专利名称：通过阻断负调控基因提高格尔德霉素发酵产量的方法
技术领域：
本发明涉及利用分子生物学操作技术、通过阻断生物合成调控基因提高抗生素产量的方法。
背景技术：
吸水链霉菌17997(Streptomyces hygrocopicus 17997)是中国医学科学院医药生物技术研究所从中国土壤中分离到的，经鉴定其发酵产物为格尔德霉素(geldanamycin，GDM)，该抗生素具有抗肿瘤和广谱抗病毒的作用。近年研究显示，GDM可以特异性抑制热休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)的功能。Hsp90是许多信号蛋白的伴侣分子，GDM通过对Hsp90的抑制，可以间接影响细胞内信号蛋白的功能，因此GDM是一种很有潜力的抗肿瘤和抗病毒药物。吸水链霉菌17997产生GDM的过程诸如微生物次级代谢产物生物合成，是一个有多种酶参与并极其耗能和消耗底物的生化过程。因此，其合成过程受到非常严格的调控，如当微生物的生长不受限制，能以最佳速度进行时，次级代谢产物的合成一般会受到抑制；只有当生长速度因某种营养因素受限或环境条件不利而减慢时，便引起细胞分化和次级代谢产物的合成。因此，环境因素中过剩的营养往往对次级代谢产物的合成起着负调节作用。适宜的环境因素如温度、pH、溶解氧水平、适度的营养供应等均有利于次级代谢产物的合成。除环境因素对次级代谢产物合成的生理性调节以外，还存在着对不同抗生素生物合成途径所形成的代谢产物的途径特异调控因子。如参与放线紫红素和十一烷基灵红菌素合成的调控基因actII-orf4和redD基因；链霉素产生菌灰色链霉菌中的调节基因strR；棒酸产生菌中的ccaR基因等。它们大多数对生物合成是正调控基因起着转录激活的作用。对抗生素生物合成起负调节作用的基因比较少见。负调节基因是指该基因的存在不利于生物合成基因的转录与表达。如果将负调控基因破坏，将有利于抗生素的形成。迄今相关的报道有与次甲基霉素生物合成相关的负调控基因mmyR，参与放线紫红素生物合成的负调控基因actII-orf1，四并菌素生物合成中的负调控基因tcm R等，这些基因均与抗生素的抗性基因连锁，有的与抗生素输出胞外机制相关，它们可能是通过抗性的调节来调控抗生素的产生，从捷达霉素产生菌中也发现了负调控基因iadR2。通过阻断其基因，捷达霉素发酵产量提高了41％。本实验室在研究吸水链霉菌17997格尔德霉素的生物合成基因簇中，通过序列分析比较，发现在基因簇内有两个调节基因gdm RI和gdm RII，属于LuxR家族。在吸水链霉菌NRRL3602中也曾有过类似基因的报道[Rascher A，et al(2003)FEMS Microbiol Lett.218(2)223-230]。已知LuxR家族的基因在革兰氏阴性菌中普遍存在，是群体感应(Quorum sensing)系统中的受体蛋白，在其N端有ATP/GTP结合结构域WalkerA/B基序，在C端有DNA结合结构域螺旋—转角—螺旋结构域(helix-turn-helix)，分子量比较大。在链霉菌中也发现了LuxR家族的蛋白，如Streptomyces avermitilis MA4680 oligomycin基因簇中olmRI，avermictin基因簇中ave R，Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253的rap H，莫能素产生菌Streptomyces cinnamonensis的mon H，苦霉素产生菌Streptomyces venezuelae的pik D，匹马菌素产生菌Streptomycesnatalensis的pim R等基因编码蛋白。对大多数这类基因的调控方式还不十分清楚，而对苦霉素产生菌Streptomyces venezuelae中pik D调节基因的研究表明，pik D为正调控基因，它参与苦霉素聚酮合酶及其糖苷化的调控，但是不影响羟基化酶的功能，其调控是发生在聚酮合酶PikAI、Pik抗性基因RI和糖苷化基因desI的启动子，而对抗性基因和羟基化酶基因pik C启动子无影响。在Streptomyces natalensis中pim R是调控匹马菌素的正调节基因，激活其合成匹马菌素的相关基因。吸水链霉菌格尔德霉素产生菌中有关两个LuxR家族的调节基因gdm RI和gdm RII的具体功能和调控作用迄今尚未见有报道。本发明通过基因阻断的方法，研究证明gdm RII是一个负调控基因，将该基因破坏后获得的格尔德霉素变株—吸水链霉菌17997-WHLR-2的GDM发酵产量可以提高近60％。本发明的目的在于，通过阻断吸水链霉菌17997中格尔德霉素生物合成负调控基因gdm RII的方法，以提高格尔德霉素的发酵产量。
发明内容
