一种痢疾多价基因工程菌苗及其制备方法

专利名称：一种痢疾多价基因工程菌苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域中一种痢疾多价基因工程菌苗及其制备方法。
背景技术：
全世界痢疾年发病例超过2.5亿，其中500万例需住院治疗，年死亡约200万，且十余年的报告数据有增无减。主要流行于发展中国家。痢疾是常见和多发传染病，发病率始终位于24种法定传染病的前3位，有逐年下降趋势，目前年报告病例约100万左右，实际病例数超过数倍。发病以婴幼儿和青壮年为主，死亡多见于老人和儿童，主要流行型别是福氏和宋内氏。痢疾虽有药物治疗，但极易转为慢性，长期带菌成为潜在传染源，且抗药性问题十分严重。WHO推荐的口服补液对以侵袭肠粘膜上皮细胞为主要致病特点的痢疾无效，尤其因痢疾腹泻影响和障碍婴幼儿正常发育，影响终生，且越来越多的证据说明痢疾感染与自身免疫病相关。尤其近年，我国城市流动人口剧增，从事食品及其加工人数增多，且这部分人的居住与工作环境恶劣，均给痢疾的传播与流行提供了适宜环境、流行途径和敏感人群。
志贺氏菌属(Shigella)是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。有K和O抗原而无H抗原。K抗原是自患者新分离的某些菌株的菌体表面抗原，不耐热，加热100℃1小时被破坏。K抗原在血清学分型上无意义，但可阻止O抗原与相应抗血清的凝集反应。O抗原分为群特异性抗原和型特异性抗原，前者常在几种近似的菌种间出现；型特异性抗原的特异性高，用于区别菌型。根据志贺氏菌抗原构造的不同，可分为四群48个血清型(包括亚型)(1)A群又称痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae)，通称志贺氏痢疾杆菌。不发酵甘露醇。有12个血清型，其中8型又分为三个亚型。
(2)B群又称福氏志贺氏菌(Sh.flexneri)，通称福氏痢疾杆菌。发酵甘露醇。有15个血清型(含亚型及变种)，抗原构造复杂，有群抗原和型抗原。根据型抗原的不同，分为6型，又根据群抗原的不同将型分为亚型；X、Y变种没有特异性抗原，仅有不同的群抗原。
(3)C群又称鲍氏志贺氏菌(Sh.boydii)，通称鲍氏痢疾杆菌。发酵甘露醇，有18个血清型，各型间无交叉反应。
(4)D群又称宋内氏志贺氏菌(Sh.sonnei)，通称宋内氏痢疾杆菌。发酵甘露醇，并迟缓发酵乳糖，一般需要3～4天。只有一个血清型。有两个变异相，即I相和II相；I相为S型，II相为R型。
侵袭蛋白抗原(Ipas)，是各群痢疾杆菌的共同侵袭蛋白抗原(Ipas，包括IpaA、IpaB、IpaC、IpaD)，IpaA、IpaB、IpaC、IpaD是分别具有如序列表中(1、2、3和4)所示氨基酸残基序列的蛋白质，它们的编码基因分别如序列表中序列(5、6、7和8)所示。
LPS-O多糖抗原，即存在于痢疾杆菌胞壁肽聚糖的外侧为外膜的结构。它同大多数革兰氏阴性菌一样，主要由类脂A，核心多糖及O-特异性侧链(O抗原)组成，并与大肠杆菌有很大的相似性。化学分析表明，福氏及宋内氏菌LPS的类脂A与大肠杆菌基因相同，LPS的O特异性侧链是决定血清型的主要部位，是痢疾杆菌重要的致病性因子和保护性抗原。
美、法、日、澳、瑞典、英、苏、印度等国家长期以来投入大量人力、财力开展痢疾菌苗及其相应基础研究，痢疾杆菌毒力与致病的分子机制的研究进展促进了新一代痢疾菌苗的研制与发展。目前研制痢疾杆菌苗的方法与途径主要有1、构建杂交株多以沙门氏菌如Ty21a，或E.coli菌为受体株，接受宋内氏或福氏2a痢疾菌质粒或染色体的功能片段构建的杂交株。如宋内-Ty21a杂交株，人体口服1010cfu安全，对宋内氏野生株的攻击有40％的保护效果，但其冻干产品批次间有波动，其原因是宋内氏LPS-O侧链不能与Ty21a的LPS中心糖链稳定结合的缘故，正在进行改进，但未见成功的报道。
2、构建毒力基因减毒突变株主要针对痢疾菌繁殖和胞内外播散的功能基因如VirG(icsA)及其调控基因或染色体上的arobactin的基因，进行插入突变，使该菌株能入侵宿主细胞，但无法进行有效繁殖，已在小动物和猴体上进行实验未见人体观察效果。
3、构建痢疾菌毒株的营养缺陷型使Y型痢疾菌由于aroD基因插入失活或缺失，得到福氏痢疾减毒株，它能入侵宿主细胞，但在胞内不能有效繁殖，有2株已进行志愿者实验，但没有深入在人体大范围的试验。
上述三类菌苗除2株aroD营养缺陷菌株有人体免疫学观察外，其它未见人体II、III期临床观察结果的报道。从F2a2457毒株和福氏Y型进行aroD缺失而构建成功的2株减毒株已分别进行几十例志愿者安全及攻击实验，认为口服10×108cfu比较安全，在44％的受试者查到阳性血清抗体，副反应与服苗剂量有关，据说Y型减毒株ΔaroD124在越南现场有效。
4、近年美国将痢疾菌LPS多糖与蛋白如CT-B进行交联称为结合苗，进行小动物实验观察有效，在越南现场人用观察也有效，但没有形成制品。
于1998年获得国家1类新药证书和生产批文号的痢疾双价基因工程菌苗(菌株FSM2117)，可同时表达福氏和宋内氏双价LPS-O多糖抗原，经小鼠、豚鼠、家兔和猴等不同动物模型证明痢疾双价基因工程菌苗口服免疫动物安全，有双价免疫原性、双价保护活性和稳定性。并进一步用于人群大范围的现场使用，证明人口服痢疾双价基因工程菌苗安全，有双价免疫原性和免疫保护效果。并于1998年12月获得国家1类新生物制品证书和国家试生产文号。但该痢疾双价基因工程菌苗冻干粉剂口服前必须先口服碳酸氢钠中和胃酸，并且口服量大及保护效果还不够十分理想的问题，而影响免疫保护效果。
发明创造内容本发明的目的是提供一种痢疾多价基因工程菌苗。
本发明所提供的痢疾多价基因工程菌苗，它的活性成分是既表达侵袭蛋白抗原IpaA，IpaB，IpaC和IpaD，又表达福氏和宋内氏双价LPS-O多糖抗原的痢疾多价基因工程菌苗株。
所述痢疾多价基因工程菌苗的生产培养基为pH为6.5-7.6的厚氏培养基或LB培养基。所述生产培养基的pH优选为7.2-7.5。
所述厚氏培养基按照如下方法制备新鲜牛肉7500g加入11250ml蒸馏水煮沸40min，冷却至45℃加入匀浆的新鲜猪胰脏1500mg，调pH8.0，及加入三氯甲烷200ml，消化7d，用前4倍稀释，并加入氯化钠0.5％，调pH6.5-7.6备用。
LB培养基由以下成分组成蛋白胨10g、酵母浸出液5g、氯化钠10g，加水至1000ml，其中所pH优选为7.2-7.5。
所述痢疾多价基因工程菌苗的剂型为口服胶囊剂型或滴鼻剂型两种。
所述剂型的痢疾多价基因工程菌苗可采用冷冻干法进行制备。
在制备所述剂型的痢疾多价基因工程菌苗过程中所采用的冻干保护剂为含有0.5％明胶，5％蔗糖、0.1％维生素C、0.1％谷维素、0.1％脱脂奶粉等的pH7.0-7.6磷酸缓冲液；所述百分含量为质量百分含量。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述痢疾多价基因工程菌苗株的方法。
本发明所提供的制备上述痢疾多价基因工程菌苗株的方法，包括以下步骤1)将含有侵袭蛋白IpaA，IpaB，IpaC和IpaD基因的I相质粒转移到福氏痢疾杆菌2a型II中，得到含有所述I相质粒的重组福氏痢疾杆菌2a型II；2)将含有所述I相质粒的重组福氏痢疾杆菌2a型II中的aroD基因缺失，得到既表达侵袭蛋白抗原IpaA，IpaB，IpaC和IpaD，又表达福氏和宋内氏双价LPS-O多糖抗原的痢疾多价基因工程菌苗株。
所述含有侵袭蛋白IpaA，IpaB，IpaC和IpaD基因的I相质粒来自于宋内氏痢疾菌毒株48025-11或S63等宋内氏痢疾菌株。该毒株提供120-140MD的I相大质粒，侵袭蛋白及侵袭表型均阳性(具有四种侵袭蛋白IpaA，IpaB，IpaC和IpaD，Hela细胞侵入阳性，接触性溶血阳性，刚果红试验阳性，豚鼠角结合膜试验阳性)。
所述含有侵袭蛋白IpaA，IpaB，IpaC和IpaD基因的I相质粒通过诱动质粒R386转移到福氏痢疾杆菌2a型II中。
所述诱动质粒R386来自于E.coli。E.coli该菌株提供诱动质粒R386和选择性标记Kan(卡那霉素)抗性。
所述福氏痢疾杆菌2a型II可为福氏痢疾杆菌2a型II T32菌株。
本发明的痢疾多价基因工程菌苗比痢疾双价基因工程菌苗增加了各群痢疾杆菌共有的侵袭蛋白抗原(Ipas，包括IpaA、IpaB、IpaC、IpaD)。经不同实验动物(小鼠和猴)口服或滴鼻途径免疫，结果证明按第0、3、6周三次口服或滴鼻免疫程序，小鼠口服0.1亿、恒河猴口服0.5亿、人口服1.0亿或小鼠滴鼻0.001亿、恒河猴滴鼻0.005亿、人滴鼻0.01亿的痢疾多价基因工程菌苗，可产生很好的多价免疫原性，可保护免疫小鼠、恒河猴、人有效抵抗S.F2a及S.sonnei毒株的攻击，并且比痢疾双价基因工程菌苗的口服途径免疫保护效果提高近30％、滴鼻途径免疫保护效果提高30％以上，都能有效诱导粘膜双价特异IgA、IgG粪及唾液的抗体反应，可提供痢疾杆菌多价抗原的免疫保护，并进行中试生产及在5省、市、地区3万余人的现场考核，可很好有效的预防细菌性痢疾。


