一种向日葵白锈病菌和黑茎病菌的多重dpo-pcr检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种向日葵白锈病菌和黑茎病菌的多重 DPO-PCR检测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 向日葵白锈病菌（Albugo tragopogonis(Pers. )Gray)是引起向日葵白锈病的病 原菌，该病菌在国外少数国家和地区严重发生、经济影响大、传入风险高，成为国际上关注 的检疫性有害生物。向日葵黑莖病菌（Leptosphaeria lindquistii Frezzi)是引起向日 葵黑茎病的病菌，严重的病田发病率达100 %，对向日葵生产造成毁灭性危害，是一种重要 的检疫性病原菌。因此，对这两种病原菌进行准确的检疫鉴定非常重要，而传统形态学方法 鉴定周期长、时效性差。利用血清学和分子生物学技术鉴定这两种菌的方法已有建立，包括 PCR、RFLP等，但这些方法有些需要酶切，检测过程复杂；有些特异性不强或依赖较昂贵的 仪器设备，难以在实验室之间推广。因此，建立一种特异性强、且能同时快速检测这两种菌 的检测方法显得非常重要。
[0003] DPO(Dual priming oligonucleotide)引物技术的主要原理为其引物包含两个各 自独立的特异性引物区域，5'端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3'端序 列由6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄 嘌呤（In 〇Sine，I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄 嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5'和3'区域形两个独立功能的双特异性引物结构，并 且研宄表明5'和3'引物区域中任何有3个及以上碱基的错配，PCR反应将不能进行，而 且由于其特殊的结构，引物自身以及引物之间很少形成二级结构且对退火温度不敏感。该 技术的优点主要在于它对退火温度、镁离子浓度等影响普通多重PCR的关键因素不敏感， 适用范围广，而且该技术特异性强，扩增效率高，为多重PCR技术的应用提供了新的前景。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是如何检测待测菌株是向日葵白锈病菌和向日葵黑茎 病菌。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈 病菌还是向日葵黑茎病菌的引物组。
[0006] 本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌 的引物组由引物1、引物2、引物3和引物4组成：
[0007] 所述引物1为SEQ ID No. 1所示的单链DNA分子；
[0008] 所述引物2为SEQ ID No. 2所示的单链DNA分子；
[0009] 所述引物3为SEQ ID No. 3所示的单链DNA分子；
[0010] 所述引物4为SEQ ID No. 4所示的单链DNA分子。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测或辅助检测待测菌株是向日葵白 锈病菌还是向日葵黑茎病菌的PCR试剂。
[0012] 本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌 的PCR试剂包括上述引物组。
[0013] 上述PCR试剂中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4在所述PCR试 剂中的终浓度均为〇· 4 ymol/Lo
[0014] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测或辅助检测待测菌株是向日葵白 锈病菌还是向日葵黑茎病菌的试剂盒。
[0015] 本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌 的试剂盒包括上述引物组或上述PCR试剂。
[0016] 上述引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测菌株是向日葵 白锈病菌还是向日葵黑茎病菌中的应用也属于本发明的保护范围。
[0017] 上述引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在区分或辅助区分向日葵白锈病菌和 向日葵黑茎病菌中的应用也属于本发明的保护范围。
[0018] 为解决上述技术问题，本发明最后提供了一种检测或辅助检测待测菌株是向日葵 白锈病菌还是向日葵黑茎病菌的方法。
[0019] 本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌 的方法包括如下步骤：
[0020] (1)用上述引物组对待测菌株进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0021] (2)检测所述PCR扩增产物的大小；
[0022] 若所述PCR扩增产物含有大小为307bp的片段，则待测菌株为或候选为向日葵白 锈病菌；
[0023] 若所述PCR扩增产物含有大小为388bp的片段，则待测菌株为或候选为向日葵黑 茎病菌
[0024] 上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测菌株的基因组DNA。
