专利名称：模拟细胞外基质的脂肪来源干细胞的干细胞性增进用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及对细胞外基质进行模拟，使得干细胞的特性得以维持以及增进的干细胞性增进用组合物。
背景技术：
皮肤由表皮、真皮以及皮下组织构成，真皮组织中作为三维的支撑体具有含有无机盐类、营养成分，废物等的水溶液和多糖类大分子等的细胞外基质(extracellular matrix 以下称之为ECM)成分。这些在包围细胞的空间内形成网络而维持并支承组织的形态，起到调节细胞间的信号传递以及细胞的生长和分化的重要的作用。至今为止，被模拟的ECM成分大部分来自于动物。但是，来自动物的成分中，病原体感染等安全性问题渐渐显现，因此具有不在化妆品使用的趋势。已知占ECM总体的70 80%的主要成分胶原蛋白是长度较长的纤维结构的蛋白质中的一种，对皮肤强度和弹性进行调节，因此与皮老化即弹性减少或皱纹的形成等有密切的关联。但是，目前使用的大部分胶原蛋白为来自动物的原料，是分子量为约30万Da左右的高分子，因此对经皮肤的传达而言，胶原蛋白本身具有吸收的限度。作为ECM成分之一的透明质酸(hyaluronic acid)能够起到使皮肤内真皮组织的细胞相互结合并传递营养成分的作用，使皮肤能够维持适量的水分。但是，由于透明质酸是分子量在数十万到数百万的高分子，因此由于粘度高而用于化妆品时使用量受限，且具有直接涂抹在皮肤时很难透过皮肤的缺陷。皮肤为构成人体的器官中最大的器官，占我们身体体积的约16%，面积为1. 8m2， 厚度为2 4mm，重量为约3kg，由表皮、真皮以及皮下脂肪层构成。这种皮肤与外部环境直接接触而起到使人体免受人体有害微生物之类的多种有害因子和紫外线等外部刺激的影响的重要的保护膜作用，并且是营造全身的代谢所需的生化功能的对生命维持必不可少的器官。尤其，存在于真皮下方的皮下脂肪层由脂肪细胞(adipocyte)的小叶构成，针对外部的热量起到保护皮肤内部的器官以及吸收冲击的缓冲作用，将营养成分以甘油三酸酯 (Triglyceride)的形态储存在称之为脂肪体(Lipid droplet)的细胞小器官中，需要时作为能量源来使用。但是，随着年龄的增加，皮肤因自然性因素和各种外部刺激而受到损伤， 尤其，真皮中左右弹性的胶原纤维(胶原蛋白)、弹性纤维(弹性蛋白)的活性以及表达降低，从而弹性降低的同时皮下脂肪中的脂肪生成也减少，结果皮肤全面性地无法正常实现各构成细胞的原本的功能。因此，现在广泛使用的方法为脂肪移植手术，它是利用具有郁金香针(tulip needle)形状的尖部不锋利的针的注射器，采集自身的脂肪而移植到看上去弹性降低的皮肤的各个部位的手术。但是，有报告指出，在脂肪移植手术以后，移植体积的 40 60%重新被吸收到体内，皮肤薄且皮下脂肪少的部位上进行的脂肪移植手术中被指出存在能够摸到细胞块等问题，且实际上移植的脂肪的生存率和生存时间无法达到预期而发生需要再次进行移植的情形。
因此，对能够代替存在这些问题的脂肪移植手术且能够增加足够的皮下脂肪层的组合物的要求提高。另外，由于皮肤的基本结构由皮下脂肪组织来维持，且这些皮下脂肪组织起到左右皮肤的体积和强度的作用，因此与以往使用的给皮肤外围层的真皮或表皮赋予弹性的方法相比，增加脂肪组织的体积的方法反而会对维持皮肤的饱满感(兽晉咎)起到更好的效果。因此，为了维持以及增进皮肤的饱满感，期待开发出能够增加脂肪组织的体积的组合物。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种能够使可增加脂肪组织的脂肪来源干细胞的干细胞性增进，并且能够增加皮肤饱满感的组合物。