图1为本发明的痢疾多价基因工程菌苗株的构建过程示意图具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1.痢疾多价基因工程菌苗株构建、筛选与鉴定1、痢疾多价基因工程菌苗株的构建与筛选(1)痢疾多价基因工程菌苗株的构建痢疾多价基因工程菌苗株的构建过程如图1所示，具体方法如下选择宋内氏痢疾菌毒株48025-11(购于中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所毒种库，提供120-140MD的I相大质粒pSS120)，表达与侵袭相关的IpaA，B，C，D四条侵袭蛋白带，具有HeLa细胞侵入，刚果红试验，接触性溶血等侵袭表型及豚鼠角结合膜毒力试验阳性。大肠杆菌E.coli(R386Tn5，Kanr25ug/ml，购于首都儿童医院)，提供诱动质粒R386和筛选的选择性标记卡那霉素抗性。首先将诱动质粒R386通过接合转移的方法转到痢疾菌毒株48025-11中，具体方法如下取甘油肉汤保存的提供诱动质粒R386的大肠杆菌E.coli和痢疾菌毒株48025-11各50μ1分别接种于含和不含卡那霉素的5ml LB肉汤中，37℃振荡培养15小时，7000rpm离心10分钟，去上清，菌苔分别用0.2ml LB肉汤悬浮，两菌混合后涂于LB平板，内含Kan(卡那霉素)50ug/ml，37℃温箱培养30小时，长出菌落与痢疾宋内氏标准血清呈阳性反应，连续在含卡那霉素的LB平板上纯化3次，所得菌落既为含有诱动质粒R386的痢疾菌毒株48025-11。
通过诱动质粒R386的诱动，将I相大质粒转移到福氏2a痢疾菌苗T32(表达型II，群3，4抗原Str(链霉素)r50ug/ml，Ipa-，购于兰州生物制品研究所)中，具体方法如下将甘油肉汤保存的48025-11(含I相大质粒和诱动质粒R386Kanr)和福氏2a痢疾菌苗T32(Strr)各取50μl分别接种于含Kan(卡那霉素)50ug/ml和含Str(链霉素)50ug/ml的5ml LB肉汤中，37℃振荡培养15小时，7000rpm离心10分钟去上清，菌苔分别用0.2ml LB肉汤悬浮，两菌混合后涂于LB平板，内含Kan(卡那霉素)50ug/ml，链霉素50ug/ml，37℃温箱培养30小时，长出菌落与痢疾宋内氏及福氏2a型II及群3，4标准血清呈阳性反应，连续在含卡那霉素和链霉素的LB平板上纯化3次，所得菌落既为目的菌落，该目的菌落为转入I相大质粒的福氏2a痢疾菌苗T32，命名为FS-15毒株。FS-15毒株表达宋内氏I相抗原及福氏2a型II，群3，4抗原，并表达与侵袭相关的IpaA，B，C，D四条侵袭蛋白带，具有HeLa细胞侵入、刚果红试验阳性，接触性溶血等侵袭表型，豚鼠角结合膜毒力试验阳性。
用大肠杆菌NK5131(购于Walter Reed Army Institute of Research，America，含P1噬菌体，Kanr50ug/ml，Tetr12.5ug/ml，Tn10插入灭活的aroD基因)制备P1裂解液，效价需大于1010方可使用，用P1裂解液和FS-15毒株菌液混合，通过转导的方式将aroD基因转入受体菌中，具体方法如下将甘油肉汤保存的FS-1550μl接种于5ml含Kan50ug/ml的LB肉汤中，37℃振荡培养8-9小时，将其全部转种于200ml含Kan 50ug/ml的LB肉汤中，取60ml菌液离心，4000rpm离心10分钟，悬于40mlCa，Mg缓冲液(5mM Cacl2，10mM MgSO4)中，37℃水浴30分钟。每2ml菌液加2ml P1裂解液，37℃吸附30分钟，4000rpm离心10分钟，每管悬于0.5ml LB肉汤中，铺于3块含50ug/ml卡那霉素和12.5ug/ml Tet(四环素)的LB平板，42℃培养55小时，有转导子出现。连续在含有kan 50ug/ml及Tet 12.5ug/ml的平板上纯化3次。将转导子点种在加及不加芳香族氨基酸的M9平板上，挑选芳香族氨基酸缺陷的菌落保存。再经过Bochner培养基(蛋白胨10克，酵母5克，金霉素.HCl 50毫克，NaCl 10克，NaH2PO411.3克，琼脂15克，水1000ml，PH6.0-6.5)，筛选四环素敏感突变体。再将四环素敏感株点种在NC膜上，裂解后与a-32P标记的1.0Kb的aroD探针作菌落原位杂交(常规碱变性法提取pKD201质粒(购于Cold Spring HarborLaboratory，America)，用ClaI及EcoRV双酶切，回收1.0kb片段，随机引物标记法标记此片段作为aroD探针，按常规菌落杂交法进行)，呈阴性者为aroD基因缺失株。将aroD基因缺失株在含有nad(尼克酰胺)，VitB1(维生素B1)，asp(天门冬氨酸)，phe(苯丙氨酸)，try(色氨酸)，tyr(酪氨酸)，PABA(对氨基苯甲酸)，DHB(2.3-二羟基苯甲酸)(均为40ug/ml)的M9培养基上作芳香族氨基酸的营养缺陷鉴定，并以NK5131作为阳性对照，筛选出4株不能在上述M9培养基上生长的菌株(FS)，该4株菌既表达双价LPS-O多糖抗原，又稳定表达各群痢疾杆菌共同的Ipas蛋白抗原，aroD基因缺失，并具有入侵能力。该4株菌均为痢疾多价基因工程菌苗株(inv+Ipas+ΔaroD)FS。
(2)痢疾多价基因工程菌苗株的筛选根据GeneBank已公布的IpaA，IpaB，IpaC，IpaD基因序列设计PCR引物，以沙门氏菌或大肠杆菌为模板，通过基因扩增分别获得IpaA、IpaB、IpaC、IpaD基因，构建于pQE30(购于美国invitrogen公司)原核表达载体上，导入DH5α受体菌获得IpaA、IpaB、IpaC、IpaD重组蛋白的表达，经镍柱纯化制备了纯化的IpaA、IpaB、IpaC、IpaD重组蛋白抗原。以纯化的IpaA、IpaB、IpaC、IpaD重组蛋白抗原分别加入等量不完全氟氏佐剂乳化后皮下多点免疫BALB/c鼠，三次免疫后测抗体效价，取其免疫BALB/c小鼠脾脏，制备脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，筛选IpaA、IpaB、IpaC、IpaD抗体阳性的杂交瘤细胞株。采用有限稀释获得产生抗体的杂交瘤细胞株，并进一步用ELISA鉴定IpaA、IpaB、IpaC、IpaD杂交瘤细胞株分泌抗体是针对IpaA，IpaB，IpaC，IpaD保护性表位的单克隆细胞株(分别为3G11、2E8、5F2、5D3)，经抗体亚型分析鉴定分别是IgG2a、IgG1b、IgG1a、IgG2b。
采用Western blotting杂交检测痢疾多价基因工程菌苗株表达IpaA，IpaB，IpaC，IpaD侵袭蛋白抗原的情况，具体方法是痢疾多价基因工程菌苗株与SDS-PAGE上样缓冲液加热煮沸上样，进行10％SDS-PAGE，分别以上述针对IpaA，IpaB，IpaC，IpaD保护性表位的抗体为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG(购自英国Amersham公司)为二抗进行Western blotting，杂交结果表明痢疾多价基因工程菌苗株样品中得到了70kDa的IpaA杂交条带，62kDa的IpaB杂交条带，42kDa的IpaC杂交条带，36kDa的IpaD；说明本发明的4株痢疾多价基因工程菌苗株可表达IpaA，IpaB，IpaC，IpaD。
2、4株痢疾多价基因工程菌苗株的鉴定①入侵表型鉴定宋内氏、福氏2a型II、群3、4标准菌株(购于国家药品生物制品检定所)。
将痢疾多价基因工程菌苗株活化培养后稀释进行普通平板划线，37℃培养20-22h，挑单个菌落与福氏型II，群3，4及宋内氏I相因子、和侵袭蛋白IpaA、IpaB、IpaC、IpaD抗体做玻片凝集试验，观察入侵表型。具体方法是分别将宋内氏、福氏2a型II、群3、4标准菌株(购于中国药品生物制品检定所)滴于玻片，刮取适量的菌苔，分别加入相应的侵袭蛋白IpaA、IpaB、IpaC、IpaD抗体凝集反应，结果显示，多价宋氏、福氏及侵袭蛋白抗原均与IpaA、IpaB、IpaC、IpaD抗体发生强凝集反应，表现宋内氏+++、福氏2a型II+++、群3、4+++和IpaA+++、IpaB+++、IpaC+++、IpaD+++呈多价强凝集反应(“+++”表示强凝集反应)。
