专利名称：一种脂肪来源干细胞向脂肪细胞诱导分化的方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及将来自脂肪组织的干细胞在体外向脂肪细胞定向诱导分化，并将诱导分化的细胞作为种子细胞用于组织工程脂肪组织的构建，制备弥补软组织凹陷、组织修复以及正常组织的填充物。
背景技术：
对于软组织凹陷、组织修复及正常组织的填充，最初人们利用吸脂术提取出来的脂肪颗粒细胞进行修复移植，但没有取得理想的效果。植入的脂肪细胞多数很快坏死、液化和吸收(Ellenbogen R.1990)。这是由于成熟的脂肪细胞胞浆中80％～90％是由脂滴组成，容易受机械损伤导致细胞活性的丧失。此外，成熟的脂肪细胞是一种终末分化的细胞，不能够在体内有效的增殖发育。
近来研究发现，人体组织内具有一类能够不断自我更新和增殖，具有多向分化潜能的细胞群体——干细胞。它能够在体外培养、增殖并且分化成不同的组织细胞。有证据表明(Zuk P.A，2001)分离自经胶原酶处理后的脂肪组织的基质-血管部分含有大量的前脂肪细胞，或倾向于分化为脂肪细胞的干细胞。这些细胞能以较低的频率自发地分化为脂肪细胞，在脂肪促进剂(如地塞米松，IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)等)的作用下，可提高这些细胞的分化效率。他们很容易从脂肪组织获取，能够在体外大规模培养和扩增，性质稳定，机械抵抗力强。它们在体外适当的培养环境或体内固有的微环境下能够被诱导分化为脂肪和血管内皮等组织。诱导分化的细胞不仅可用于组织工程化脂肪组织的构建，并且与脂肪颗粒相比，在面部皮下凹陷性缺损或畸形的修复、身体其他部位软组织凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，膨体、硅胶片、人工骨粉填充后残留部分凹陷的矫正及美容中具有更大的应用前景。
发明内容
本发明提供了来源于脂肪组织的干细胞分化为脂肪细胞的方法和组合物，诱导分化后的细胞群可用于面部皮下凹陷性缺损或畸形的修复、身体其他部位软组织凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，还可以用于膨体、硅胶片、人工骨粉填充后仍留存少部分凹陷的矫正及美容等。
本发明是通过以下技术方案实现的(1)脂肪组织来源的干细胞的分离培养1)人类脂肪组织可通过任何适当的方法如手术或脂肪抽吸术而获得。脂肪抽吸术是目前应用最为普遍的方法，因此脂肪抽吸物是本发明细胞的一个特别优选来源。
2)获取的脂肪组织以生理学相容性溶液诸如磷酸缓冲液冲洗，随后在脂肪组织中加入缓冲液，搅拌并放置至澄清，以除去损伤组织、血液和红细胞等。
3)用蛋白水解酶(例如胶原酶、分散酶、胰蛋白酶等)水解方法解离组织，此类酶可减弱或破坏细胞间的结合，从脂肪结缔组织基质中释放出游离的脂肪细胞。由于成熟脂肪细胞的密度较低，通常浮在等渗缓冲溶液的上层，脂肪组织来源的干细胞将沉淀到溶液下层，而中间层则包括结缔组织基质和脂肪细胞聚集体。
4)使用平衡密度离心方法分离得到富含脂肪组织来源的干细胞群体的部分(下层)。
5)用磷酸缓冲液悬浮沉淀的细胞，通过加入高张盐溶液保温及加入红细胞裂解液等方法破坏并除去残留的红细胞。悬浮的细胞可经过一次或连续多次(2～3次)的洗涤，再离心和重悬浮以获得更高的纯度。或者，这些细胞可通过使用流式细胞仪分选或根据细胞的大小和基粒的有无进行分离，干细胞较小并相对无基粒。
6)最终的分离和重悬浮之后，用标准的细胞培养基进行扩大培养，以增加干细胞的数量。常用的标准培养基如添加5％～15％(例如10％)血清(包括胎牛血清，马血清等)的DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium)或者D/F12培养基。培养传代的细胞形态如附图1所示。
(2)脂肪组织来源的干细胞表面标志的鉴定取第5代培养扩增的脂肪组织来源的干细胞，胰酶消化收集细胞，离心。以PBS洗涤细胞2～3次后，用1ml PBS重悬细胞，计数。用PBS调整细胞浓度为1×106个/ml，按5×105个细胞/管将细胞平均分至多个EP管中，分别将PE或FITC标记的多个抗体进行组合，加入各管中，室温下孵育20～30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重悬细胞后，用流式细胞仪对培养扩增细胞的表面标志进行检测和鉴定。
(3)脂肪组织来源的干细胞的成脂肪诱导分化1)将扩增的脂肪组织来源的干细胞应用诱导分化的限定培养基进行诱导分化。