为实现上述目的，本发明提供一种作为有效成分而含有由甘氨酸-脯氨酸-羟基脯氨酸(Gly-Pr0-Hyp)构成的三肽、低分子量透明质酸、矿物质以及维生素的脂肪来源干细胞的干细胞性增进用组合物。另外，本发明提供一种作为有效成分而含有由甘氨酸-脯氨酸-羟基脯氨酸 (Gly-Pro-Hyp)构成的三肽、低分子量透明质酸、矿物质以及维生素的用于增进皮肤饱满感的美容或整形用组合物。另外，本发明提供一种作为有效成分而含有由甘氨酸-脯氨酸-羟基脯氨酸 (Gly-Pro-Hyp)构成的三肽、低分子量透明质酸、矿物质以及维生素的用于增进皮肤饱满感的皮肤外用剂组合物。本发明的组合物中，三肽、低分子量透明质酸、矿物质成分以及维生素等在包围细胞的空间中形成网络而维持并支撑组织的形态，并调节细胞间的信号传递以及细胞的生长和分化，从而增进脂肪来源干细胞的干细胞性，因此对美容或整形为目的的脂肪组织增加有效。因此，本发明的组合物能够增进皮肤饱满感，促进脂肪来源干细胞的再生，恢复损伤的皮下脂肪的功能，从而能够作为用于增进皮肤饱满感的美容或整形用组合物而使用，并且能够作为皮肤外用剂组合物来使用。
图1是表示为了研究本组合物的细胞毒性，对人的脂肪来源干细胞(human adipose derived stem cells,hADSCs)以 0. 0001 10%浓度的本发明的 ECM模拟组合物进行处理，并利用CCK-8试剂盒来确认细胞毒性程度的结果的图表。Iiquiderm表示本发明的实施例1的组合物。图2是为了测定脂肪来源干细胞标记物(盈列口！·约)基因的表达水平，显示了 (拟9、44、73、90、105基因的表达图案变化的图表。Iiquiderm表示本发明的实施例1的组合物。图3为通过流式细胞分析而显示脂肪来源干细胞中表达⑶四、44的细胞数量变化的图。Iiquiderm表示本发明的实施例1的组合物。图4是为了研究本发明的组合物对脂肪来源干细胞的生长因子的表达起到的影响，显示实施了生长因子阵列的结果的图。Iiquiderm表示本发明的实施例1的组合物。
具体实施例方式以下，详细说明本发明。本发明提供一种将由甘氨酸-脯氨酸-羟基脯氨酸(Gly-Pr0-Hyp)构成的三肽、 低分子量透明质酸、矿物质以及维生素作为有效成分而含有的脂肪来源干细胞的干细胞性增进用组合物。上述干细胞性(sternness)是指带有干细胞的自我再生能力和动态平衡，且具有干细胞的活性的状态；干细胞性增进是指维持干细胞性或增加干细胞的活性。本发明的一实施例中，上述组合物为对细胞外基质(extracellular matrix, ECM) 进行模拟而成，与来自动物的ECM不同，是由来自于植物或合成物质构成的ECM模拟组合物。本发明的一实施例中，上述脂肪来源干细胞(Adipose derived stem cell =ADSC) 是人脂肪来源干细胞(human adipose derived stem cells，hADSCs)。本发明的一实施例中，上述组合物使脂肪组织增加而提高皮肤的饱满感。上述组合物促进脂肪来源干细胞分化为脂肪细胞而生成脂肪体(Lipid droplet)。因此，使脂肪组织增加而给特定部位的皮肤提高饱满感。本发明的一实施例中，上述组合物能够增加作为脂肪来源干细胞标记物的分化群 ^(Cluster of Differentiation^ 以下称之为 CD^)、分化群 44(Cluster of Differentiation 44 以下称之为 CD44)、分化群 73 (Cluster of Differentiation 73 以下称之为CD73)、分化群90 (Cluster of Differentiation 90 以下称之为CD90)或分化群105 (Cluster of Differentiation 105 以下称之为CD105)的表达量。与阴性对照组比较，⑶29、⑶44、⑶73、⑶90或⑶105的表达量的增加意味着脂肪来源干细胞的活性的增加。⑶四为整合素β l(integrin beta 1)的别称，是脂肪来源干细胞的标记物，⑶44 通过Wnt信号(signaling)活性而增加脂肪来源干细胞的活性。⑶73是5 ‘-核苷酸酶