A、侵袭蛋白表达的鉴定选用贺氏肉汤培养基分别培养18h痢疾多价基因工程菌苗株和痢疾双价基因工程菌苗FSM2117(做对照)，离心后弃上清用生理盐水洗一次，恢复原体积加等量样品处理液(1％溴酚蓝)煮沸，加样进行10％SDS-PAGE电泳，转移膜上用牛血清蛋白-PBS封闭，然后加入相应的鼠抗IpaA，IpaB，IpaC，IpaD单克隆抗体为一抗，室温过夜PBS洗几次，再加入以HRP标记的羊抗鼠IgG(购自英国Amersham公司)37℃温浴，PBS洗几次后DAB显色。WB(免疫印迹试验)、ELISA、Immunoblot结果显示，痢疾多价基因工程菌苗株与宋内氏、福氏2a型II、群3、4和侵袭蛋白IpaA、IpaB、IpaC、IpaD的抗体呈多价抗原阳性反应，而痢疾双价基因工程菌苗FSM2117与宋内氏、福氏2a型II、群3、4的LPS-O呈阳性反应，但与侵袭蛋白IpaA、IpaB、IpaC、IpaD的单克隆抗体呈阴性反应。
B、刚果红吸附实验的鉴定将痢疾多价基因工程菌苗株、痢疾双价基因工程菌苗FSM2117、T32减毒株(阴性对照)、F2a-12强毒株(阳性对照)分别接种于LB肉汤培养基，37℃振摇过夜，分别接种在含0.01％刚果红的LB平皿上划线，再37℃培养过夜。结果显示，痢疾双价基因工程菌苗FSM2117、T32减毒株不吸收刚果红菌苔为半透明呈乳白色，F2a-12强毒株吸收刚果红菌苔呈强红色，而痢疾多价基因工程菌苗株吸收刚果红菌苔为红色，但程度低于F2a-12强毒株，其程度并介于阴性和阳性之间。
C、接触性溶血实验的鉴定将痢疾多价基因工程菌苗株、痢疾双价基因工程菌苗FSM2117、T32减毒株(阴性对照)、F2a-12强毒株(阳性对照)分别接种于贺氏肉汤培养基，37℃振摇过夜，离心洗两次，同时将保存液中豚鼠血细胞离心洗4次，并将豚鼠血细胞及待测样品混匀37℃2h，然后离心取上清，紫外检测570nm OD值。结果显示，痢疾多价基因工程菌苗株OD值明显小于F2a-12强毒株，而明显高于非侵袭性痢疾双价基因工程菌苗FSM2117。
D、Hela细胞入侵实验的鉴定将培养的4×104个细胞/ml的Hela细胞放入装有小盖玻片的小瓶培养24h，将新培养的待检菌株稀释为5×108CFU/ml，等量加入Hela细胞瓶感染2h，取出该玻片PBS洗4次，用甲醇固定，Giemsa染色，镜下计1000个Hela细胞，计算菌株对Hela细胞的入侵数。结果显示，F2a-12强毒株侵入Hela细胞数是80％，痢疾多价基因工程菌苗菌株侵入Hela细胞数是36％，而痢疾双价基因工程菌苗FSM2117侵入Hela细胞数是2％。
②安全性鉴定将50亿CFU痢疾多价基因工程菌苗株放入豚鼠的一只眼睛的结膜囊中，而另一只眼睛不作任何处理作为空白对照，按常规方法进行痢疾多价基因工程菌苗豚鼠角结膜试验，结果表明痢疾多价基因工程菌苗株对豚鼠无致病性；小鼠毒力实验达到菌苗安全要求(小鼠腹腔注入5×109cfu，无死亡)。猴体口服200亿CFU痢疾多价基因工程菌苗株、小鼠腹腔注入10亿CFU痢疾多价基因工程菌苗株均无不良反应。痢疾多价基因工程菌苗株小鼠LD50检测，结果证明痢疾多价基因工程菌苗株的小鼠LD50值与痢疾双价基因工程菌苗FSM2117相当。至此完成痢疾多价菌苗的毒性与毒力实验全部鉴定，证明该痢疾多价基因工程菌苗株使用安全。
③稳定性鉴定将痢疾多价基因工程菌苗株的种子库和工作库菌株分别传60代，通过不同生物表型刚果红吸附、接触性溶血、Hela细胞入侵识别侵袭蛋白抗原单抗(3G11、2E8、5F2、5D3)，用全菌WB(免疫印迹试验)、ELISA、Immunoblot等方法进行双价LPS-O保护性抗原，Ipas侵袭蛋白抗原及生物表型稳定性的观测，实验结果显示，痢疾多价基因工程菌苗株传60代及保存5年能稳定表达保护性LPS-O抗原和侵袭蛋白IpaA、IpaB、IpaC、IpaD，且入侵等生物表型稳定。
对历时5年的不同批次的口服胶囊或滴鼻冻干制剂及对近200例志愿者排除菌苗，逐个进行生化、遗传学及抗原表达的系统检测，证明排除菌与口服胶囊菌苗及滴鼻菌苗在质粒大小、生化特性、抗原表达及豚鼠角膜试验等方面无差异，与实验室大量动物试验结果一致，证明痢疾多价基因工程菌苗株稳定性良好。
保存1年的成品制剂，除痢疾多价基因工程菌苗株活菌数有5-8％的下降外，在遗传学、生化学、抗原表达等方面均无改变，由此证明痢疾多价基因工程菌苗株稳定性良好。
④免疫原性鉴定A)将痢疾多价基因工程菌苗株口服免疫小鼠3次，每次0.1亿CFU，同时用痢疾双价基因工程菌苗FSM2117口服免疫小鼠3次，每次10亿CFU，每次间隔14d，末次免疫后7d采集血、肺灌洗液及肠、生殖道冲洗液检测IgA、IgG特异抗体的产生情况。ELISA结果显示，痢疾多价基因工程菌苗株抗福氏、抗宋内氏和IpaA，IpaB，IpaC，IpaD血清IgA特异抗体效价分别是(1280、640和640、640、640、320)，IgG分别是(2560、1280和640、640、640、640)；肺灌洗液sIgA特异抗体效价分别是(2560、2560和1280、1280、1280、12800)，IgG分别是(2560、1280和1280、1280、1280、1280)；肠洗液sIgA特异抗体效价分别是(1280、1280和640、640、640、640)，IgG分别是(1280、640和320、640、320、640)；生殖道冲洗液sIgA特异抗体效价分别是(1280、640和640、640、640、640)，IgG分别是(1280、640和320、320、320、320)。同时ELISA结果显示，痢疾双价基因工程菌苗株FSM2117抗福氏、抗宋内氏血清IgA特异抗体效价分别是(640、640)，IgG分别是(1280、1280)；肺灌洗液sIgA特异抗体效价分别是(1280、1280)，IgG分别是(1280、1280)；肠洗液sIgA特异抗体效价分别是(1280、640)，IgG分别是(640、320)；生殖道冲洗液sIgA特异抗体效价分别是(640、320)，IgG分别是(640、320)。结果表明痢疾多价基因工程菌苗株口服免疫小鼠特异IgG和IgA抗体高于痢疾双价基因工程菌苗。尤以血及肺灌洗液的多价特异抗体反应更为明显，且能诱导生殖道及肠内的抗体反应。
B)将痢疾多价基因工程菌苗株滴鼻免疫小鼠3次，每次0.001亿CFU，同时用痢疾双价基因工程菌苗FSM2117滴鼻免疫小鼠3次，每次0.1亿CFU，每次间隔14d，末次免疫后7d采集血、肺灌洗液及肠、生殖道冲洗液IgA、IgG特异抗体的反应。ELISA结果显示，痢疾多价基因工程菌苗株抗福氏、抗宋内氏和IpaA，IpaB，IpaC，IpaD血清IgA特异抗体效价分别是(2560、1280和1280、640、640、640)，IgG分别是(5120、2560和1280、1280、1280、12800)；肺灌洗液sIgA特异抗体效价分别是(2560、1280和1280、1280、1280、12800)，IgG分别是(5120、2560和1280、1280、640、1280)；肠洗液sIgA特异抗体效价分别是(2560、1280和1280、640、640、640)，IgG分别是(1280、640和640、640、640、640)；生殖道冲洗液sIgA特异抗体效价分别是(2560、1280和1280、6400、640、640)，IgG分别是(1280、640和640、640、320、320)。同时ELISA结果显示，痢疾双价基因工程菌苗FSM2117抗福氏、抗宋内氏血清IgA特异抗体效价分别是(1280、640)，IgG分别是(1280、1280)；肺灌洗液sIgA特异抗体效价分别是(1280、1280)，IgG分别是(2560、1280)；肠洗液sIgA特异抗体效价分别是(1280、640)，IgG分别是(640、640)；生殖道冲洗液sIgA特异抗体效价分别是(640、320)，IgG分别是(640、320)。结果表明痢疾多价基因工程菌苗株滴鼻免疫小鼠特异IgG和IgA抗体高于痢疾双价基因工程菌苗FSM2117。尤以血及肺灌洗液的多价特异抗体反应更为明显，且能诱导生殖道及肠内的抗体反应。
C)将痢疾多价基因工程菌苗株口服免疫恒河猴3次，每次0.2亿CFU，同时用痢疾双价基因工程菌苗FSM2117口服免疫恒河猴3次，每次5.0亿CFU，每次间隔14d，末次免疫后7d采集血、肺灌洗液及肠、生殖道冲洗液IgA、IgG特异抗体的反应。ELISA结果显示，痢疾多价基因工程菌苗株抗福氏、抗宋内氏和IpaA，IpaB，IpaC，IpaD血清IgA特异抗体效价分别是(2560、640和640、640、640、640)，IgG分别是(2560、1280和1280、1280、640、640)；肺灌洗液sIgA特异抗体效价分别是(6400、2560和2560、1280、2560、12800)，IgG分别是(5120、1280和1280、1280、2560、1280)；肠洗液sIgA特异抗体效价分别是(2560、1280和1280、640、640、640)，IgG分别是(2560、1280和640、640、640、640)；生殖道冲洗液sIgA特异抗体效价分别是(2560、1280和640、1280、640、640)，IgG分别是(1280、640和640、640、640、640)。同时ELISA结果显示，痢疾双价基因工程菌苗FSM2117抗福氏、抗宋内氏血清IgA特异抗体效价分别是(1280、640)，IgG分别是(1280、640)；肺灌洗液sIgA特异抗体效价分别是(2560、1280)，IgG分别是(1280、1280)；肠洗液sIgA特异抗体效价分别是(640、640)，IgG分别是(640、640)；生殖道冲洗液sIgA特异抗体效价分别是(320、160)，IgG分别是(640、160)。结果表明痢疾多价基因工程菌苗株口服免疫恒河猴特异IgG和IgA抗体高于痢疾双价基因工程菌苗FSM2117。尤以血及肺灌洗液的多价特异抗体反应更为明显，且能诱导生殖道及肠内的抗体反应。
