日本当归的检测试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种日本当归的检测试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 日本当归为东当归（Angelica acutiloba(Sieb. et Zucc. )Kitagawa)的干燥根 茎，主产于日本，早在20世纪70年代，此种就在中国吉林省延吉市引种成功，朝鲜族常用， 并称之为东当归。日本当归功效与我国原产正品当归类似，主治月经不调，经来腹痛，腰痛、 崩漏，大便干燥，痢疾腹痛等症。但是二者在化学成分、有效含量均有较大的差异，并且日本 当归含有有毒成分，存在用药安全问题。
[0003] 因此，有效鉴别日本当归，对其进行适当处理并合理使用是非常必要的。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的、方便、快速、准确地检测日本 当归的试剂盒和方法。
[0005] 本发明提供了 SEQ ID NO. 1所示的种核苷酸序列。
[0006] 本发明还提供了检测SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的试剂在制备日本当归检测试 剂中的用途。
[0007] 所述检测SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列的试剂包括扩增SEQ ID NO. 1所示核苷酸 序列的试剂。
[0008] 所述日本当归是伞形科植物日本当归Levisticum officinalis Koch所述扩增的 试剂包括SEQ ID NO. 2~3所示的引物对。
[0009] 本发明检测日本当归的试剂盒，包括检测SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列的相关试 剂。
[0010] 所述试剂包括扩增SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的试剂。
[0011] 所述扩增的试剂包括SEQ ID NO. 2~3所示的引物对。
[0012] 本发明一种日本当归的检测方法，包括如下步骤：
[0013] a，DNA提取：提取待检样本中的DNA ;
[0014] b，检测：用前述的试剂盒检测待检样本，即可。
[0015] 本发明SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列为日本当归特异性序列，通过检测这些序列 可以准确区分日本当归与当归、欧当归，从而有效鉴定待检样本是否为日本当归，为药材的 合理使用提供指导，本发明方法操作简便，具有良好的应用前景。
[0016] 下面通过【具体实施方式】对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限 制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述 基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，都是本发明保护的内 容。
【附图说明】
[0017] 图1.欧当归的改良RAH)扩增。箭头为A1-34的RPAD片段，用于胶回收和克隆。
[0018] 图2阳性克隆的菌落PCR鉴定。蓝色所指通道的阳性克隆用于Sanger测序。通 道"M"显示有分子重量（bp)的DL2000DNA标记。泳道1-6分别代表不同阳性克隆的菌落。
[0019] 图3不同物种及当归品种的鉴定。通道1-18号分别为甘肃岷县当归，日本当归， 四川阿坝当归，甘肃平凉当归，湖北当归，四川九寨当归，欧当归，云南丽江当归，四川绵阳 当归，银杏，荔枝，龙眼，青果，金银花，栀子花，灵芝，龙荔，赶黄草。蓝色所指的通道2为日 本当归，通道7为欧当归。通道"M"显示有分子重量（bp)的DL2000DNA标记。
[0020] 图4不同日本当归品种的鉴定。通道1、2和3是日本当归，分别来自重庆，四川峨 眉，延吉吉林；通道4和5是欧当归，来自长春吉林和四川甘孜；6是正常岷县当归；通道"M" 显示有分子重量（bp)的DL2000DNA标记。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1 RAPD技术扩增日本当归特异SCAR标记
[0022] 一、CTAB法提取植物DNA
[0023] 取日本当归0. 2g置于I. 5mL EP管中，加入液氮约半分钟后用研钵棒碾碎成细粉， 立即加入 500 μ 1 的 CTAB 提取缓冲液[CTAB2% ,Tris-HCl (ρΗ8· 0) IOOmmol. L-SEDTAZOmmol mmol. L-\NaCL I. 4mol. L-SO. 4%的β -巯基乙醇]，60°C水浴保温1小时后，加入等体积的 氯仿-异戊醇（24 :1)抽提，轻颠倒混匀，10000转每分钟离心10分钟，吸取上清液，取上清 加入2/3体积的预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀；12000转每分钟离心10分钟，弃上清， 小心倾去上清液，沉淀用70%乙醇和无水乙醇各轻洗一次，弃洗液，留沉淀，空气干燥。用 100 μ 1的I X TE溶液溶解备用。将样品用1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，用 分光光度计测定浓度，稀释至浓度IOng/μ 1，-20°C保存备用。详见《精编医学分子生物学 实验指导》（中国医药科技出版社，主编：傅俊江）。