-nucleotidase)的别称，是将核苷酸转化为核苷的酶，是脂肪来源干细胞的标记物， ⑶90是Thyl的别称，是干细胞的代表性标记物，⑶105为内皮糖蛋白(Endoglin)的别称， 是TGFb的受体的一部分，是脂肪来源干细胞的标记物。本发明的一实施例中，上述组合物能够使脂肪来源干细胞的生长因子的表达量增力口，具体地，可使干细胞因子(Stem cell factor 以下称之为SCF)的表达量增加。与阴性对照组比较，生长因子的表达量的增加意味着脂肪来源干细胞的活性的增加。本发明的一实施例中，相对于组合物总重量，上述组合物可含有0. 001 3重量％ 的三肽，0. 01 50重量％的低分子量透明质酸，0. 001 3重量％的矿物质以及0. 001 3重量％的维生素。相对于组合物总重量，本发明的三肽未达到0. 001重量％时，其效果甚微；超过3 重量％时，相比含量的增加，其功效增加不大，丧失价格的竞争力。上述三肽(trip印tide)由3个氨基酸，即甘氨酸-脯氨酸-羟基脯氨酸 (Gly-Pro-Hyp)构成，促进胶原蛋白的生成，且分子量低，因此皮肤透过性高。另外，由于上述三肽是通过合成来制备，因此纯度高，且由于不是来自动物的成分，具有不存在病原体感染等安全性问题的优点。将胶原蛋白用酸进行水解时，产生多种断片而难以切断成三肽，而利用酶来进行分解时，对降低分子量具有限度。因此，本发明以氨基酸作为基础采用逆向合成的方式，因此能够获得均质的三肽。本发明的三肽可采用本领域通常的氨基酸合成方法来制备，该方法无特别限定。相对于组合物总重量，本发明的低分子量透明质酸可使用0. 001 50重量％、优选使用0.01 10重量％。上述低分子量透明质酸(hyaluronic acid)比高分子透明质酸易于皮肤吸收，表现出优秀的皮肤保湿、皱纹改善、伤口治愈以及抗炎效果。本发明的低分子量透明质酸可具有500 10000道尔顿的分子量。这是由于，500道尔顿以下的透明质酸难以制备及分离，超过10000道尔顿时难以透过皮肤而无法体现其效果，且粘度增加而稳定性差。上述低分子量透明质酸可采用本领域通常方法来制备，其方法无特别限定。具体例子可以举出如下方法将高分子量的透明质酸低分子化利用高温加热及超声波的方法、 利用酸或碱催化剂的方法、利用过硫酸铵等分解催化剂的方法、或使用透明质酸酶的方法寸。相对于组合物总重量，本发明的矿物质成分以0.001 3重量％的量含有。未满 0. 001重量％时，其效果甚微；超过3重量％时对皮肤的动态平衡有害，因此不优选。上述矿物质可以为选自氯化镁(magnesium chloride)、氯化钙(calcium chloride)、氯化钾(potassium chloride)、氟化镁(Magnesium fluoride)、氟化猛 (Manganese fluoride) >(Manganese sulfate) >(zinc sulfate)、it美 (magnesium sulfate)以及硫酸铜(copper sulfate)中的一种以上，但并非仅限于此。上述氯化镁、氯化钙以及氯化钾会参与表皮分化，氟化镁、氟化锰、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁以及硫酸铜等矿物质成分是细胞动态平衡和皮肤保护中所需的。相对于组合物总重量，本发明的维生素以0.001 3重量％的量含有。