2)诱导脂肪组织发生的培养基可以是含有糖皮质激素(例如，异丁基-甲基黄嘌呤、地塞米松、氢化可的松、可的松等等)、胰岛素、一种提高细胞内cAMP水平的化合物(例如二丁缩醛-cAMP、8-溴-cAMP、毛喉素等)，和/或一种抑制cAMP降解的化合物(例如，一种磷酸二酯酶抑制剂，如甲基异丁基黄嘌呤、消炎痛，及其它类似物)以及其他一些物质。例如一种诱导方案是DMEM，10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰岛素，200μM引哚美辛，1％链霉素/青霉素剂，0.5mM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)，泛酸盐，生物素。
应用本发明方法所获得的含有脂肪干细胞、脂肪细胞的细胞群体可应用于组织工程化脂肪组织的构建，制备弥补软组织凹陷和组织修复的填充物以及制备用于美容的正常组织填充物。
本发明是将脂肪来源的干细胞在体外向脂肪细胞定向诱导分化后，将诱导分化的细胞群用于组织工程化脂肪组织的构建，面部皮下凹陷性缺损或畸形的修复、身体其他部位软组织凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，还可以用于膨体、硅胶片、人工骨粉填充后仍留存少部分凹陷的矫正及美容等。因此，市场价值潜力巨大，具有广阔的应用前景。
图1第二代脂肪组织来源的干细胞形态学观察(×100倍)。
图2脂肪组织来源干细胞的流式分析(1)FITC阴性对照；(2)CD90表达阳性；(3)CD45表达阴性；(4)CD44表达阴性；(5)CD71表达阳性；(6)CD16表达阴性；(7)CD30表达阴性；(8)PE阴性对照；(9)CD34表达阴性；(10)CD29表达阳性；(11)CD3表达阴性；(12)CD11b表达阴性；(13)CD133表达阴性；(14)CD19表达阴性。
图3脂肪组织来源干细胞的向脂肪细胞分化a成脂诱导培养两周，细胞内充满脂质的液泡呈油红O染色阳性；b成脂诱导一周的细胞中充满脂质的小滴(×100倍)；c成脂诱导二周细胞充满脂质的小滴(×200倍)。
具体实施例方式
实施例1脂肪组织来源干细胞的体外分离和培养扩增用磷酸盐缓冲溶液(PBS)反复冲洗吸脂手术得到的吸出物，随后在其中加入PBS，搅拌并放置至澄清，以除去损伤组织、血液和部分红细胞等，然后加入浓度约为0.1％的胶原酶，轻轻搅拌下37℃消化45分钟。1500转离心5分钟，收集细胞沉淀物，并将沉淀悬浮于红细胞裂解液(Tris-NH4Cl)中，室温静置10分钟后，再次离心收集细胞。如此反复处理两次，以尽可能地破碎并除去红细胞。细胞悬液离心收集下层细胞沉淀物，然后使用溴酚兰染料排除法检测细胞的存活率并计数活细胞的比例。
存活细胞在含10％胎牛血清的标准DMEM培养基中37℃、5％CO2培养。当细胞达到约80％汇合时，传代培养，培养基为含10％胎牛血清的标准DMEM培养基，37℃、5％CO2培养。培养至细胞形成单层后用0.25％的胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化解离单层并收集游离的细胞，准备用于分化培养基中进行干细胞定向分化培养。
实施例2脂肪组织来源干细胞表面标志鉴定取第5代培养扩增的脂肪组织来源的干细胞，0.25％胰酶消化收集细胞，离心。以PBS洗涤细胞2次后，用1ml PBS重悬细胞，计数。用PBS调整细胞浓度为1×106个/ml，按5×105个细胞/管将细胞平均分至多个EP管中，分别将PE或FITC标记的多个抗体(CD90、CD44、CD45、CD71、CD16、CD30、CD34、CD29、CD3、CD11b、CD133和CD19)进行组合，加入各管中，室温下孵育30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重悬细胞后，用流式细胞仪对培养扩增细胞的表面标志进行检测和鉴定。结果显示，脂肪组织来源的干细胞，CD90、CD29和CD71表达阳性，说明其是间质来源的一类具有干细胞性质的细胞(见图2)。
实施例3脂肪组织来源干细胞向脂肪细胞的定向诱导分化及应用使用含有10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰岛素，200μM引哚美辛，1％青霉素/链霉素，0.5mM IBMX的DMEM培养基在常规条件(37℃，5％CO2)下对脂肪组织来源干细胞继续培养。培养7～15天后，取诱导培养的细胞克降，甲醇固定2min，50％酒精漂洗，加入油红O染料染色10min，50％酒精漂洗后，用水冲洗，苏木精复染1min，镜下观察染色情况，呈油红O染色阳性，表明细胞内有脂质小泡存在，根据这一特征可判定干细胞已出现向成熟脂肪细胞分化的趋势。将未分化的或部分向脂肪细胞分化的脂肪组织来源的干细胞单独注射或手术方式植入到接受治疗的区域如脸颊、嘴唇等部位以除皱和/或美容。还可将未分化的或部分向脂肪细胞分化的脂肪组织来源的干细胞注射植入需要改变的有缺陷的受区内，以改变完善受区的形态。常见的有面部皮下凹陷性缺损或畸形的修复、身体其他部位软组织凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，还可以用于膨体、硅胶片、人工骨粉填充后仍留存少部分凹陷的矫正。