本发明所说的通过阻断负调控基因gdm RII提高格尔德霉素发酵产量的方法主要包含以下步骤1.gdm RII基因的获得与序列分析利用参与格尔德霉素生物合成的氨甲酰基转移酶(CT)基因序列(Genbank AY179507，gdmN)，设计引物，经PCR获得732bp产物，以此为探针，从S.hygroscopicus 17997基因柯斯质粒文库(本实验室构建)，经菌落杂交、分子杂交及核苷酸序列测定，确定柯斯质粒pCT4中含有gdm RII基因。经同源性比较表明，gdm RII基因产物属于LuxR家族，它们是一族转录调节因子，其C端含有保守的螺旋—旋转—螺旋(helix-turn-helix)与DNA结合域，gdm RII的N端含有ATP结合域(ABC输出)，含有WalkerA/B基序。
2.构建gdm RII基因阻断重组载体采用基因同源重组原理，通过PCR的方法或利用gdm RII基因序列中的酶切位点分别扩增或克隆两个同源片段，每个片段的大小应基本相符并大于500bp，在两个同源片段中间连入可供选择的标记基因，再将三片段的连接产物克隆到具有另一种选择标记的大肠杆菌及链霉菌穿梭载体pGH112、pKC1139等，构建gdm RII基因阻断载体pGARII。
3.gdm RII基因阻断变株的筛选和获得将构建的gdm RII基因阻断载体，通过接合转移，导入吸水链霉菌S.hygroscopicus 17997中，获得接合转移子。将接合转移子进行传代培养，根据插入标记和载体上原有标记基因进行筛选，获得gdmRII基因同源基因片段与宿主菌染色体基因双交换的基因阻断菌株。利用PCR的方法，验证gdm RII基因的阻断。
4.gdm RII基因阻断变株发酵产量的检测gdm RII基因阻断变株进行发酵，其发酵产物经提取后用HPLC进行检测，结果表明，基因阻断株GDM发酵产量提高近60％，证明gdm RII基因为GDM生物合成负调控基因，其阻断后有利于GDM的形成。
发明效果本发明通过实验首次证明，gdm RII基因为GDM生物合成负调控基因，通过阻断吸水链霉菌17997中格尔德霉素生物合成负调控基因gdm RII，可以提高格尔德霉素的发酵产量近60％，为格尔德霉素的工业化生产创造了有利条件，也在利用分子生物学操作技术、通过阻断生物合成调控基因提高抗生素产量的理论与实践方面探索和拓宽了一条新路。
图1.以吸水链霉菌17997基因组DNA为模板，用CT引物PCR扩增产物电泳图其中1-DLDL2000DNA分子量标准2-PCR产物图2.gdm RII基因阻断载体的构建图3.gdm RII基因阻断变株PCR验证结果其中M-DNA分子量标准DNA MakerIII1-17997原株对照2-gdm RII基因阻断变株17997-WHLR-2图4.gdm RII基因阻断变株发酵产物GDM的HPLC检测其中A-17997原株对照B-gdm RII基因阻断变株17997-WHLR-2HPLC中保留时间在25min左右的主峰为GDM具体实施方案以下实施例对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，其目的是为进一步加深对本发明的理解。
实施例1gdm RII基因的获得与序列分析根据Genbank AY179507，以格尔德霉素生物合成相关的氨甲酰基转移酶基因gdm N序列编码蛋白的保守区设计引物上游引物15’CCGGAATTCTGGGCCACCGCAGCATCGTC 3’下游引物25’CCGGAATTCTGAGGAACCGCTGCTCCCAC 3’(划线部分为便于克隆加入的的EcoRI酶切位点)以吸水链霉菌17997的基因组DNA为模板，经PCR反应扩增出732bp目的条带(图1)。以此为探针，通过与吸水链霉菌17997基因柯斯文库菌落杂交和Southern分子杂交，将gdm N基因定位在6个柯斯质粒pCT1-6上，对柯斯质粒pCT4的外源片段所含基因序列进行测序，从中发现含有完整的gdm RII基因。该基因由2784bp(SEQ ID No1)组成，编码927个氨基酸的蛋白序列(SEQ ID No2)。经过同源性比较，本发明从链霉菌17997中所获得的Gdm RII与Streptomyceshygroscopicus NRRL3602中的Gdm RII一致性为90％。