未满0.001 重量％时，其效果甚微；超过3重量％时会发生变色、变臭等而阻碍组合物的稳定性。上述维生素可以为选自肌醇、抗坏血酸、泛酸、烟酸、叶酸、硫胺素、核黄素以及其衍生物中的一种以上，但并非仅限于此。本发明的一实施例提供一种作为有效成分而含有由甘氨酸-脯氨酸-羟基脯氨酸 (Gly-Pro-Hyp)构成的三肽、低分子量透明质酸、矿物质以及维生素的用于增进皮肤饱满感的美容或整形用组合物。相对于组合物总重量，上述有效成分可含有0.0001 0. 1重量％、可优选含有 0.0001 0.001重量％。未达到0.0001重量％时，效果甚微；若超过0. 1重量％时，存在显示细胞毒性的问题。上述组合物例如可用于以下目的使用，即通过形成乳房组织而进行的隆胸，微细脂肪移植术、自身脂肪移植术等增进脸部皮肤的饱满感而去除八字型皱纹、眉间皱纹以及维持弹性，但并非仅限于此。上述组合物可根据药学领域的通常方法来制成适于向患者体内给药的单位给药型制剂来进行给药。符合此目的的剂型优选为作为非口服给药剂型的注射剂或局部给药用制剂等。注射用剂型优选为等渗水溶液或悬浊液。但此时能够将通常使用的填充剂、增量齐U、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或塑形剂一同使用。这样制备的本发明的制剂可根据通常的方法经非口服，例如向特定部位直接给药。此时，组合物注入利用注射器来实现。上述组合物的1日给药量为IXIO5到IXIO7细胞/kg体重、优选为5X IO5到5X IO6细胞/kg体重，可分成1次或数次来给药。但是，应理解，有效成分的实际给药量应根据所要分化以及增殖的脂肪细胞的量、给药途径、患者的体重、年龄以及性别等多种相关因素来确定，因此，上述给药量不论是在任何方面上都并非用以对本发明范围进行限定。本发明的一实施例提供一种作为有效成分含有由甘氨酸-脯氨酸-羟基脯氨酸 (Gly-Pro-Hyp)构成的三肽、低分子量透明质酸、矿物质以及维生素的用于增进皮肤饱满感的皮肤外用剂组合物。相对于组合物总重量，上述有效成分可含有0.0001 0. 1重量％、可优选含有 0.0001 0.001重量％。未达到0.0001重量％时，效果甚微；若超过0. 1重量％时，存在显示细胞毒性的问题。上述皮肤外用剂组合物可以为化妆料组合物或药物组合物。上述化妆料组合物的剂型没有特别限制，可按需要适当进行选择。例如制备成柔肤水、营养化妆水、按摩霜、精华、营养霜或面膜等剂型，但并非仅限于此。上述药物组合物可以为洗剂、软膏、凝胶、霜、贴片或喷雾剂等经皮给药型剂型，但并非仅限于此。就根据各剂型的皮肤外用剂组合物而言，除了上述本发明的组合物之外的其它成分可由本领域技术人员根据其它皮肤外用剂的剂型或使用目的等而毫无难度地进行适当选择并进行配比，此时，与其它原料一同使用时可起到协同效果。另外，本发明的组合物作为药物组合物来使用时，可进一步含有防腐剂、稳定剂、 可湿性粉剂或乳化促进剂、用于渗透压调节的盐或缓冲剂等药物辅料以及其它治疗上有效的物质，根据通常的方法以多种口服或非口服给药形态进行剂型化。应理解，有效成分的实际给药量应根据症状的严重度、选择的给药途径、对象的年龄、性别、体重以及健康状态等多种相关因素来决定。通常，有效成分的给药量为0. OOlmg/kg/日到大约2000mg/kg/日的范围。更优选的给药量为0. 5mg/kg/日到2. 5mg/kg/日。根据本发明的增进脂肪来源干细胞的干细胞性的组合物的适用部位包括身体的所有脂肪组织，不限定在特定部位上，例如，可包括脂肪层少的脸部。另外，上述脂肪组织的增加效果有美容或整形目的的脂肪组织增加效果所致的皮肤饱满感增加效果，但并非限定于此。以下，通过下述实施例以及实验例来对本发明进行更具体的说明，但这仅仅是用于例示本发明，本发明的范围不被此限定。[实施例1]以下述表1的组成来制备了模拟细胞外基质(ECM)的组合物。肌醇、抗坏血酸分别作为维生素B、C来使用，烟酰胺作为维生素B3即烟酸的衍生物来使用。硫酸锌、氯化钾、 氯化钙、硫酸镁以及硫酸铜作为矿物质成分来使用。寡聚透明质酸从BI0LAND株式会社购入而使用，三肽从A&PEP株式会社购入而使用。表 权利要求