权利要求
1.一种脂肪来源干细胞向脂肪细胞诱导分化的方法，其特征在于将脂肪来源的干细胞应用成脂分化培养基向脂肪细胞诱导分化。
2.根据权利要求1所述的脂肪来源干细胞向脂肪细胞诱导分化的方法，其特征在于所述的脂肪组织来源的干细胞其分离方法包括以下步骤(1)以磷酸缓冲液冲洗脂肪组织后，加入缓冲液，搅拌并放置至澄清，除去损伤组织、血液和红细胞；(2)蛋白水解酶水解脂肪组织；(3)平衡密度离心，分离脂肪组织来源的干细胞群；(4)磷酸缓冲液重悬分离的细胞，加入高张盐溶液保温及加入红细胞裂解液，破坏并除去残留的红细胞；(5)离心去除上清液，加入磷酸缓冲液重悬及离心洗涤，得到脂肪组织来源的干细胞。
3.根据权利要求1所述的脂肪来源干细胞向脂肪细胞诱导分化的方法，其特征在于用于诱导脂肪来源干细胞向成脂肪细胞分化的培养基可以是含有糖皮质激素(例如，异丁基-甲基黄嘌呤、地塞米松、氢化可的松、可的松等等)、胰岛素、一种提高细胞内cAMP水平的化合物(例如二丁缩醛-cAMP、8-溴-cAMP、毛喉素等)，和/或一种抑制cAMP降解的化合物(例如，一种磷酸二酯酶抑制剂，如甲基异丁基黄嘌呤、消炎痛，及其它类似物)以及其他-些物质。
4.根据权利要求1所述的脂肪来源干细胞向脂肪细胞诱导分化的方法，其特征在于用于脂肪来源干细胞向成脂肪细胞分化的一种诱导方案可以是DMEM，10％FBS，1μM地塞米松，10μM胰岛素，200μM引哚美辛，1％链霉素/青霉素剂，0.5mM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)，泛酸盐，生物素。
5.诱导分化后的脂肪细胞群的应用，其特征在于根据权利要求1所述方法得到的诱导分化后的脂肪细胞群可为工程化脂肪组织的制备提供种子细胞。
6.诱导分化后的脂肪细胞群的应用，其特征在于根据权利要求1所述方法得到的诱导分化后的脂肪细胞群可用于制备弥补面部皮下凹陷性缺损或畸形修复的填充物，常见的面部皮下凹陷性缺损或畸形如面部软组织发育不良，面部手术或外伤导致的凹陷，单侧或双侧颜面萎缩，颧、颞、额、眶区的凹陷，上唇过薄或人中过短，鼻唇沟过深，耳垂较小。
7.诱导分化后的脂肪细胞群的应用，其特征在于根据权利要求1所述方法得到的诱导分化后的脂肪细胞群可用于制备弥补身体其他部位软组织凹陷的填充物，常见的身体其他部位软组织凹陷如先天性乳房发育不良，哺乳后乳房萎缩，双侧乳房大小不对称，乳头凹陷畸形，臀部、大腿、小腿弯曲，吸脂术后的凹陷，手部软组织萎缩。
8.诱导分化后的脂肪细胞群的应用，其特征在于根据权利要求1所述方法得到的诱导分化后的脂肪细胞群可用于制备生殖器的改型塑造填充物。
9.诱导分化后的脂肪细胞群的应用，其特征在于根据权利要求1所述方法得到的诱导分化后的脂肪细胞群可用于膨体、硅胶片、人工骨粉填充凹陷后，仍留存少部分凹陷的矫正。
10.诱导分化后的脂肪细胞群的应用，其特征在于根据权利要求1所述方法得到的诱导分化后的脂肪细胞群可用于美容，即可填充于正常组织，达到美容的目的。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及将来自脂肪组织的干细胞在体外向脂肪细胞定向诱导分化的方法，利用此方法可提供大量的细胞，用于组织工程脂肪组织的构建，制备弥补软组织凹陷、组织修复以及正常组织的填充物。应用本方法得到的脂肪细胞群，不仅可以用于面部皮下凹陷性缺损或畸形的修复、身体其他部位软组织凹陷的填充、生殖器的改型塑造填充，还可以用于膨体、硅胶片、人工骨粉填充后仍留存少部分凹陷的矫正及美容。因此，市场价值潜力巨大，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N5/08GK1912110SQ20051008984
公开日2007年2月14日 申请日期2005年8月9日 优先权日2005年8月9日
发明者裴雪涛, 管利东, 王韫芳, 闫舫, 李绍青, 白慈贤, 岳慧敏, 南雪 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所