D)将痢疾多价基因工程菌苗株滴鼻免疫恒河猴3次，每次0.005亿CFU，同时用痢疾双价基因工程菌苗FSM2117滴鼻免疫恒河猴3次，每次0.5亿CFU，每次间隔14d，末次免疫后7d采集血、肺灌洗液及肠、生殖道冲洗液IgA、IgG特异抗体的反应。ELISA结果显示，痢疾多价基因工程菌苗株抗福氏、抗宋内氏和IpaA，IpaB，IpaC，IpaD血清IgA特异抗体效价分别是(2560、1280和1280、1280、1280、640)，IgG分别是(6400、2560和1280、1280、640、1280)；肺灌洗液sIgA特异抗体效价分别是(6400、5120和2560、2560、2560、25600)，IgG分别是(5120、5120和2560、2560、2560、1280)；肠洗液sIgA特异抗体效价分别是(2560、1280和1280、1280、1280、1280)，IgG分别是(2560、1280和1280、1280、640、1280)；生殖道冲洗液sIgA特异抗体效价分别是(2560、1280和1280、1280、1280、640)，IgG分别是(1280、1280和1280、640、12800、640)。同时ELISA结果显示，痢疾双价基因工程菌苗FSM2117抗福氏、抗宋内氏血清IgA特异抗体效价分别是(1280、1280)，IgG分别是(1280、1280)；肺灌洗液sIgA特异抗体效价分别是(5120、2560)，IgG分别是(1280、1280)；肠洗液sIgA特异抗体效价分别是(640、320)，IgG分别是(640、320)；生殖道冲洗液sIgA特异抗体效价分别是(640、320)，IgG分别是(640、320)。结果表明痢疾多价基因工程菌苗株滴鼻免疫恒河猴特异IgG和IgA抗体高于痢疾双价基因工程菌苗FSM2117。尤以血及肺灌洗液的多价特异抗体反应更为明显，且能诱导生殖道及肠内的抗体反应。
以上在小鼠、恒河猴体内的结果同时可见，滴鼻是口服免疫剂量的近1％用量，在小鼠、恒河猴均产生了较好的免疫原性，且滴鼻免疫好于口服免疫途径的效果。
⑤免疫保护性鉴定在已有痢疾多价基因工程疫苗、痢疾双价基因工程疫苗口服、滴鼻两条途径免疫小鼠、恒河猴动物模型上，分别用100LD50福氏杆菌、宋内氏强毒株(购于中国药品生物制品检定所)滴鼻、口服攻毒观察痢疾多价基因工程疫苗的免疫保护效果。结果显示，痢疾多价基因工程疫苗口服免疫小鼠对福氏毒株的免疫保护是90％、对宋内氏毒株的免疫保护效果是84％，滴鼻免疫小鼠对福氏毒株的免疫保护是95％、对宋内氏毒株的免疫保护效果是88％；痢疾多价基因工程疫苗口服免疫恒河猴对福氏毒株的免疫保护是92％、对宋内氏毒株的免疫保护效果是88％，滴鼻免疫小鼠对福氏毒株的免疫保护是98％、对宋内氏毒株的免疫保护效果是92％。而痢疾双价基因工程疫苗FSM2117口服免疫小鼠对福氏毒株的免疫保护是50％、对宋内氏毒株的免疫保护效果是41％，滴鼻免疫小鼠对福氏毒株的免疫保护是56％、对宋内氏毒株的免疫保护效果是48％；痢疾双价基因工程疫苗FSM2117口服免疫恒河猴对福氏毒株的免疫保护是46％、对宋内氏毒株的免疫保护效果是40％，滴鼻免疫小鼠对福氏毒株的免疫保护是55％、对宋内氏毒株的免疫保护效果是48％。
以上在小鼠、恒河猴体内的免疫保护效果结果可见，滴鼻免疫剂量比口服降低消耗100倍以上，且痢疾多价基因工程菌苗株比痢疾双价基因工程菌苗FSM2117免疫保护效果提高了近30％以上。说明痢疾多价基因工程菌苗株免疫原性和免疫保护性好于痢疾双价基因工程菌苗FSM2117。
⑥人体安全性、免疫原性和保护性鉴定在完成痢疾多价基因工程菌苗株实验室研究，证明痢疾多价基因工程菌苗株实验动物安全、有效的基础上，连续5年在五个不同省、市、地区，对5-59岁共计2万余人进行3次全程口服痢疾多价基因工程菌苗株。对痢疾多价基因工程菌苗株的安全性、免疫原性和保护效果进行了严格的考核和评价结果表明A)痢疾多价基因工程菌苗株人服用安全痢疾多价基因工程菌苗株对10634例志愿者口服免疫剂量100亿CFU、对10000例志愿者滴鼻免疫剂量50亿CFU，其副反应率分别是0.136％、0.108％；痢疾双价基因工程菌苗FSM2117对5000例志愿者口服免疫剂量100亿CFU、对3800例志愿者滴鼻免疫剂量50亿CFU，其副反应率分别是0.114％、0.110％；用0.5％明胶，5％蔗糖、0.2％维生素C、0.1％谷维素、0.1％脱脂奶粉制剂敷料制备的口服、滴鼻剂型做为安慰剂，对5000例志愿者口服免疫安慰剂100g、对5000例志愿者滴鼻免疫安慰剂10g，安慰剂组副反应率分别是0.086％、0.119％。从以上痢疾多价基因工程菌苗株、痢疾双价基因工程菌苗FSM2117和安慰剂组间副反应没有差异。证明人使用口服、滴鼻痢疾多价基因工程菌苗株安全。
B)痢疾多价基因工程菌苗株口服免疫有良好的免疫原性和免疫保护性按随机、均衡、双盲原则，先后对5353例志愿者进行口服免疫1.0亿CFU，免疫三次，免疫间隔时间分别为0、2、4周，并用痢疾双价基因工程菌苗FSM2117先后对1100例志愿者进行口服免疫40亿CFU，免疫三次，免疫间隔时间分别为0、2、4周。两者免疫完成后的180d采集血清、粪便与唾液，进行抗福氏、抗宋内氏及Ipas特异IgA、IgG的ELISA检测。ELISA结果显示，痢疾多价基因工程菌苗株抗福氏、抗宋内氏和IpaA，IpaB，IpaC，IpaD血清IgA特异抗体效价分别是1280、1280和640、640、640、640，IgG分别是1280、1280和640、640、640、320；粪便sIgA特异抗体效价分别是1280、1280和640、640、320、320，IgG分别是1280、640和640、320、320、160；唾液sIgA特异抗体效价分别是640、320和160、160、160、160，IgG分别是640、640和320、320、160、320。同时ELISA结果显示，痢疾双价基因工程菌苗FSM2117抗福氏、抗宋内氏血清IgA特异抗体效价分别是640、320，IgG分别是640、640；粪便sIgA特异抗体效价分别是320、160，IgG分别是640、320；唾液sIgA特异抗体效价分别是320、160，IgG分别是160、80。结果表明痢疾多价基因工程菌苗株人口服免疫特异IgG和IgA抗体高于痢疾双价基因工程菌苗FSM2117。粪便双价特异IgA比服苗前效价4倍增高率为68％-81％，唾液双价抗体效价4倍增高率为75-91％，且有侵袭蛋白抗体。充分证明痢疾多价基因工程菌苗株有良好的多价免疫原性。能有效诱导产生特异的多价粘膜抗体反应。进一步收集半年腹泻病例，按实验室细菌学检测、确诊、统计，结果表明痢疾多价基因工程菌苗株口服免疫对儿童提供91.8％，成人86.5％的保护率。其中对福氏2a保护率为89.8％，对宋内氏84.6％，对异型痢疾的保护率为76.8％。
C)痢疾多价基因工程菌苗株滴鼻免疫有良好的免疫原性和保护性按随机、均衡、双盲原则，先后对3000例志愿者进行滴鼻免疫0.01亿CFU，免疫三次，免疫间隔时间分别为0、2、4周，并用痢疾双价基因工程菌苗FSM2117先后对1400例志愿者进行滴鼻免疫1.0亿CFU，免疫三次，免疫间隔时间分别为0、2、4周。两者免疫完成后180d采集血清、粪便与唾液抗福氏、抗宋内氏及Ipas特异IgA、IgG的检测。ELISA结果显示，痢疾多价基因工程菌苗株抗福氏、抗宋内氏和IpaA，IpaB，IpaC，IpaD血清IgA特异抗体效价分别是(2560、1280和1280、1280、640、640)，IgG分别是(2560、2560和640、640、640、320)；粪便sIgA特异抗体效价分别是(1280、1280和640、1280、640、640)，IgG分别是(1280、1280和640、640、640、640)；唾液sIgA特异抗体效价分别是(640、640和320、320、320、160)，IgG分别是(640、320和320、320、640、640)。同时ELISA结果显示，痢疾双价基因工程菌苗FSM2117抗福氏、抗宋内氏血清IgA特异抗体效价分别是(640、320)，IgG分别是(1280、640)；粪便sIgA特异抗体效价分别是(640、320)，IgG分别是(640、320)；唾液sIgA特异抗体效价分别是(640、640)，IgG分别是(320、320)。结果表明痢疾多价基因工程菌苗株人滴鼻免疫特异IgG和IgA抗体高于痢疾双价基因工程菌苗FSM2117。粪便双价特异IgA比滴鼻苗前效价4倍增高率为78％-88％，唾液双价抗体效价4倍增高率为70-92％，且有侵袭蛋白抗体。充分证明痢疾多价基因工程菌苗株有良好的多价免疫原性。能有效诱导产生特异的多价粘膜抗体反应。进一步收集半年腹泻病例，按实验室细菌学检测、确诊、统计，结果表明痢疾多价基因工程菌苗株滴鼻免疫对儿童提供98.0％，成人89.6％的保护率。其中对福氏2a保护率为93.4％，对宋内氏88.9％，对异型痢疾的保护率为89.1％。