实施例2构建gdm RII基因阻断载体引物设计根据gdm RII基因序列，设计两对引物上游引物35’-CCGGAATTCTTCACCGAGCAGGAGGAC-3’下游引物45’-CTAGTCTAGATCCAATGGCTCAGCAAGTC-3’上游引物55’-AAACTGCAGTCATGGTCGCCGGAGCT-3’下游引物65’-CCGGAATTCCGCCGCACAGCAGAAAG-3’(划线部分为加入的克隆位点EcoRI、XbaI、PstI位点)以链霉菌17997为模板，通过PCR的方法，用primer3和4扩增出带有EcoRI和XbaI位点1200bp的gdm RII上游同源基因片段，用primer5和6扩增出另外一段带有PstI和EcoRI 1000bp的gdm RII下游同源基因片段。在gdm RII上、下游两个同源基因片段之间，通过XbaI和PstI位点，插入阿泊拉霉素(apramycin，Am)抗性基因(1500bp)片段，并通过EcoRI位点将此三个基因片段与pGH112载体(含有硫链丝菌素抗性，tsrR)[购自中国科学院微生物研究所，菌种保藏中心]相连，得到pGARII重组载体(图2)。
实施例3gdm RII基因阻断变株的筛选与获得将构建好的重组载体pGARII转化到含辅助质粒的大肠杆ET12567/pUZ8002[购自英国John Innes Centre，网址www.jic.ac.uk]中，以载体pGH112上的Amr为筛选标记，从筛选到的Amr转化子中提取质粒，验证其分子量大小。将含pGARII重组载体的大肠杆菌ET12567/pUZ8002与链霉菌17997成熟孢子混合，涂布在MS平板培养基(甘露醇2％，黄豆粉2％，琼脂2％)上28℃共培养。次日，用含有Am(50ug/ml)和萘啶酸(100ug/ml)的无菌水覆盖MS平板。将Amr接合转移子在含有Am抗性的MY培养基(葡萄糖0.4％，酵母膏0.4％，麦芽浸膏1％，琼脂2％)中传代培养。确证其为阿泊拉霉素抗性接合转移子，然后在不含Am抗性的MY培养基中传代数次，使重组载体pGARII上的gdm RII基因的两个同源基因片段与链霉菌17997染色体发生双交换，表现为载体pGH112上硫链丝菌素抗性、tsrR的丢失。通过接合转移子Amr和Tsrs的筛选，获得gdm RII基因阻断变17997-WHLR-2。提取gdm RII基因阻断变株17997-WHLR-2总DNA，以引物3和6进行PCR反应(图3)。由图3可见，17997-WHLR-2变株中由于在gdm RII基因中插入了Amr基因，故其PCR产物比原株大1500bp。由此证明17997-WHLR-2为gdm RII基因阻断变株。
实施例4gdm RII基因阻断变株的GDM发酵产量检测将gdm RII基因阻断变株—链霉菌17997-WHLR-2涂布在加有Am(50ug/ml)的MY培养基上，在28℃恒温箱中培养7天后，接种到种子培养基(葡萄糖1％，酵母浸膏0.4％，玉米浆0.5％，棉子饼粉0.5％，KH2PO40.05％，MgSO40.05％，CaCO30.3％)，在28℃的摇床培养24-28h后，转种到发酵培养基(淀粉2％，棉子饼粉0.5％，葡萄糖0.5％，玉米浆0.5％，酵母粉0.5％，CaCO30.2％)，28℃的摇床发酵培养5天，用乙酸己酯萃取发酵培养物的上清，提取物进行HPLC检测(图4)。该变株进行了3批次发酵、提取和HPLC重复实验。由图4可以清楚地看到，原株GDM产量在HPLC检测中所占峰面积为45.1％(图4A)，gdm RII基因阻断变株17997--WHLR-2的GDM产量峰面积为76.2％(图4B)，GDM产量提高值达59.2％。
本发明通过实验首次证明，gdm RII基因为GDM生物合成负调控基因，通过阻断吸水链霉菌17997中格尔德霉素生物合成负调控基因gdm RII，可以提高格尔德霉素的发酵产量。
序列表<110>中国医学科学院医药生物技术研究所<120>通过阻断负调控基因提高格尔德霉素发酵产量的方法<160>2<210>1<211>2784<212>DNA<213>吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)<220>
<221>CDS<222>(1)(2784)<400>
atgcccttca gctatgccat gccggtgaat accgagcgga attcccatcc gatggacacg60gtattgaatg ccgcggcgca cctcggacac gcgttcggtg actctttggt gcggcccggg120caggctcttc tcctggacgg accgctggca tgcggtaaga ccaccctgct ccggtcgttc180gccgagcggg ccgcggcggc cggccggctc gtcatcacgg cgacgtgttc tccctgcgag240cgggatcttc ccttcggtgt cgtctcccaa ctggcccgcg gcgcccggaa gtcagcgggc300gggccgcccg aggtgccggg gctgccggac atcctccgcg ggaccagcga