专利名称：培养和增殖脂肪组织来源的干细胞的方法
发明的领域本发明涉及脂肪组织衍生的干细胞，特别是涉及一种在细胞未分化条件下以较高的增殖速率培养成人脂肪组织衍生的干细胞的方法。
发明的背景机体对细胞和组织的损伤有着巨大的修补和恢复能力，不仅可以恢复细胞和组织的结构，而且还可在不同程度上恢复其功能。。一般说来，这些修复过程都是通过局部未受损组织细胞的分裂和增殖来完成的。目前临床上广泛采用的组织修复方法包括自体组织移植、异体组织移植和使用天然或化学合成的组织替代物。其中自体组织移植虽然避免了免疫排斥反应，但一般都要损伤人体自身的正常组织；而异体移植则可导致免疫排斥，并存在供体来源有限和论理问题。使用人工组织替代物同样也存在异物排斥问题，并且有造成感染的危险。
随着再生医学的建立和发展，科学家们已经有可能应用细胞工程和组织工程技术，基于基质网架、相应的组织细胞和生长因子三个基本要素，模拟机体组织器官的天然条件和发育生物学规律，掺入活细胞、天然细胞成分、细胞合成产物及细胞内和细胞间调节物质等，人工构建例如软骨、骨、肌腱、肌肉、皮肤、血液、心瓣膜及血管等不同的生物组织和器官。再生医学包括组织器官形态再生和功能再生两个方面。一般说来，人们总是期望再生的组织不仅能够从形态学上修复或替代受到损伤的局部细胞或组织，同时更希望能够恢复和补偿受损伤细胞或组织的生理功能。
近年来，随着分子生物学技术和临床医学的不断进步，基因治疗这一医疗方法已引起了越来越多的医学研究与临床工作者的关注和积极参与。目前，已出现了许多将转移或修饰遗传材料的技术与细胞工程或组织工程技术相结合，用于修复或补偿局部组织或器官的遗传缺陷或功能缺失(或低下)的研究报导(如参见美国专利6,077,981、6,103,230、6,264,941等)。然而，这些技术非常复杂，所需成本很高，目前仍处于早期实验室研究阶段。
为了有效地修补和恢复局部受损伤细胞的正常形态与功能，除了目前尚存在大量的技术问题有待解决和选择使用即有良好的组织相容性，又能极好地模拟体内环境的细胞外基质(ECM)外，顺利地取得并培养移植后持续保留其固有形态与功能的种子细胞，仍是细胞工程和组织工程领域内一个亟待解决的问题。
近年来，由于不受人类伦理观念的影响而且没有免疫学排斥问题，所以使用骨髓干细胞再造各种中胚层起源的组织的研究已取得了很大进展。人骨髓是由胚胎的中胚层演化来的，主要由造血干细胞和基质细胞组成(Paul，SR.，Blood771723，1991)。虽然目前人们对造血干细胞的分裂和分化已有了较多的了解，但有关基质细胞群的研究还有待深入。人和哺乳动物的骨髓基质细胞是包括多种细胞成份的异质细胞群体，其中之一即是能够分化成脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞和成骨细胞等多种细胞成分的多潜能基质干细胞(Caplan，AI.etal.，J.Orthop.Res.9641，1991)。并且提示这些细胞有可能用于软骨、脂肪和骨等组织的修复(参见美国专利5,827,735、5,906,934、5,908,784和6,322,784)以及细胞或组织的遗传修饰(参见美国专利5,591,625)。虽然基质干细胞的研究为组织再生和分化提供了有希望的材料来源，但其应用研究还存在不少的技术问题。首先，这些细胞在骨髓细胞中的含量很低(只占大约1/100,000)，从而增加了获得并分离细胞的难度和成本。另外，传统的骨髓穿刺方法也不可避免地给供体带来某些疼痛和术后不适。再者，这些细胞的采集和培养也比较困难。因此，本领域特别需要进一步提供来源普遍、无须对培养材料进行过多预筛选的多能干细胞来源，以及由之衍生其他体细胞和结缔组织细胞的方法。这样，人们未来就有可能利用组织工程技术，已有可能借助基质网架或无细胞支架，使细胞按照限定的三维空间结构生长和繁殖，以再生整个组织甚至器官。