实施例2、痢疾多价基因工程菌苗制剂的生产痢疾多价基因工程菌苗口服胶囊制剂的生产工艺如下将一支种子管中的痢疾多价基因工程冻干菌株苗(40亿CFU/支)，接入厚氏液体培养液(新鲜牛肉7500g加入11250ml蒸馏水煮沸40min，冷却至45℃加入匀浆的新鲜猪胰脏1500mg，调pH8.0，加入三氯甲烷200ml，消化7d，用前4倍稀释，并加入氯化钠0.5％，调pH7.2-7.4备用)或LB培养基(蛋白胨10g，酵母浸出液5g，氯化钠10g，加水至1000ml，pH为7.2-7.5)的3.0L培养瓶中，37℃，150-200rpm振荡培养13-15h，直接注入装有8500ml厚氏液体培养液或LB培养基的10L培养瓶中，37℃，静止培养6-8h，注入装有180升厚氏液体培养液或LB培养基的180L培养罐中，37℃，静止培养6-8h，调节pH7.2，离心，收集菌体。菌苗与药用敷料组成混合物，制成单剂装容器中，用于生产痢疾多价基因工程冻干菌苗口服胶囊、滴鼻剂型。
1、痢疾多价基因工程菌苗冻干口服胶囊剂型的生产将上述收集到的湿菌体悬于含有0.5％明胶，5％蔗糖、0.2％维生素C、0.1％谷维素、0.1％脱脂奶粉，pH7.2的磷酸盐缓冲液中，使菌液的浓度为100亿CFU/ml，放于冻干盘内，-30℃，2-4h，真空达85uHg，升温到30℃，恒温，干燥20h，得到痢疾多价基因工程冻干菌苗冻干粉，置6-8℃，进行纯菌试验，结果表明存活率＞40％，水分＜3％，通过不同生物表型刚果红吸附、接触性溶血、Hela细胞入侵识别保护性抗原单抗(3G11、2E8、5F2、5D3)，用全菌WB、ELISA、Immunoblot等方法筛选和鉴定入侵表型(inv+)的能力。实验结果显示，痢疾多价基因工程菌苗冻干粉能表达双价LPS-O保护性抗原和Ipas抗原。将痢疾多价基因工程菌苗冻干粉与蔗糖、羧甲基淀粉钠、乳糖、可压性淀粉、硬脂酸镁按一定比例混匀，在口服胶囊GMP条件下制备胶囊剂型。使每粒口服胶囊的组成为痢疾多价基因工程菌苗株1.0亿CFU活菌、蔗糖15mg、羧甲基淀粉钠15mg、乳糖20mg、可压性淀粉20mg、硬脂酸镁0.4mg。
2、痢疾多价基因工程冻干菌苗滴鼻剂型的生产将上述收集到的多价基因工程菌苗悬于含有0.5％明胶，5％蔗糖、0.2％维生素C、0.1％谷维素、0.1％脱脂奶粉，pH7.2的磷酸盐缓冲液中，使菌液的活菌数为10亿CFU/ml，分装冻干盘内，-30℃，2-4h，真空达85uHg，升温到30℃，恒温，干燥20h，得到痢疾多价基因工程冻干菌苗粉剂。置6-8℃，进行纯菌试验，结果表明存活率＞40％，水分＜3％，通过不同生物表型刚果红吸附、接触性溶血、Hela细胞入侵识别保护性抗原单抗(3G11、2E8、5F2、5D3)，用全菌WB、ELISA、Immunoblot等方法筛选和鉴定入侵表型(inv+)的能力。实验结果显示，痢疾多价基因工程菌苗菌冻干粉能表达双价LPS-O保护性抗原和Ipas抗原。使每瓶滴鼻剂型的组成为痢疾多价基因工程菌苗0.1亿/瓶CFU冻干活菌，用前与0.2ml/瓶生理盐水(内含1％BL-9(9-十二烷基醚)、2％液体石蜡)溶解呈均匀的悬液备用。
3、将步骤1和步骤2得到的两种痢疾多价基因工程菌苗制剂进行以下鉴定1)纯度试验将制品稀释后，接种于厚氏大琼脂斜面(新鲜牛肉750g加入1125ml蒸馏水煮沸40min，冷却至45℃加入匀浆的新鲜猪胰脏150mg，调pH8.0，及加入三氯甲烷20ml，消化7d，用前4倍蒸馏水稀释，并加入氯化钠0.5％，调pH7.2-7.4，琼脂粉1.5g)或LB琼脂斜面(蛋白胨1.0g、酵母浸出液0.5g、氯化钠1.0g、琼脂粉1.5g，加水至100ml)，37℃培养48h，两种痢疾多价基因工程菌苗制剂均无杂菌生长。
2)抗原表达将稀释后的制品菌苗于厚氏大琼脂斜面(新鲜牛肉7500g加入11250ml蒸馏水煮沸40min，冷却至45℃加入匀浆的新鲜猪胰脏1500mg，调pH8.0，及加入三氯甲烷200ml，消化7d，用前4倍蒸馏水稀释，并加入氯化钠0.5％，调pH7.2-7.4备用，)或LB琼脂斜面(蛋白胨1.0g、酵母侵出液0.5g、氯化钠1.0g、琼脂粉1.5g，加水至100ml)划线，37℃培养20-22h，挑单个菌落与福氏型II，群3，4及宋内氏I相因子、和侵袭蛋白IpaA、IpaB、IpaC、IpaD血清做玻片凝集试验，结果上述两种痢疾多价基因工程菌苗制剂均呈4+多价强凝集反应。
3)活菌率及水分检测用比浊法进行活菌计数，用凯氏方法测水分含量，三批上述两种痢疾多价基因工程菌苗制剂活菌率及水分检测结果如表1所示，三批上述两种痢疾多价基因工程菌苗冻干制剂的生化反应如表2所示。
表1.两种痢疾多价基因工程菌苗冻干制剂活菌率及水分检测结果

注6010和6011为胶囊，6012为滴鼻剂将过夜培养的痢疾多价基因工程菌苗株、分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖和蔗糖的生化反应管(购于中国药品生物制品检定所)，37℃培养24h，观察其反应，反应管由绿色变为兰色为阳性(+)，两种痢疾多价基因工程菌苗制剂生化反应结果见表2表2.两种痢疾多价基因工程菌苗制剂生化反应结果

注6010和6011为痢疾多价基因工程菌苗口服胶囊，6012为痢疾多价基因工程菌苗滴鼻剂；FSM2117为痢疾双价基因工程菌苗口服制剂，“+”为阳性反应，“-”为阴性反应。
4)家兔抗体产生试验每次取各批上述两种制剂1支，用灭菌生理盐水稀释至6-20亿/ml，耳静脉途径免疫健康新西兰大耳白家兔，共三次(0.25ml，0.5ml，0.5ml)，每次间隔7天，每批制品免疫3只家兔，末次免疫后3-10天采血，测血清抗体效价。ELISA测定的要点是，分别用Sh.Sonnei、Sh.flexneri、Ipas分别包被酶联板，放4℃冰箱过夜，用PBS洗板，加入倍比稀释的免疫兔血清放37℃孵箱2.0h，用碳酸缓冲液洗板，加入稀释的酶标羊抗兔抗体放37℃孵箱1.0h，随后用2N硫酸中止反应，在紫外分光光度仪上测定，并换算抗体效价。结果如表3所示，表明上述两种痢疾多价基因工程菌苗冻干制剂均有良好的免疫原性。
表3.两种痢疾多价基因工程菌苗冻干制剂的血清凝集抗体效价

注6010和6011为胶囊，6012为滴鼻剂。
5)毒力试验采用豚鼠角膜试验，取上述两种痢疾多价基因工程菌苗制剂活化后的菌苔(直径3mm，约50亿活菌)，涂入豚鼠角结膜囊中，观察7天，三批上述两种痢疾多价基因工程菌苗冻干制剂均未引起任何炎症反应。
6)Ipas检测将上述两种痢疾多价基因工程菌苗冻干制剂接种厚氏液体培养液(新鲜牛肉750g加入1125ml蒸馏水煮沸40min，冷却至45℃加入匀浆的新鲜猪胰脏150mg，调pH8.0，及加入三氯甲烷20ml，消化7d，用前4倍蒸馏水稀释，并加入氯化钠0.5％，调pH7.2-7.4备用)或LB培养基(蛋白胨10g、酵母浸出液5g、氯化钠10g，加水至1000ml，pH7.2-7.5)，待菌浓度达1010cfu/ml(37℃培养20小时)，用10％SDS-PAGE电泳检测，结果表明痢疾多价基因工程菌苗均比痢疾双价基因工程菌苗株增加了侵袭蛋白的抗原蛋白。
7)系统的入侵表型鉴定对历时2年的不同批次的口服胶囊或滴鼻制剂对近200例志愿者采集粪便逐个进行生化、遗传学及抗原表达的系统检测，证明粪便排出的痢疾多价基因工程菌苗与口服及滴鼻痢疾多价基因工程菌苗在质粒大小、生化特性、抗原表达及豚鼠角膜试验等方面无差异，与实验室大量动物刚果红吸附、接触性溶血、Hela细胞入侵试验结果一致，证明痢疾多价基因工程菌苗有很好的入侵表型。
