一种具有增强鉴别能力的常染色体str基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种PCR扩增试剂盒，尤其涉及一种单管同时检测24个常染色体基因 座、2个Y染色体基因座、1个性别基因座的荧光复合扩增试剂盒，本发明还涉及该荧光复合 扩增试剂盒的制备方法以及该试剂盒在司法鉴定领域中的应用，属于常染色体分型和鉴定 领域。
【背景技术】
[0002] 短串联重复序列（short tandom repeat，STR)是人类基因组中由2-6个碱基作为 核心单位串联重复形成的一类具有长度多态性的DNA序列，其核心单位的数目变化和重复 次数不同构成了 STR的遗传多态性。STR分布广，数目多，约占人类基因组的10%，所包含 的信息量巨大，不同的序列可以产生数以亿计的基因型组合，而每一种组合在群体中出现 的频率都非常低，具有极高的个体鉴定能力，所以常作为遗传标记而被用于DNA分析技术 中法医个体识别、亲缘关系鉴定。随着这一技术的发展，很多的国家利用该项技术建立了犯 罪分子及嫌疑人的DNA数据库，也就是对犯罪嫌疑人的DNA数据进行分析并保存到数据库， 便于进行比对和排查等工作项目。同时也是DNA数据库建立的主流技术。同时，STR基因 座的片段小，容易扩增，适宜于检验微量和降解检材，而且各基因座的扩增条件相似而能够 符合扩增，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点。由于这些优点STR基因座的分型研 宄与筛选早已在国内外人类学、医学遗传学和法医学及各相关领域中得到了广泛的应用。
[0003] 从最早美国FBI选择了 13个STR基因座用于建立DNA数据库--CODIS (CombiTAM DNA Index System) :D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、CSF1P0、 vWA、D8S1179、TP0X、FGA、D16S539。这些STR基因座通常被称为13个核心基因座，目前最 有代表的是美国ABI公司的Identifiler试剂盒和Promega公司的PowerPlex-16焚光检 测试剂盒，均包含了上述的13个核心基因座。但是随着DNA作为鉴定手段的应用越来越广 泛，用户对试剂盒的基因座数目、信息量、扩增时间、检材的适用范围等等有了越来越高的 要求，并随着我国DNA数据库建设规模的不断扩大，数据比对的作用也日益重要，由于数据 比对是建立在相同的STR基因座上的，因此也需要STR试剂盒在基因座上具有兼容性，否则 会导致DNA数据库里部分的数据资源浪费。
[0004] 专利CN101144774(人类STRTYPER PCR扩增荧光检测试剂盒）公开了一种同时分 析人基因组DNA的多个基因座的荧光标记复合扩增系统，用于检测如下21个常染色体基因 座：TPOX、D3S1358、D5S818、FGA、CSF1P0、D8S1179、D7S820、TH01、VWA、D13S317、D16S539、 D18S51、D21S11、D12S391、D19S433、D1S1656、D2S1338、D6S1043、PentaE、PentaD、Amel。
[0005] 为了减少检测时间，提高试剂盒的个体识别能力和累计非父排除率，使其能覆盖 全球大多数国家的DNA数据库，并同时节约试剂和人力成本、提高工作效率。需要研发一种 新的具有增强鉴别能力的常染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供了一种具有增强鉴别能力的常染色体STR基 因座荧光标记复合扩增试剂盒，包含了目前国内外各个生产商所采用的全部基因座，用于 法医鉴定及亲子鉴定。该试剂盒在传承了 CN101144774(STRtyper-21G)中21个基因座下 添加了欧洲常用的SE33、D2S441、D10S1248、D22S1045四个常染色体基因座和辅助性别识 别基因座Amel的Y染色体基因座DYS391和一个Y染色体上的插入缺失片段Y-indel，可以 同时在一次反应中扩增27个基因座，将数据库排查达到了极大的覆盖率，大大的节约了试 剂和人力的成本，同时提高了工作效率。
[0007] 所述的基因座为 D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、Penta E、Y-indel、DYS391、 D12S391、D6S1043、D2S1338、D1S1656、Amel、D5S818、D13S317、D7S820、D19S433、CSF1P0、 Penta D、D2S441、vWA、D8S1179、TPOX、FGA、D16S539、D22S1045、SE33 和 D10S1248。
[0008] 本发明的扩增体系包括引物混合物、反应缓冲液等。
[0009] 首先针对上述27个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性的引物。引物设 计采用Primer5软件，每条引物退火温度在60°C左右。不能产生引物二聚体、其它相互作用 或交叉反应，扩增产物长度在70-500bp之间。对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到 清晰单一扩增条带。引物序列见下表1。
[0010] 表1、各基因座对应引物序列
[0011]
[0015] 本发明通过对各个基因座的合理排列并优选了一系列荧光强度高的荧光染料对 每对引物中的一条进行标记分组，分别为第一组FAM标记：D3S1358、TH01、D21S11、D18S51 和 Penta E，第二组 HEX 标记：Y-indel、DYS391、D12S391、D6S1043、D2S1338 和 D1S1656,第 三组 TAM 标记：D5S818、D13S317、D7S820、D19S433、CSFlPO 和 Penta D，第四组 ROX 标记： D2S441、vWA、D8S1179、TPOX 和 FGA，第五组 Alex 594 标记：Amel、D16S539、D22S1045、SE33 及D10S1248,内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为Atto 633。每组之中通过引物扩增的 片段长短将每个基因座分开，并优化引物序列使扩增范围内不存在非特异的条带，后调整 引物浓度使同个荧光素不同基因座之间的峰高均衡性达到50%，不同荧光素之间的平均峰 高达到30%，其中对Y-indel和DYS391两个Y染色体上的基因座不做均衡性要求，但是需 要在阳性对照0. 125ng下能够进行准确的分型。
[0016] 本发明检测扩增产物的方法为采用多道或单道毛细管电泳遗传分析仪进行测定； 本发明所测定的模板包括人的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官，并且可 以进行直接扩增滤纸、FTA卡、棉絮、口腔拭子等检材。
[0017] 具有增强鉴别能力的常染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒，包括无核酸 水、PCR Master Mix、Primer Mix、Allelic ladder 混合物、内标 size-500。值得一提的是 本发明所采用的PCR Master Mix经过一系列的优化实验使得本产品可以兼容市面上所有 常见的检材类型包括whatman FTA卡、whatman唾液卡、血滤纸、博坤FTA卡、博坤唾液卡、 头发、口腔脱落细胞、提取DNA等各种检材，这在国内甚至国外的试剂盒也尚未做到，除此 之外，该种改良后的缓冲液能极大的提高扩增效率，有效缩短产物末端腺苷酰化的时间，缩 短整体的扩增时间，并能够提高长片段的扩增效率，改善了产品的均衡性。其主要成分有： DMSO、Tris-buffer、氯化钾、硫酸按和dNTP等。
[0018] 扩增反应需要的酶为热启动DNA聚合酶，抗体修饰或化学修饰均可，本反应的体 系中需要加入2U-4U的酶。
[0019] 扩增体系在各种反应热循环仪上（如ABI9700、ABI9600、Bio-Rad S1000等）采 用以下的程序可以得到较好的结果：95°C保温2-10分钟；94°C保温5-10秒钟，61°C保温60 秒钟，70°C保温30-60秒钟，该步骤运行28个循环；60°C保温15-30min，4°C保温。
[0020] 本发明由于采用了荧光标记的引物，扩增产物也带有荧光标记物