中国专利申请00807461号公开了衍生于人脂肪组织的干细胞(ADSC)和网架(结缔组织干细胞)及其克隆群体。该专利申请进一步涉及通过扩充和培养所说的干细胞以产生有用的生物学活性物质和条件培养基的方法，以及由之产生分化的组织和结构的方法。其中所用的培养基是含血清的F12培养基和标准培养基的混合物。在此现有技术基础上，如果能够进一步改善未分化干细胞的培养基和培养条件，将会在一定程度上改善衍生于成人脂肪组织的多潜能干细胞的增殖和扩充速度以及细胞活力，为所说的干细胞的进一步定向分化和其在组织工程或基因治疗中的应用提供必要的细胞准备。
发明的目的本发明的一个目的是提供一种培养和增殖衍生于人脂肪组织的多潜能干细胞的方法，该方法包括(1)提供从3-18岁少年健康人体采集的脂肪组织干细胞并常规培养以制备条件培养基；(2)提供由人成年个体脂肪组织分离并纯化的干细胞；(3)于未分化条件下，在步骤(1)得到的条件培养基中传代培养步骤(2)得到的干细胞以进一步纯化之；(4)分离步骤(3)得到的干细胞并于适当的培养条件下在细胞形态分化培养基中培养所说的干细胞以促使其定向分化。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的少年人和成人可以是同一或不同个体。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的脂肪组织是通过吸脂手术得到的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的条件培养基是在普通DMEM培养基中传代培养少年儿童脂肪组织衍生的干细胞后得到的。
发明的详细内容本发明涉及脂肪组织来源的干细胞，更具体地说，本发明涉及一种在细胞未分化条件下以较高的增殖速率培养成人脂肪组织衍生的干细胞的方法，特征在于所说的干细胞是在含有血清的条件培养基中维持并增殖的，其中所说的条件培养基是经培养婴幼儿脂肪组织衍生的干细胞得到的。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的方法包括以下步骤(1)提供从3-18岁少年健康人体采集的脂肪组织干细胞并常规培养以制备条件培养基；(2)提供由人成年个体脂肪组织分离并纯化的干细胞；(3)于未分化条件下，在步骤(1)得到的条件培养基中传代培养步骤(2)得到的干细胞以进一步纯化并之；(4)分离步骤(3)得到的干细胞并于适当的培养条件下在细胞形态分化培养基中培养所说的干细胞以促使其定向分化。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的少年人和成人可以是同一或不同个体。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的脂肪组织是通过吸脂手术得到的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的条件培养基是在普通DMEM培养基中传代培养少年儿童脂肪组织衍生的干细胞后得到的。
为了得到ADSC，一种优选的材料来源是人吸脂手术得到的吸出物。在保证细胞存活的前提下无菌收集所说的吸出物后，首先用含胶元酶(10-40μg/ml)的等渗磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗组织以除去残余的游离脂质和血液。然后可用搅拌和/或用酶(例如胰蛋白酶或胶元蛋白酶)水解方法解离组织，以从脂肪结缔组织基质中释放出游离的脂肪细胞。由于成熟脂肪细胞的BUOYANT密度较低，所以通常浮在等渗缓冲溶液的上层；ADSC将沉淀到溶液下层；而中间层则包括结缔组织基质和脂肪细胞聚集体。可以使用平衡密度离心等方法很容易地分离得到富含脂肪细胞群体的部分(下层)，并使用荧光活化的细胞筛分、水或去污剂洗涤、过滤和有机溶剂提取等方法浓缩去除了脂肪细胞的结缔组织基质部分。
可以利用红细胞的渗透敏感性，以在高张盐溶液中保温等方法破坏并除去残留的红血细胞。这一过程和洗涤(例如使用PBS)步骤可以反复进行数次，以使ADSC提取物达到相当的纯度。然后，可根据细胞大小和形态，使用密度梯度离心和细胞分选装置将悬浮的ADSC与其他细胞分离开。作为可供选择的分子方法，也可以根据干细胞具有较长的端粒和较高的端粒酶活性这一特征，从已分化细胞中分离出干细胞。上述这些操作都是在严格无菌和保证细胞存活性的条件下进行的。