序列表<160>8<210>1<211>633<212>PRT<213>志贺氏菌属(Shigella)<400>1Met His Asn Val Asn Asn Thr Gln Ala Pro Thr Phe Leu Tyr Lys Ala1 5 10 15Thr Ser Pro Ser Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Leu Lys Ser Lys Ile Ser20 25 30Asp Ile His Ser Ser Gln Thr Ser Leu Lys Thr Pro Ala Ser Val Ser35 40 45Glu Lys Glu Asn Phe Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Cys Leu Asp Phe50 55 60Leu Phe Ser Ser Ser Gly Lys Glu Asp Val Leu Arg Ser Ile Tyr Ser65 70 75 80Asn Ser Met Asn Ala Tyr Ala Lys Ser Glu Ile Leu Glu Phe Ser Asn85 90 95Val Leu Tyr Ser Leu Val His Gln Asn Asp Leu Asn Phe Glu Asn Glu100 105 110Lys Gly Leu Gln Lys Ile Val Ala Gln Tyr Ser Glu Leu Ile Ile Lys115 120 125Asp Lys Leu Ser Gln Asp Ser Ala Phe Gly Pro Trp Ser Ala Lys Asn130 135 140Lys Lys Leu His Gln Leu Arg Gln Asn Ile Glu His Arg Leu Ala Leu145 150 155 160Leu Ala Gln Gln His Thr Ser Gly Glu Ala Leu Ser Leu Gly Gln Lys165 170 175
Leu Leu Asn Thr Glu Val Ser Ser Phe Ile Lys Asn Asn Ile Leu Ala180 185 190Glu Leu Lys Leu Ser Asn Glu Thr Val Ser Ser Leu Lys Leu Asp Asp195 200 205Leu Val Asp Ala Gln Ala Lys Leu Ala Phe Asp Ser Leu Arg Asn Gln210 215 220Arg Lys Asn Thr Ile Asp Ser Lys Gly Phe Gly Ile Gly Lys Leu Ser225 230 235 240Arg Asp Leu Asn Thr Val Ala Val Phe Pro Glu Leu Leu Arg Lys Val245 250 255Leu Asn Asp Ile Leu Glu Asp Ile Lys Asp Ser His Pro Ile Gln Asp260 265 270Gly Leu Pro Thr Pro Pro Glu Asp Met Pro Asp Gly Gly Pro Thr Pro275 280 285Gly Ala Asn Glu Lys Thr Ser Gln Pro Val Ile His Tyr His Ile Asn290 295 300Asn Asp Asn Arg Thr Tyr Asp Asn Arg Val Phe Asp Asn Arg Val Tyr305 310 315 320Asp Asn Ser Tyr His Glu Asn Pro Glu Asn Asp Ala Gln Ser Pro Thr325 330 335Ser Gln Thr Asn Asp Leu Leu Ser Arg Asn Gly Asn Ser Leu Leu Asn340 345 350Pro Gln Arg Ala Leu Val Gln Lys Val Thr Ser Val Leu Pro His Ser355 360 365Ile Ser Asp Ala Val Gln Thr Phe Ala Asn Asn Ser Ala Leu Glu Lys370 375 380Val Phe Asn His Thr Pro Asp Asn Ser Asp Gly Ile Gly Ser Asp Leu385 390 395 400Leu Thr Thr Ser Ser Gln Glu Arg Ser Thr Asn Asn Ser Leu Ser Arg405 410 415Gly His Arg Pro Leu Asn Ile Gln Asn Ser Ser Thr Thr Pro Pro Leu420 425 430
His Pro Glu Gly Val Thr Ser Ser Asn Asp Asn Ser Ser Asp Thr Thr435 440 445Lys Ser Ser Ala Ser Leu Ser His Arg Val Ala Ser Gln Ile Asn Lys450 455 460Phe Asn Ser Asn Thr Asp Ser Lys Val Leu Gln Thr Asp Phe Leu Ser465 470 475 480Arg Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Thr Arg Glu Thr Ile Phe Glu Ala Ser485 490 495Lys Lys Val Thr Asn Ser Leu Ser Asn Leu Ile Ser Leu Ile Gly Thr500 505 510Lys Ser Gly Thr Gln Glu Arg Glu Leu Gln Glu Lys Ser Lys Asp Ile515 520 525Thr Lys Ser Thr Thr Glu His Arg Ile Asn Asn Lys Leu Lys Val Thr530 535 540Asp Ala Asn Thr Ile Asn Tyr Val Thr Glu Thr Asn Ala Asp Thr Ile545 550 555 560Asp Lys Asn His Ala Ile Tyr Glu Lys Ala Lys Glu Val Ser Ser Ala565 570 575Leu Ser Lys Val Leu Ser Lys Ile Asp Asp Thr Ser Ala Glu Leu Leu580 585 590Thr Asp Asp Ile Ser Asp Leu Lys Asn Asn Asn Asp Ile Thr Ala Glu595 600 605Asn Asn Asn Ile Tyr Lys Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr Ser Leu Ser610 615 620Lys Val Leu Lys Asn Ile Asn Lys Asp625 630<210>2<211>580<212>PRT<213>志贺氏菌属(Shigella)
<400>2Met His Asn Val Ser Thr Thr Thr Thr Gly Leu Pro Leu Ala Lys Ile1 5 10 15Leu Ala Ser Thr Glu Leu Gly Asp Asn Thr Ile Gln Ala Ala Asn Asp20 25 30Ala Ala Asn Lys Leu Phe Ser Leu Thr Ile Ala Asp Leu Ala Ala Asn35 40 45Lys Asn Ile Asn Thr Thr Asn Ala His Ser Thr Ser Asn Ile Leu Ile50 55 60Pro Glu Leu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Asn Ala Ser Ser Gln Leu Thr65 70 75 80Leu Leu Ile Gly Asn Leu Ile Gln Ile Leu Gly Glu Lys Ser Leu Thr85 90 95Ala Leu Thr Asn Lys Ile Thr Ala Trp Lys Ser Gln Gln Gln Ala Arg100105110Gln Gln Lys Asn Leu Glu Phe Ser Asp Lys Ile Asn Thr Leu Leu Ser115120125Glu Thr Glu Gly Leu Thr Arg Asp Tyr Glu Lys Gln Ile Asn Lys Leu130135140Lys Asn Ala Asp Ser Lys Ile Lys Asp Leu Glu Asn Lys Ile Asn Gln145150155160Ile Gln Thr Arg Leu Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ser Pro Glu Asn Lys165170175Lys Leu Arg Arg Glu Glu Ile Gln Leu Thr Ile Lys Lys Asp Ala Ala180 185190Val Lys Asp Arg Thr Leu Ile Glu Gln Lys Thr Leu Ser Ile His Ser195 200 205Lys Leu Thr Asp Lys Ser Met Gln Leu Glu Ser Leu Gln Glu Ser Arg210 215 220Lys Thr Glu Met Glu Arg Lys Ser Asp Glu Tyr Lys Glu Ile Asp Ser225 230 235 240Phe Ser Ala Phe Ser Asn Thr Ala Ser Ala Glu Gln Leu Ser Thr Gln
