IL-12、放射或化学疗法、免疫佐剂或抗病毒剂联合。
4.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1的组合物和a)一个包含所述多肽的区室；或b)关于所述试剂盒中试剂的使用或处理的说明。
5.一种分离的或重组的核酸，所述核酸编码a)以下两者i)一种大致纯的多肽，所述多肽包含得自IL-12 p40的多个至少7个连续氨基酸的不同区段；和ii)一种大致纯的多肽，所述多肽包含得自IL-B30的多个至少7个连续氨基酸的不同区段；b)以下两者i)一种大致纯的多肽，所述多肽包含得自IL-12 p40的至少11个连续氨基酸；和ii)一种大致纯的多肽，所述多肽包含得自IL-B30的至少11个连续氨基酸；c)一种大致纯的多肽，所述多肽包含以下两者i)IL-12 p40的多个至少7个连续氨基酸的不同区段；和ii)IL-B30的多个至少7个连续氨基酸的不同区段；或d)一种大致纯的多肽，所述多肽包含以下两者i)IL-12 p40的一个至少11个连续氨基酸的区段；和ii)IL-B30的一个至少11个连续氨基酸的区段。
6.权利要求5的核酸a)其中所述多个至少7个连续氨基酸的不同区段包括一个至少9个连续氨基酸的区段；b)其中所述多个至少7个连续氨基酸的不同区段是两个至少9个连续氨基酸的区段；c)其中所述IL-12 p40的至少11个连续氨基酸的区段至少有15个连续氨基酸；d)其中所述IL-B30的至少11个连续氨基酸的区段至少有15个连续氨基酸；e)其中所述IL-12 p40得自灵长类；f)其中所述IL-B30得自灵长类；g)所述核酸是一种表达载体；h)所述核酸还包含一个复制起点；i)所述核酸包含一个可检测标记；j)所述核酸包含合成核苷酸序列；k)所述核酸小于6kb，最好小于3kb；或l)所述核酸得自灵长类。
7.一种细胞，所述细胞包含权利要求6的所述重组核酸。
8.权利要求7的细胞，其中所述细胞是a)原核细胞；b)真核细胞；c)细菌细胞；d)酵母细胞；e)昆虫细胞；f)哺乳动物细胞；g)小鼠细胞；h)灵长类细胞；或i)人类细胞。
9.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求6的所述核酸和a)一个包含所述核酸的区室；b)一个还包含一种灵长类IL-12 p40多肽的区室；或c)一个还包含一种灵长类IL-B30多肽的区室；或d)关于所述试剂盒中试剂的使用或处理的说明。
10.一种核酸，所述核酸a)在50℃和低于1M盐的30分钟洗涤条件下与灵长类IL-12 p40的天然成熟编码部分杂交；和b)在50℃和低于1M盐的30分钟洗涤条件下与灵长类IL-B30的天然成熟编码部分杂交。
11.权利要求10的核酸，其中a)用于IL-12 p40的所述洗涤条件是60℃和低于400mM的盐；b)用于IL-B30的所述洗涤条件是60℃和低于400mM的盐；c)所述核酸在一个至少50个核苷酸的序列段内表现出与编码灵长类IL-12 p40的序列有同一性；和/或d)所述核酸在一个至少50个核苷酸的序列段内表现出与编码灵长类IL-B30的序列有同一性。
12.权利要求10的核酸，其中a)用于IL-12 p40的所述洗涤条件是65℃和低于150mM的盐；b)用于IL-B30的所述洗涤条件是65℃和低于150mM的盐；c)所述核酸在一个至少90个核苷酸的序列段内表现出与编码灵长类IL-12 p40的序列有同一性；和/或d)所述核酸在一个至少90个核苷酸的序列段内表现出与编码灵长类IL-B30的序列有同一性。
13.一种与以下物质联合的IL-12 p40/IL-B30的拮抗剂a)TNFα拮抗剂；b)IL-12拮抗剂；c)IL-10；或d)类固醇。
14.一种结合化合物，所述结合化合物包含来自抗体的抗原结合部位，所述结合化合物与权利要求1的组合物特异性地结合，但不与或者IL-12 p40或IL-B30多肽特异性地结合，所述组合物a)包含一种大致纯的多肽，所述多肽包含以下两者i)一种大致纯的IL-12 p40多肽；和ii)一种大致纯的IL-B30多肽；或b)包含一种大致纯的多肽，所述多肽包含与IL-B30融合的IL-12p40。
15.权利要求14的结合化合物，其中a)所述结合化合物在一个容器中；b)所述结合化合物是Fv、Fab或Fab2片段；c)所述结合化合物与另一化学部分缀合；或e)所述抗体i)是针对权利要求1的组合物产生的；ii)是经免疫选择的；iii)是一种多克隆抗体；iv)表现出与抗原的Kd至少为30mM；v)连接于固体基质，包括微珠或塑料膜；vi)处于无菌组合物中；或vii)是可检测标记的，包括放射性标记或荧光标记。
16.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求15的所述结合化合物和a)一个包含所述结合化合物的区室；或b)关于所述试剂盒中试剂的使用或处理的说明。
17.一种产生抗原抗体复合物的方法，所述方法包括在合适条件下使灵长类IL-12 p40/IL-B30组合物与一种权利要求14的抗体接触，由此让所述复合物形成。