可以按照基本上相似的方法，由少年儿童或成人皮下脂肪组织中分离、提取并纯化ADSC细胞。
可将如上制备的ADSC直接用于在特定培养基中的定向分化培养。然而，通常从成人脂肪组织中分离并纯化的ADSC细胞的收率均相对较低，而且有时纯度不够，从而限制了细胞的使用。因此，为了进一步得到定向形态和功能发生、发育的细胞，确保ADSC的在治疗(特别是基因治疗)、组织结构重建和美容等方面的应用，通常有必要对如上得到的多潜能或多谱系ADSC细胞进行进一步的体外培养和增殖。
基于ADSC的生物学特性，可以在标准的细胞增殖培养基例如添加有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养所说的干细胞，并在细胞没有分化并且保留多潜能的条件下传代5-15次，以利于ADSC的进一步纯化和克隆形成。然而，使用常规培养基常常会因为细胞传代次数较多而导致细胞形态和/或功能的退化与逐渐衰减。另一方面，即使传代次数较少，干细胞在常规培养基中的扩充和增殖的速率以及活力也是有限的。推测原因，可能是由于常规培养基缺少某些天然存在的、脂肪干细胞生长所必需的因子为此，本发明提供了一种改良的培养成人脂肪组织来源的干细胞的方法，该方法包括(1)提供从3-18岁少年健康人体采集的脂肪组织干细胞并常规培养以制备条件培养基；(2)提供由人成年个体脂肪组织分离并纯化的干细胞；
(3)于未分化条件下，在步骤(1)得到的条件培养基中传代培养步骤(2)得到的干细胞以进一步纯化并之；(4)分离步骤(3)得到的干细胞并于适当的培养条件下在细胞形态分化培养基中培养所说的干细胞以促使其定向分化。
根据本发明的优选实施方案，可基本上按照如前所述的方法，使用小型吸脂泵以低强度从健康少年儿童的腹部皮下抽吸脂肪组织，然后分离、提取并纯化富含干细胞的细胞群体。将细胞纯化到足够的程度后，在含有10-15％胎牛血清的DMEM培养基中常规培养所说的细胞。培养后，分别收集并在液氮环境下冷冻保存干细胞和同时收集的条件培养基。一般情况下，这些细胞和培养基均可保存大约30年。
同时可基本上按照如前所述的方法，使用吸脂泵从成人被试者的腹部皮下抽吸脂肪组织，然后分离、提取并纯化富含干细胞的细胞群体。将细胞纯化到足够的程度后，在至少含有部分所说的条件培养基中细胞增殖培养基中，以常规克隆增殖方法培养成人脂肪组织来源的干细胞。其中，所说的条件培养基的总细胞增殖培养基中的含量约占5/4至1/5体积，并且细胞铺板所采用的细胞密度一般为100-10000个/cm2。为了得到纯化干细胞的单克隆，一般在培养板的每个孔中接种不超过1个细胞。经如此的4-8次传代培养和筛选后，足可以得到完全纯的单克隆ADSC细胞群体。特别是，按照本发明的方法，使用培养来源于少年儿童体内的ADSC所得到的新鲜或冻存的条件培养基，可使成人来源的ADSC的增殖数目以及细胞活力均得到明显的提高或改善。我们的比较实验证明，与常规细胞增殖培养基(例如含有10％胎牛血清的DMEM培养基)相比，使用按本发明方法得到的培养基可使ADSC的增殖数目增加约30％(参见实施例1)。
得到纯化的ADSC克隆后，可以在超低温条件下(例如在液氮中)长期冷冻保存这些细胞，或者直接将它们用于定向分化培养，以得到具有所需的发育表型的成熟细胞。一般说来，用于促使干细胞定向发育的培养基可含有适当浓度的皮质类固醇激素、胰岛素、3′，5′-环磷酸腺苷、细胞生长因子及牛血清。但根据细胞发育表型的不同，所用培养基的组成可能是完全不同的。例如，在为了证实按本发明方法纯化并扩增得到的单克隆ADSC的定向表型分化能力的实验中，我们分别使用含有10-8M地塞米松、5μM胰岛素、0.1mM咖啡因的DMEM培养基，和含有25μM氢化可的松、5μM胰岛素15％胎牛血清的DMEM培养基培养ADSC细胞，结果按已公开的方法(参见中国专利申请00807461号)证实，培养15天后我们的ADSC细胞分别分化成了成脂肪细胞和成肌细胞(参见实施例2)。