245 250 255Gln Lys Ser Leu Thr Gly Leu Ala Ser Val Thr Gln Leu Met Ala Thr260 265 270Phe Ile Gln Leu Val Gly Lys Asn Asn Glu Glu Ser Leu Lys Asn Asp275 280 285Leu Ala Leu Phe Gln Ala Ala Glu Val Arg Lys Ala Glu Glu Leu Asn290 295 300Arg Val Met Gly Cys Val Gly Lys Ile Leu Gly Ala Leu Leu Thr Ile305 310 315 320Val Ser Val Val Ala Ala Ala Phe Ser Gly Gly Ala Ser Leu Ala Leu325 330 335Ala Ala Val Gly Leu Ala Leu Met Val Thr Asp Ala Ile Val Gln Ala340 345 350Ala Thr Gly Asn Ser Phe Met Glu Gln Ala Leu Asn Pro Ile Met Lys355 360 365Ala Val Ile Glu Pro Leu Ile Lys Leu Leu Ser Asp Ala Phe Thr Lys370 375 380Met Leu Glu Gly Leu Gly Val Asp Ser Lys Lys Ala Lys Met Ile Gly385 390 395 400Ser Ile Leu Gly Ala Ile Ala Gly Ala Leu Val Leu Val Ala Ala Val405 410 415Val Leu Val Ala Thr Val Gly Lys Gln Ala Ala Ala Lys Leu Ala Glu420 425 430Asn Ile Gly Lys Ile Ile Gly Lys Thr Leu Thr Asp Leu Ile Pro Lys435 440 445Phe Leu Lys Asn Phe Ser Ser Gln Leu Asp Asp Leu Ile Thr Asn Ala450 455 460Val Ala Arg Leu Asn Lys Phe Leu Gly Ala Ala Gly Asp Glu Val Ile465 470 475 480Ser Lys Gln Ile Ile Ser Thr His Leu Asn Gln Ala Val Leu Leu Gly485 490 495Glu Ser Val Asn Ser Ala Thr Gln Ala Gly Gly Asn Val Ala Ser Ala
500 505 510Val Phe Gln Asn Asn Ala Ser Lys Asn Leu Ala Asp Leu Thr Leu Ser515 520 525Lys Tyr Gln Val Glu Gln Leu Ser Lys Tyr Ile Gly Asp Ala Ile Glu530 535 540Lys Phe Gly Gln Leu Gln Glu Val Ile Ala Glu Leu Leu Ala Ser Met545 550 555 560Ser Asn Ser Gln Ala Asn Arg Thr Asp Val Ala Lys Ala Ile Leu Gln565 570 575Gln Thr Thr Ala580<210>3<211>363<212>PRT<213>志贺氏菌属(Shigella)<400>3Met Glu Ile Gln Asn Thr Lys Ser Ala Pro Ile Leu Tyr Thr Asp Ile1 5 10 15Ser Thr Lys Gln Thr Gln Ser Ser Ser Glu Thr Gln Lys Ser Gln Asn20 25 30Tyr Gln Gln Leu Ala Ala His Ile Pro Leu Asn Val Gly Lys Asn Pro35 40 45Val Leu Thr Thr Thr Leu Asn Asp Asp Gln Leu Leu Lys Leu Ser Glu50 55 60Gln Val Gln His Asp Ser Glu Ile Ile Ala Arg Leu Thr Asp Lys Lys65 70 75 80Met Lys Asp Leu Ser Glu Met Ser His Thr Ile Thr Pro Glu Asn Thr85 90 95Leu Asp Ile Ser Ser Leu Ser Ser Asn Ala ValSer Leu Ile Ile Ser100 105110
Val Ala Val Leu Leu Ser Ala Leu Arg Thr Ala Glu Thr Arg Leu Gly115 120 125Ser Gln Leu Ser Leu Ile Ala Phe Asp Ala Thr Lys Ser Ala Ala Glu130 135 140Asn Ile Val Arg Gln Gly Leu Ala Ala Leu Ser Ser Ser Ile Thr Gly145 150 155 160Ala Val Thr Gln Val Gly Ile Thr Gly Ile Gly Ala Lys Lys Thr His165 170 175Ser Gly Ile Ser Glu Gln Lys Gly Ala Leu Arg Lys Asn Leu Ala Thr180 185 190Ala Gln Ser Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gly Ser Lys Leu Gly Leu Asn195 200 205Lys Gln Ile Asp Thr Asn Ile Thr Ser Pro Gln Thr Asn Ser Ser Thr210 215 220Lys Ile Leu Gly Lys Asn Lys Leu Ala Pro Asp Asn Ile Ser Leu Ser225 230 235 240Thr Glu His Lys Thr Ser Leu Ser Ser Pro Asp Ile Ser Leu Gln Asp245 250 255Lys Ile Asp Thr Gln Arg Arg Ala Tyr Glu Leu Asn Thr Leu Ser Ala260 265 270Gln Gln Lys Gln Asn Ile Gly Arg Ala Thr Met Glu Thr Ser Ala Val275 280 285Ala Gly Asn Ile Ser Thr Ser Gly Gly Arg Tyr Thr Ser Ala Leu Glu290 295 300Glu Glu Glu Gln Leu Ile Ser Gln Ala Ser Ser Lys Gln Ala Glu Glu305 310 315 320Ala Ser Gln Val Ser Lys Glu Ala Ser Gln Ala Thr Asn Gln Leu Ile325 330 335Gln Lys Leu Leu Asn Ile Ile Asp Asn Ile Asn Gln Ser Arg Asn Ser340 345 350Thr Ala Ser Gln Ile Ala Gly Asn Ile Arg Ala355 360