[0025] 上述方法中，所述PCR扩增为多重DP0-PCR。
[0026] 上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为45-65°C。
[0027] 上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为60°C。
[0028] 上述方法在检测或辅助检测向日葵白锈病和/或向日葵黑茎病的病菌中的应用 也属于本发明的保护范围。
[0029] 本发明根据向日葵白锈病菌大亚基核糖体RNA基因序列和向日葵黑茎病菌的 ITS-5.8S rRNA基因序列，设计了特异性DPO引物，并基于该引物建立了向日葵白锈病菌和 向日葵黑茎病菌的多重DPO-PCR检测方法，可同时对向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌进 行定性检测。通过实验证明：本发明的多重DPO-PCR方法特异性好，灵敏度高，而且对退火 温度不敏感，适用范围广，基于多重DPO-PCR方法对向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌进 行定性检测方法灵敏、准确、简便和快速，对进出口相关货物及产品检验检疫、病害防治预 测具有指导意义。
【附图说明】
[0030] 图1为多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测结果。其中，I :向日葵黑茎病菌和向日 葵白锈病菌；2 :向日葵黑茎病菌；3 :向日葵白锈病菌；4 :阴性对照。
[0031] 图2为特异性实验的电泳检测结果。其中，1 :向日葵黑茎病菌和向日葵白锈病菌； 2 :向日葵黑茎病菌；3 :向日葵白锈病菌；4 :向日葵黑白轮枝菌；5 :向日葵大丽轮枝菌；6 : 向日葵茎溃疡病菌；7 :向日葵霜霉病菌；8 :向日葵菌核病菌；9 :向日葵褐斑病菌；10 :向日 葵锈病菌；11 :阴性对照。
[0032] 图3为退火温度敏感实验的电泳检测结果。其中，1-5 :退火温度分别为45°C、 50°C、55°C、60°C和 65°C。
[0033] 图4为灵敏度实验的电泳检测结果。其中，1-5 :2种病原菌DNA模板量依次为 50ng、5ng、0. 5ng、0. 05ng 和 0· 005ng。
【具体实施方式】
[0034] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0035] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036] 下述实施例中的向日葵白锈病菌（Albugo tragopogonis(Pers. )Gray)在文献"向 日葵白锈病菌巢式PCR检测方法的研宄"中公开过，公众可从伊犁出入境检验检疫局获得。
[0037] 下述实施例中的向日葵黑莖病菌（Leptosphaeria lindquistii Frezzi)在文献 "向日葵黑茎病菌分离检测及其RFLP分析"中公开过，公众可从伊犁出入境检验检疫局获 得。
[0038] 实施例1、一种检测向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的方法
[0039] 一、多重DPO-PCR引物组的设计
[0040] 根据向日葵白锈病菌大亚基核糖体RNA基因序列和向日葵黑茎病菌的 ITS-5. 8SrRNA基因序列，设计了如下检测向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的多重 DPO-PCR检测引物组（引物序列中的I为次黄嘌呤）：
[0041] BS-DPO-F :CGAATTGTAGTCTATCGAGGCCAAGIIIIIACGCAGGATCC(序列 1);
[0042] BS-DPO-R :GGAATGGACAGCGGACGCIIIIIGCTTCCCT(序列 2);
[0043] HJ-DPO-F :GATGCCGGTACTCTGGGTCTTTIIIIICATGTACC(序列 3);
[0044] HJ-DPO-R :ATTGTTTTGAGGCGAGTTTCCCIIIIIGGAAACAT(序列 4);
[0045] 其中，BS-DPO-F和BS-DPO-R为检测向日葵白锈病菌的引物，产物大小为307bp ; HJ-DPO-F和HJ-DPO-R为检测向日葵黑茎病菌的引物，产物大小为388bp。
[0046] 二、检测向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的方法
[0047] UDNA 的提取
[0048] 参照试剂盒操作（植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02,天根生物科技有 限公司）分别提取向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的基因组DNA。
[0049] 2、多重 DPO-PCR 扩增
[0050] 采用 BS-DPO-F、BS-DPO-R、HJ-DPO-F、HJ-DPO-R 共 4 条多重 DPO-PCR 引物，分别以 如下四组的基因组DNA为模板进行多重DPO-PCR扩增，分别得到多重DPO-PCR扩增产物：
[0051] 组1以向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的基因组DNA(向日葵白锈病菌和向日 葵黑茎病菌各1 μ L)为模板；
[0052] 组2以向日葵黑茎病菌的基因组DNA为模板；
[0053] 组3以向日葵白锈病菌的基因组DNA为模板；
[0054] 组4以超纯水为DNA模板（阴性对照）。