cccggtggac360cgggccgaga tcgcccggct gtgccatcgg ctgtgcacct tgctgatcga ctacgcggaa420cacaccccgc tgctgctcgc cgtggacgat gtgcgccaca gcgatccggc ctccgcgcac480ttcctcctcc aactggtgcg gcggctggac tcggcacgga tcgccgccgt gttcaccgac540gatctgagcc tgcccgcgcc caccctgccg ctccgctacg aactgctgcg ctcccagcgc600ctgcaccgga tcggcctcgg cccgctcacc cccgacgagg tggccgacgt ggtcgtggcg660gagctggggg agaccgcgag cccccgcgcc ggcgatgtct acgccgccac cggtggcaac720cggctgctgc tgcacaccct gctggccgac taccgcgagc acggcgaggc ccgccagacc780ggctatggcc agtccttcct gagctgtctg caccgcaatg agccgatctt cctggacgtg840gtgcgcgcgc tggccgtggt gggcttctcc ttgcccgcca ccgacctggc ctggctgacc900ggacacgagc ccgagcccat cggccaggtg ctggcggcgc tgaccggcgc cggactgatg960gacgagggcg cgttccggca ggaggcggcg cggctgagcg tgctcaacga cacgccggcg1020ctgacccgca ggaccctgca ccagcgggcc gcgcggctgc tgcacgacca gggcaggccc1080gccaccacga tcgcccgtca tctggtgcgg gccgggcgga tccccgattc atggtcgccg1140gagctgctgc tggaagtggc cgagcaggtc gcggtgggcg aagaggcgtc cgtcgccgtc1200gacttactgg agcagtccct cgaacagtgt ccgcaccagg agcggcgcgc cgccttgcag1260gcgaagctcg ccgaggcgga atggaagatc aacccgtcca ccgccacccg gcaccacaca1320ccgctgtacg gcgccgtccg ggccggccgg ctcggcctcc ccgacagcgt caccctgctc1380atgcagctgc tgtggaaggg cgggctgacc gaggtggagg ggctgctcgc ccatctgcgc1440gaggaccccg ccgccaccga ccagctccat gccatcgagg ccgcgctcac ctgcacctac1500ccctggctcg cggagcggcg gccggccccg gcgcaccacg gtggctccgc cgcgacgcgg1560gcggcggtgt ggccgcgggc cggcaccgta ctcgcggacg tgctcaccgg cgggcagacc1620catgacaccg tccggcgggc cgaggaggtg ctgcgcgaac tccagctcgg gcacgacccg1680gcgtgccagg agcaggccgg gctgttcgcc ctgctcgcgc tggtctacgg cggccggatc1740gacctggcgt ccgcatggtg cgagggggcg ctcggcgaga ccggcgcggg gccgcacgtc1800ccgatgcggc aggcggtgct ggcggcggcc aggtcggaga tcgcgctgcg ccgaggtgac1860
ctcgccgagg ccgcggagcg gtcccgggcc gccctcaccc acgcctctcc cggcgcctgg1920ggtgtcgcgg tcgggctgcc gctcggctcc ctgatcctgg cgtgtacgcg gatgggccgg1980cacgaggagg cggggttcca cgtcgcgcag accgtgccca acgccatgtt caaaagctcc2040tacgggctgc actacctgta cgcgcgcggc cactacttcc tggcggccgg ccggcaccag2100gccgcgctcg cggactttct gctgtgcggc