<210>4<211>332<212>PRT<213>志贺氏菌属(Shigella)<400>4Met Asn Ile Thr Thr Leu Thr Asn Ser Ile Ser Thr Ser Ser Phe Ser1 5 10 15Pro Asn Asn Thr Asn Gly Ser Ser Thr Glu Thr Val Asn Ser Asp Ile20 25 30Lys Thr Thr Thr Ser Ser His Pro Val Ser Ser Leu Thr Met Leu Asn35 40 45Asp Thr Leu His Asn Ile Arg Thr Thr Asn Gln Ala Leu Lys Lys Asp50 55 60Leu Ser Gln Lys Thr Leu Thr Lys Thr Ser Leu Glu Glu Ile Ala Leu65 70 75 80His Ser Ser Gln Ile Ser Met Asp Val Asn Lys Ser Ala Gln Leu Leu85 90 95Asp Ile Leu Ser Lys Lys Glu Tyr Pro Ile Asn Lys Asp Ala Arg Glu100 105 110Leu Leu His Ser Ala Pro Lys Glu Ala Glu Leu Asp Gly Tyr Glu Met115 120 125Ile Ser His Arg Glu Leu Trp Asp Lys Ile Ala Lys Ser Ile Asn Asn130 135 140Ile Asn Glu Gln Tyr Leu Lys Val Tyr Glu His Ala Val Ser Ser Tyr145 150 155 160Thr Gln Met Tyr Gln Asp Phe Ser Ala Val Leu Ser Ser Leu Ala Gly165 170 175Trp Ile Ser Pro Gly Gly Asn Asp Gly Asn Ser Val Lys Leu Gln Val180 185 190Lys Ser Leu Lys Asp Glu Leu Thr Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Lys Asp
195 200 205Lys Pro Leu Tyr Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Lys Glu Gln Ala Asn210 215 220Lys Trp Leu Thr Glu Leu Gly Gly Thr Ile Gly Lys Val Ser Glu Lys225 230 235 240Asn Gly Gly Tyr Val Val Asn Ile Asn Met Thr Pro Ile Asp Asn Met245 250 255Leu Lys Ser Leu Asp Asn Leu Gly Gly Asn Gly Glu Val Val Leu Asp260 265 270Asn Ala Lys Tyr Gln Ala Trp Asn Ala Gly Phe Ser Ala Glu Asp Glu275 280 285Thr Met Lys Asn Asn Leu Gln Thr Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ala290 295 300Asn Ser Ile Phe Asp Asn Leu Val Lys Val Leu Ser Ser Thr Ile Ser305 310 315 320Ser Cys Thr Asp Thr Asp Lys Leu Phe Leu His Phe325 330<210>5<211>1902<212>DNA<213>志贺氏菌属(Shigella)<400>5atgcataatg taaataatac tcaagcgcca acattcttat ataaggcaac ttcaccatca60tcaacagaat acagcgagtt aaaaagcaaa atatccgata tccatagttc gcaaacttct120ctaaaaacac cagcatcagt gtctgaaaaa gaaaactttg caacgtcttt taatcagaaa180tgtcttgatt ttttattttc ttcctcaggg aaagaagatg tgttaagaag catttattcc240aactcaatga atgcgtatgc caaaagcgag attctcgaat tttcaaatgt tttgtactcc300ttagtacatc aaaatgatct taattttgaa aacgaaaagg gacttcaaaa aattgtcgca360cagtattcgg aactaattat aaaagataaa ttatcccaag attctgcctt tggaccatgg420tcggcaaaga ataagaaact ccatcaatta cgacaaaaca ttgagcacag acttgcacta480ttagcacaac aacacacatc tggtgaagct ttatcattgg gacaaaaact cctcaatact540gaagtatcat catttatcaa gaataatatt cttgctgaat taaagttaag taatgaaact600
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权利要求
1.一种痢疾多价基因工程菌苗，它的活性成分是既表达侵袭蛋白抗原IpaA，IpaB，IpaC和IpaD，又表达福氏和宋内氏双价LPS-0多糖抗原的痢疾多价基因工程菌苗株。
2.根据权利要求1所述的菌苗，其特征在于所述痢疾多价基因工程菌苗的生产培养基为pH为6.5-7.6的厚氏培养基或LB培养基。
3.根据权利要求2所述的菌苗，其特征在于所述生产培养基的pH为7.2-7.5。
4.根据权利要求1或2或3所述的菌苗，其特征在于所述痢疾多价基因工程菌苗的剂型为胶囊口服剂型或滴鼻剂型。
5.根据权利要求4所述的菌苗，其特征在于所述剂型的痢疾多价基因工程菌苗采用冻干法进行制备。
6.根据权利要求5所述的菌苗，其特征在于在制备所述剂型的痢疾多价基因工程菌苗过程中所采用的冻干保护剂为pH7.0-7.6的含有0.5％明胶，5％蔗糖、0.2％维生素C、0.1％谷维素、0.1％脱脂奶粉的磷酸缓冲液；所述百分含量为质量质量百分含量。
7.一种制备权利要求1所述痢疾多价基因工程菌苗株的方法，包括以下步骤1)将含有侵袭蛋白IpaA，IpaB，IpaC和IpaD基因的I相质粒转移到福氏痢疾杆菌2a型II中，得到含有所述I相质粒的重组福氏痢疾杆菌2a型II；2)将含有所述I相质粒的重组福氏痢疾杆菌2a型II中的aroD基因缺失，得到既表达侵袭蛋白抗原IpaA、IpaB、IpaC和IpaD，又表达福氏和宋内氏双价LPS-O多糖抗原的痢疾多价基因工程菌苗株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述含有侵袭蛋白IpaA，IpaB，IpaC和IpaD基因的I相质粒来自于宋内氏痢疾菌毒株48025-11或宋内氏痢疾菌株S63。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述含有侵袭蛋白IpaA，IpaB，IpaC和IpaD基因的I相质粒通过诱动质粒R386转移到福氏痢疾杆菌2a型II中；所述诱动质粒R386来自于E.coli。
10.根据权利要求7或8或9所述的方法，其特征在于所述福氏痢疾杆菌2a型II为福氏痢疾杆菌2a型II T32菌株。
全文摘要
本发明公开了一种痢疾多价基因工程菌苗。本发明所提供的痢疾多价基因工程菌苗，它的活性成分是既表达侵袭蛋白抗原IpaA、IpaB、IpaC和IpaD，又表达福氏和宋内氏双价LPS－O多糖抗原的痢疾多价基因工程菌苗株。经不同实验动物(小鼠、豚鼠、家兔和猴)滴鼻或口服途径免疫，证明本发明的痢疾多价基因工程菌苗有很好的多价免疫原性，可保护免疫小鼠、猴有效抵抗S.F2a及S.sonnei毒株的攻击，并以经大量动物和人群观察证明比痢疾双价基因工程菌苗免疫剂量降低100倍以上，并且免疫保护效果明显提高，及能有效诱导粘膜多价特异抗体反应，可提供多价保护，并可进行大量生产，可有效预防细菌性痢疾。
文档编号C12N15/09GK1912106SQ20051008985
公开日2007年2月14日 申请日期2005年8月9日 优先权日2005年8月9日
发明者王希良, 邢丽, 罗德炎, 张松乐, 王栋, 江海燕, 杨海荣, 张良艳, 高杰英 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所