1.一种脂肪来源干细胞的干细胞性增进用组合物，其中，作为有效成分含有由甘氨酸-脯氨酸-羟基脯氨酸构成的三肽、低分子量透明质酸、矿物质以及维生素。
2.根据权利要求1所述的干细胞性增进用组合物，其中，所述组合物模拟了细胞外基质。
3.根据权利要求1所述的干细胞性增进用组合物，其中，所述脂肪来源干细胞为人脂肪来源干细胞。
4.根据权利要求1所述的干细胞性增进用组合物，其中，所述组合物通过增加脂肪组织而使皮肤增进饱满感。
5.根据权利要求1所述的干细胞性增进用组合物，其中，所述组合物增加作为脂肪来源干细胞标记物的⑶四、⑶44、⑶73、⑶90或⑶105表达量。
6.根据权利要求1所述的干细胞性增进用组合物，其中，所述组合物增加脂肪来源干细胞的生长因子的表达量。
7.根据权利要求6所述的干细胞性增进用组合物，其中，所述生长因子为SCF。
8.根据权利要求1所述的干细胞性增进用组合物，其中，相对于组合物的总重量，所述组合物含有0. 001 3重量％的三肽、0.01 50重量％的低分子量透明质酸、0. 001 3 重量％的矿物质以及0. 001 3重量％的维生素。
9.根据权利要求1所述的干细胞性增进用组合物，其中，低分子量透明质酸具有500 10000道尔顿的分子量。
10.根据权利要求1所述的干细胞性增进用组合物，其中，所述矿物质为选自氯化镁、 氯化钙、氯化钾、氟化镁、氟化锰、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁以及硫酸铜中的一种以上。
11.根据权利要求1所述的干细胞性增进用组合物，其中，所述维生素为选自肌醇、抗坏血酸、泛酸、烟酸、叶酸、硫胺素、核黄素以及其衍生物中的一种以上。
12.一种用于增进皮肤饱满感的皮肤美容或整形用组合物，其中，作为有效成分含有由甘氨酸-脯氨酸-羟基脯氨酸构成的三肽、低分子量透明质酸、矿物质以及维生素。
13.根据权利要求12所述的用于增进皮肤饱满感的美容或整形用组合物，其中，相对于组合物总重量，含有0. 0001 10重量％的所述有效成分。
14.一种用于增进皮肤饱满感的皮肤外用剂组合物，其中，作为有效成分含有由甘氨酸-脯氨酸-羟基脯氨酸构成的三肽、低分子量透明质酸、矿物质以及维生素。
15.根据权利要求14所述的用于增进皮肤饱满感的皮肤外用剂组合物，其中，相对于组合物总重量，含有0. 0001 10重量％的所述有效成分。
全文摘要
本发明提供一种作为有效成分而含有由甘氨酸-脯氨酸-羟基脯氨酸(Gly-Pro-Hyp)构成的三肽、低分子量透明质酸、矿物质以及维生素的脂肪来源干细胞的干细胞性增进用组合物。本发明的组合物由于增进脂肪来源干细胞的干细胞性，由此对美容或整形为目的的脂肪组织的增加有用。因此，本发明的组合物能够增进皮肤饱满感，促进脂肪来源干细胞的再生，并恢复损伤的皮下脂肪的功能，因此能够作为用于增进皮肤饱满感的美容或整形用组合物而使用，并且能够作为皮肤外用剂组合物来使用。
文档编号A61K33/34GK102475636SQ201110385108
公开日2012年5月30日 申请日期2011年11月28日 优先权日2010年11月30日
发明者卢旻秀, 李泰龙, 沈重铉, 沈钟沅, 申东旭, 金汉坤, 金知贤, 闵大珍 申请人:株式会社爱茉莉太平洋