18.权利要求17的方法，其中a)从其它细胞因子中纯化所述复合物；b)从其它抗体中纯化所述复合物；c)所述接触是与包含一种细胞因子的样品接触；d)所述接触使得可以定量检测所述抗原；e)所述接触是与包含所述抗体的样品接触；或f)所述接触使得可以定量检测所述抗体。
19.一种组合物，所述组合物包含a)一种权利要求14的无菌结合化合物；或b)所述权利要求14的结合化合物和一种载体，其中所述载体是i) 一种水性化合物，包括水、盐水和/或缓冲液；和/或ii)配制用于经口、直肠、鼻、局部或胃肠外给药。
20.一种调节细胞或组织的生理学或发育的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1的组合物或其拮抗剂接触。
21.一种调节细胞的生理学或发育的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1的组合物接触，并且所述接触导致IFNγ的产生增加。
22.权利要求21的方法，其中所述细胞在宿主生物体内，并且所述生物表现出Th1应答增强。
23.权利要求22的方法，所述Th1应答选自a)抗肿瘤效应；b)佐剂效应；c)抗病毒效应；或d)拮抗过敏的效应。
24.一种调节宿主生物体内细胞的生理学或发育的方法，所述方法包括给予所述生物一种权利要求1的组合物，其中所述接触导致a)抗肿瘤效应；b)佐剂效应；c)抗病毒效应；或d)拮抗过敏的效应。
25.权利要求24的方法，其中所述接触与以下联合a)IL-18；b)IL-12；c)放射疗法或化学疗法；d)免疫佐剂；或e)抗病毒治疗剂。
26.权利要求24的方法，其中所述拮抗剂是抗IL-12受体亚基β1的抗体。
27.权利要求24的方法，其中所述接触是与拮抗剂接触，并且所述接触导致IFNγ的产生相对减少。
28.一种调节宿主生物体内细胞的生理学或发育的方法，所述方法包括将所述拮抗剂给予所述生物，其中所述接触导致以下病症的缓解a)自身免疫病；或b)慢性炎症。
29.一种增加以下物质分泌的方法a)一种灵长类IL-B30，所述方法包括表达所述多肽与IL-12p40；或b)一种灵长类IL-12 p40，所述方法包括表达所述IL-12 p40与IL-B30。
30.权利要求28的方法，其中a)所述增加是至少3倍；或者b)所述表达是表达一种编码IL-B30和IL-12 p40的重组核酸。
31.一种筛选结合权利要求3的所述组合物的受体的方法，所述方法包括使所述复合物与表达所述受体的细胞在允许所述复合物与所述受体结合的条件下接触，由此形成可检测的相互作用。
32.权利要求31的方法，其中所述相互作用导致所述细胞内的一种生理学反应。
33.一种调节动物体内炎症反应的方法，所述方法包括使所述动物体内的细胞与治疗量的以下物质接触a)哺乳动物IL-B30蛋白的激动剂；或b)哺乳动物IL-B30蛋白的拮抗剂。
34.权利要求33的方法，其中a)所述哺乳动物IL-B30蛋白是一种灵长类蛋白质；或b)所述拮抗剂是与所述哺乳动物IL-B30结合的抗体；c)所述拮抗剂是阻断哺乳动物IL-B30所介导信号的抗体。
35.权利要求33的方法，其中所述动物表现出急性期炎症反应的体征或症状。
36.权利要求33的方法，其中所述体征或症状在皮肤组织、肺组织、胃肠组织或肝组织中发现。
37.权利要求35的方法，其中所述体征或症状在皮肤组织、肺组织、胃肠组织或肝组织中发现。
38.权利要求33的方法，其中所述调节是加速嗜中性粒细胞成熟为血小板。
39.权利要求33的方法，其中所述调节对IgA有影响。
40.权利要求33的方法，其中所述调节对IgG有影响。
41.权利要求38的方法，其中所述给药是给予所述激动剂。
42.权利要求39的方法，其中所述给药是给予所述激动剂。
43.权利要求40的方法，其中所述给药是给予所述激动剂。
44.权利要求41的方法，其中a)所述激动剂是哺乳动物IL-B30蛋白；或b)所述动物正经历炎症的体征或症状。
45.权利要求42的方法，其中a)所述激动剂是哺乳动物IL-B30蛋白；或b)所述动物正经历炎症的体征或症状。
46.权利要求43的方法，其中a)所述激动剂是哺乳动物IL-B30蛋白；或b)所述动物正经历炎症的体征或症状。
47.权利要求44的方法，其中所述给药与以下药物联合a)抗炎细胞因子激动剂或拮抗剂；b)镇痛药；c)消炎药；或d)类固醇。
48.权利要求45的方法，其中所述给药与以下药物联合a)抗炎细胞因子激动剂或拮抗剂；b)镇痛药；c)消炎药；或d)类固醇。
49.权利要求46的方法，其中所述给药与以下药物联合a)抗炎细胞因子激动剂或拮抗剂；b)镇痛药；c)消炎药；或d)类固醇。
50.一种诱导记忆T细胞增殖的方法，所述方法包括给予IL-B30或其激动剂。
全文摘要
提供得自哺乳动物的编码细胞因子的纯化基因、包括纯化蛋白质在内的其相关试剂、特异性抗体和编码该分子的核酸。也提供使用所述试剂的方法和诊断试剂盒。
文档编号A61P35/00GK1387571SQ00815400
公开日2002年12月25日 申请日期2000年9月8日 优先权日1999年9月9日
发明者B·奥普曼, R·德瓦尔马莱菲特, D·M·伦尼克, R·A·卡斯特莱恩, M·T·维科夫斯基, S·A·利拉, S·K·纳鲁拉 申请人:先灵公司