实施例实施例1人脂肪组织来源的干细胞群的传代培养用10mM磷酸盐缓冲溶液反复冲洗吸脂手术得到的吸出物，然后加入浓度约0。5％的胰蛋白酶，搅拌下37℃处理30分钟。消化后，离心收集细胞沉淀物，并将沉淀悬浮于1％盐水中。缓慢搅拌15分钟后，再次离心收集细胞。如此反复处理两次，以尽可能地破碎并除去污染的红细胞。去除上层漂浮物并从细胞悬液中收集下层细胞沉淀物，然后使用溴酚兰染料排除法检测细胞的存活性并计数活细胞数。
存活细胞在含15％胎牛血清的基本培养基中37℃保温24小时后，收集贴壁生长的细胞进行形态学观察光学显微镜(40X)下可见这些细胞为相对较小的有核细胞，并可见细胞内有发亮脂质小滴。油红0染色显示，大部分细胞呈阴性。因此，可将这些细胞提取物初步鉴定为富含ADSC的部分。
按所述相似方法制备得自某16岁少年自愿者皮下脂肪组织的富ADSC部分，常规培养这些细胞并常规制备用于本发明的条件培养基。
然后，将如上分离的细胞分成两份，并分别按每平皿4×105个细胞的密度接种于直径10cm的平皿中，所使用的培养基则分别是含10％胎牛血清的普通DMEM培养基(A对照组)，和DMEM培养基与如上制备的条件培养基的1∶1(V/V)混合物(B实验组)。接种后，在含5％ CO2的空气环境下37℃培养细胞。培养期间，每隔24小时分别取样(10μl)检查细胞形态和活力，并计数活细胞数。培养第24小时，镜下可见实验组(A)的细胞形态完好，并且平均细胞数明显多于对照组(B)。第4天，可见有细胞克隆形成，其中实验组的平均克隆数为23个，而对照组的平均克隆数为16个。
传代(10次)增殖培养后，挑选形态良好的细胞克隆并将它们再克隆到24孔培养板中，使用上述条件培养基继续培养至形成细胞成单层。解离单层并收集游离的细胞，然后在分化培养基中进行干细胞定向分化培养(参见下列实施例2)。
实施例2传代培养并纯化的ADSC的定向表型分化分别使用含有10-8M地塞米松、5μM胰岛素、0.1mM咖啡因的DMEM培养基(1)，和含有25μM氢化可的松、5μM胰岛素15％胎牛血清的DMEM培养基(2)，以每孔500个细胞的密度在24孔培养板中继续培养(37℃，5％ CO2)实施例1中得到的ADSC细胞。
培养15天后，在培养基(1)中培养的3个细胞克隆呈油红0染色阳性，表明细胞内有脂质小泡存在。根据这一特征可判定这3个克隆化的已出现向成熟脂肪细胞分化的趋势。其中以在常规细胞生长培养基中培养的未分化细胞作为阴性对照。同样，在上述定性诱导培养基中培养15天后，将荧光标记的抗人骨骼肌肌球蛋白抗体与在培养基(2)中培养的细胞一起保温，可见细胞有明显的阳性荧光染色，表明这些培养的干细胞(两个克隆)已表达了有肌球蛋白并出现向肌细胞分化的趋势。其中使用正常人骨骼肌细胞作为阴性对照。
权利要求
1.一种培养和增殖衍生于人脂肪组织的多潜能干细胞的方法，该方法包括(1)提供从3-18岁少年健康人体采集的脂肪组织干细胞并常规培养以制备条件培养基；(2)提供由人成年个体脂肪组织分离并纯化的干细胞；(3)于未分化条件下，在步骤(1)得到的条件培养基中传代培养步骤(2)得到的干细胞以进一步纯化并之；(4)分离步骤(3)得到的干细胞并于适当的培养条件下在细胞形态分化培养基中培养所说的干细胞以促使其定向分化。
2.根据权利要求1的方法，其中所说的少年和成人可以是同一或不同个体。
3.根据权利要求1的方法，其中所说的脂肪组织是通过吸脂手术得到的。
4.根据权利要求1的方法，其中所说的条件培养基是在普通DMEM培养基中传代培养少年儿童脂肪组织衍生的干细胞后得到的。
全文摘要
本发明涉及脂肪组织衍生的干细胞，特别是涉及一种在细胞未分化条件下以较高的增殖速率培养成人脂肪组织衍生的干细胞的方法。
文档编号C12N5/02GK1597936SQ0314684
公开日2005年3月23日 申请日期2003年9月17日 优先权日2003年9月17日
发明者周新宇, 程钢, 何蕴韶 申请人:中山大学达安基因股份有限公司