gagctgctca ccgactgggg gctgagcagc2160ggctgcgacc cggtgccatg gcggatcggc gcggcggagg catggctcgc gcagggcaac2220cacgaccagg cccggatcct ggtctaccag cagctcagcc gtccgcatac ggacggcgcc2280cgggcccgcg ggcagtcctt gcgcctcctg gccgccacca gctcggccaa gcggcggccg2340cagctgctca acgaggcggt gggcctgttc accgagcagg aggacaagta cgagctggct2400cgcacgctgt gggacctcag ccaggcgtac cacgcgctcg gcgagaagaa gcaggcccgc2460cggaccatgc gccgggcctg gcatgtggcg aagatgtgcg acgccgcgtc gctgtacgag2520gagtggctgc cggccgacga ccagtcccag gccgtggcgc cggctccgaa ggcggacgcc2580gggatcgagc ggttgacgca ctccgaacgg cgtgtcgcgt cgctggccgc catgggctac2640accaaccggg agatcgccgg gaagctgtat gtcacggcca gcacggtgga gcagcatctg2700acccgggtct tccgcaagct ggacatcaag caccgggagc agctgcccac cgaactctac2760gcggaccgca tggagttggc gtga 2784<210>2<211>927<212>PRT<213>吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)<220>
<400>
Met Pro Phe Ser Tyr Ala Met Pro Val Asn Thr Glu Arg Asn Ser His1 5 10 15Pro Met Asp Thr Val Leu Asn Ala Ala Ala His Leu Gly His Ala Phe20 25 30Gly Asp Ser Leu Val Arg Pro Gly Gln Ala Leu Leu Leu Asp Gly Pro35 40 45Leu Ala Cys Gly Lys Thr Thr Leu Leu Arg Ser Phe Ala Glu Arg Ala50 55 60Ala Ala Ala Gly Arg Leu Val Ile Thr Ala Thr Cys Ser Pro Cys Glu65 70 75 80Arg Asp Leu Pro Phe Gly Val Val Ser Gln Leu Ala Arg Gly Ala Arg85 90 95Lys Ser Ala Gly Gly Pro Pro Glu Val Pro Gly Leu Pro Asp Ile Leu100 105 110Arg Gly Thr Ser Asp Pro Val Asp Arg Ala Glu Ile Ala Arg Leu Cys115 120 125His Arg Leu Cys Thr Leu Leu Ile Asp Tyr Ala Glu His Thr Pro Leu130 135 140Leu Leu Ala Val Asp Asp Val Arg His Ser Asp Pro Ala Ser Ala His145 150 155 160Phe Leu Leu Gln Leu Val Arg Arg Leu Asp Ser Ala Arg Ile Ala Ala165 170 175
Val Phe Thr Asp Asp Leu Ser Leu Pro Ala Pro Thr Leu Pro Leu Arg180 185 190Tyr Glu Leu Leu Arg Ser Gln Arg Leu His Arg Ile Gly Leu Gly Pro195 200 205Leu Thr Pro Asp Glu Val Ala Asp Val Val Val Ala Glu Leu Gly Glu210 215 220Thr Ala Ser Pro Arg Ala Gly Asp Val Tyr Ala Ala Thr Gly Gly Asn225 230 235 240Arg Leu Leu Leu His Thr Leu Leu Ala Asp Tyr Arg Glu His Gly Glu245 250 255Ala Arg