[0024] 二、RAPD 技术 PCR 扩增
[0025] 利用 RAPD 技术进行扩增（参照 Fu J, Yang L, Khan MA, Mei Z (2〇I3) Genetic characterization and authentication of Lonicera japonica Thunb. by using improv ed RAPD analysis. Mol Biol Repj40(10):5993-9)：
[0026] 以步骤一提取的核酸作为模板，用RAH)引物SBA-Al和SBS-A2进行扩增（序列见 表1，北京赛百盛公司合成），PCR扩增采用10 μ 1反应体系包括μ 1的引物（2.5 μmol/ L)，1. 5 μ I (15ng)模板 DNA，5 μ 1 的 2 X PCR Taq Mastermix (天根生物公司，北京）和 2. 5 μ 1的灭菌双蒸水。充分混勾后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪（Applied Biosystems Veriti? 丨 96-Well Thermal Cycler，Life Technology, USA)。PCR 反应条件是： 95°C I分30秒，94°C 40秒，36度60秒，72°C I分30秒，40个循环，最后72°C 5分钟，其中 RAMP为5%。然后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，曝光显色。
[0027] 表 1
[0028]
[0029] 琼脂糖凝胶电泳（参见《精编医学分子生物学实验指导》，中国医药科技出版社， 主编：傅俊江）：
[0030] (1)制备1. 5%的琼脂糖凝胶，将PCR产物按顺序全部点样到凝胶孔内，同时点样 一个DNA分子大小标记（DL2000, TIANGEN公司，北京）。注意：不需要加载样缓冲液，PCR扩 增用的2Xmix就预加了相关成分。
[0031] (2)电泳（电泳仪由北京百晶生物有限公司生产，BG-subMID Icell)，常选择电压 110V，电泳时间30min即可，
[0032] 三、RAPD扩增条带的分离
[0033] 1.片段回收
[0034] 1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下剪切图正品日本当归品种的特异片段A1-0， 用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根生物公司）回收RAPD扩增的DNA片段。
[0035] 2.克隆
[0036] 接着利用pGEM-T载体（Promega Corporation)和回收RAPD扩增的DNA片段在 T4-DNA连接酶作用下连接（16°C连接8小时）。连接后加入30 μ 1活化的DH5 α细菌，冰 浴30分钟，接着42 °C激活45秒，然后冰浴2分钟，再加入300 μ 1无氨苄青霉素的LB培养 基（配制方法：12. 5克LB粉加500ml水高温灭菌）200转每分钟摇动45分钟，然后将液体 均匀涂抹在含氨苄青霉素的固体LB培养基表面，37°C培养15小时[固体培养基配制方法： 12. 5克LB粉，7. 5克琼脂粉和500毫升水高温灭菌后，在50°C时加入500 μ 1的氨苄青霉素 (100mg/ml)，使用前在固体培养基表面涂抹40 μ 1的20mg/ml的X-GAL (5-溴-4-氯-3-吲 哚-β -D-半乳糖苷）和20 μ 1的24mg/ml的IPTG (异丙基硫代半乳糖苷）]进行蓝白筛 选，筛选白色菌落进行菌落PCR鉴定。
[0037] 3.阳性克隆鉴定
[0038] 每个皿挑选多个白色菌落，分别加入到300 μ 1含氨苄青霉素的LB液体培养基中， 220转每分钟摇2-4小时，取0. 2~0. 5 μ 1培养基进行菌落PCR反应。10 μ 1体积的反应 体系是：2XPCR Taq Mastermix 5yl，DNA 0·5μ1，通用引物（SP6+T7)lyl(2.5ymol/L)， 水3. 5 μ 1。PCR反应条件是：95 °C 1分30秒，94°C 40秒，58 °C 30秒，72 °C 40秒，30个循环， 最后72°C 5分钟。然后用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色、曝光显色。
[0039] 4.结果
[0040] 改良RAro扩增见图1。阳性克隆的菌落PCR扩增和电泳鉴定结果如图2。
[0041] 五、测序分析
[0042] 1.测序
[0043] 挑选阳性克隆，进行Sanger测序。测序的核苷酸序列如下（SEQ ID NO. 1所示）：
[0044] CAGGCCCTTTATCGGCTACGGACTAATAAACAATGCCAACACAAGAAAATATCAACACCTCACTATA ATAAAAGGGTCAATAGAAATTAG