Gln Thr Gly Tyr Gly Gln Ser Phe Leu Ser Cys Leu His Arg260 265 270Asn Glu Pro Ile Phe Leu Asp Val Val Arg Ala Leu Ala Val Val Gly275 280 285Phe Ser Leu Pro Ala Thr Asp Leu Ala Trp Leu Thr Gly His Glu Pro290 295 300Glu Pro Ile Gly Gln Val Leu Ala Ala Leu Thr Gly Ala Gly Leu Met305 310 315 320Asp Glu Gly Ala Phe Arg Gln Glu Ala Ala Arg Leu Ser Val Leu Asn325 330 335Asp Thr Pro Ala Leu Thr Arg Arg Thr Leu His Gln Arg Ala Ala Arg340 345 350Leu Leu His Asp Gln Gly Arg Pro Ala Thr Thr Ile Ala Arg His Leu355 360 365Val Arg Ala Gly Arg Ile Pro Asp Ser Trp Ser Pro Glu Leu Leu Leu370 375 380Glu Val Ala Glu Gln Val Ala Val Gly Glu Glu Ala Ser Val Ala Val385 390 395 400Asp Leu Leu Glu Gln Ser Leu Glu Gln Cys Pro His Gln Glu Arg Arg405 410 415Ala Ala Leu Gln Ala Lys Leu Ala Glu Ala Glu Trp Lys Ile Asn Pro420 425 430Ser Thr Ala Thr Arg His His Thr Pro Leu Tyr Gly Ala Val Arg Ala435 440 445Gly Arg Leu Gly Leu Pro Asp Ser Val Thr Leu Leu Met Gln Leu Leu450 455 460Trp Lys Gly Gly Leu Thr Glu Val Glu Gly Leu Leu Ala His Leu Arg465 470 475 480Glu Asp Pro Ala Ala Thr Asp Gln Leu His Ala Ile Glu Ala Ala Leu485 490 495Thr Cys Thr Tyr Pro Trp Leu Ala Glu Arg Arg Pro Ala Pro Ala His500 505 510His Gly Gly Ser Ala Ala Thr Arg Ala Ala Val Trp Pro Arg Ala Gly515 520 525
Thr Val Leu Ala Asp Val Leu Thr Gly Gly Gln Thr His Asp Thr Val530 535 540Arg Arg Ala Glu Glu Val Leu Arg Glu Leu Gln Leu Gly His Asp Pro545 550 555 560Ala Cys Gln Glu Gln Ala Gly Leu Phe Ala Leu Leu Ala Leu Val Tyr565 570 575Gly Gly Arg Ile Asp Leu Ala Ser Ala Trp Cys Glu Gly Ala Leu Gly580 585 590Glu Thr Gly Ala Gly Pro His Val Pro Met Arg Gln Ala Val Leu Ala595 600 605Ala Ala Arg Ser Glu Ile Ala Leu Arg Arg Gly Asp Leu Ala Glu Ala610 615 620Ala Glu Arg Ser Arg Ala Ala Leu Thr His Ala Ser Pro Gly Ala Trp625 630 635 640Gly Val Ala Val Gly Leu Pro Leu Gly Ser Leu Ile Leu Ala Cys Thr645 650 655Arg Met Gly Arg His Glu Glu Ala Gly Phe His Val Ala Gln Thr Val660 665 670Pro Asn Ala Met Phe Lys Ser Ser Tyr Gly Leu His Tyr Leu Tyr Ala675 680 685Arg Gly His Tyr Phe Leu Ala Ala Gly Arg His Gln Ala Ala Leu Ala690 695 700Asp Phe Leu Leu Cys Gly Glu Leu Leu Thr Asp Trp Gly Leu Ser Ser705 710 715 720Gly Cys Asp Pro Val Pro Trp Arg Ile Gly Ala Ala Glu Ala Trp Leu725 730 735Ala Gln Gly Asn His Asp Gln Ala Arg Ile Leu Val Tyr Gln Gln Leu740 745 750Ser Arg Pro His Thr Asp Gly Ala Arg Ala Arg Gly Gln Ser Leu Arg755 760 765Leu Leu Ala Ala Thr Ser Ser Ala Lys Arg Arg Pro Gln Leu Leu Asn770 775 780Glu Ala Val Gly Leu Phe Thr Glu Gln Glu Asp Lys Tyr Glu Leu Ala785 790 795 800Arg Thr Leu Trp Asp Leu Ser Gln Ala Tyr His Ala Leu Gly Glu Lys805 810 815Lys Gln Ala Arg Arg Thr Met Arg Arg Ala Trp His Val Ala Lys Met820 825 830Cys Asp Ala Ala Ser Leu Tyr Glu Glu Trp Leu Pro Ala Asp Asp Gln835 840 845Ser Gln Ala Val Ala Pro Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gly Ile Glu Arg850 855 860Leu Thr His Ser Glu Arg Arg Val Ala Ser Leu Ala Ala Met Gly Tyr
865 870 875 880Thr Asn Arg Glu Ile Ala Gly Lys Leu Tyr Val Thr Ala Ser Thr Val885 890 895Glu Gln His Leu Thr Arg Val Phe Arg Lys Leu Asp Ile Lys His Arg900 905 910Glu Gln Leu Pro Thr Glu Leu Tyr Ala Asp Arg Met Glu Leu Ala915 920 925 92权利要求
1.通过阻断格尔德霉素生物合成负调控基因gdm RII提高其发酵产量的方法，其特征是所说方法包括以下步骤A、gdm RII基因阻断重组载体的构建；B、gdm RII基因阻断变株的筛选与获得；C、gdm RII基因阻断变株的GDM发酵产量的检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是gdm RII基因阻断重组载体的构建，是通过设计PCR引物或利用酶切位点从gdm RII基因取出两个大小相近、分子量不低于500bp的片段，在其中间插入可供选择的标记基因，将这三个基因片段连接到质粒载体如pGH112，构建成用于gdm RII基因阻断的重组载体；
3.如权利要求1所述的方法，其特征是gdm RII基因阻断变株的筛选与获得，是将构建的gdm RII基因阻断重组载体，导入格尔德霉素产生菌，利用插入的标记基因和载体上原有的标记，进行筛选获得在染色体基因发生双交换的gdm RII基因阻断菌株；
4.如权利要求1所述的方法，其特征是gdm RII基因阻断变株的GDM发酵产量检测，是将gdm RII基因阻断菌株进行发酵培养，对发酵产物GDM进行提取和HPLC分析，根据GDM的峰面积检测其发酵产量。
全文摘要
本发明涉及利用分子生物学操作技术、通过阻断生物合成调控基因提高抗生素产量的方法，具体来讲，就是在获得gdm RII基因的基础上，构建gdm RII基因阻断重组载体，筛选获得gfm RII基因阻断变株，再进行gdm RII基因阻断变株发酵产量的检测，实验结果证明，gdm RII基因为一个负调控基因，将其阻断后，可以提高格尔德霉素的发酵产量近60％，为其工业化生产创造了有利条件，并在宏观层面上，为提高抗生素产量展现了良好前景。
文档编号C12N15/09GK1730661SQ20051008985
公开日2006年2月8日 申请日期2005年8月9日 优先权日2005年8月9日
发明者王以光, 赫卫清, 刘玉瑛 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所