使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法

专利名称：使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法
使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法本申请是申请日为2005年5月25日，申请号为200580050265. 1，发明名称为“使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法”的中国专利申请的分案申请。相关申请本申请是2004年2月20日提交发明名称为《使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法》的美国申请No. 10/783,957 (其要求2003年2月20日提交发明名称为《使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法》的美国临时申请No. 60/449，279和2003年4月15日提交发明名称为《使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法》的美国临时申请No. 60/462,911的优先权)的部分继续申请，以及2004年6月25日提交发明名称为《从组织分离和浓缩再生细胞的系统和方法》的美国申请No. 10/877, 822 (其要求2003年8月20日提交发明名称为《从组织分离再生细胞的系统和方法》的美国临时申请No. 60/496，467和2003年提交发明名称为《从组织分离再生细胞的系统和方法》的美国临时申请No. 60/482, 820的优先权)的部分继续申请，其中美国申请No. 10/783,957和美 国申请No. 10/877，822都是2002年12月9日提交发明名称为《使用处理过的脂肪抽出物(Iipoaspirate)细胞治疗患者的系统和方法》的美国申请No. 10/316, 127 (其要求2001年12月7日提交的美国临时申请No. 60/338，856的权利)的部分继续申请。这里明确地引入所有前述申请的内容作为参考。
背景技术：
I.发明领域本发明整体上涉及来源于脂肪组织的再生细胞，更具体地，涉及脂肪(adipose)来源的再生细胞(例如脂肪来源的干细胞和祖细胞)，脂肪来源的再生细胞的使用方法，含有脂肪来源的再生细胞的组合物，以及制备和使用脂肪来源的再生细胞的系统，所述脂肪来源的再生细胞被用于治疗心血管疾病和紊乱。2.相关技术的描述心血管疾病和紊乱是所有的工业化国家中死亡和丧失劳动能力的首要原因。仅在美国，心血管疾病占死亡率的大约40%，并侵袭5800万美国人(美国心脏协会，2002 )。造成心血管疾病尤其具有破坏性的主要因素之一是心脏在受损之后不能够自身修复。因为心肌细胞不能够分裂并重新占据受损区域，由于损伤或者疾病导致的心脏细胞损失很大程度上是不可逆转的(Abbate 等人,2002 ；Remme, 2000)。在可以利用的治疗形式中，人与人之间的心脏移植已经成为治疗严重心血管疾病和紊乱中最有效的。事实上，目前普通心脏移植受体的一年和五年生存率超过了 70%。然而，不幸的是，由于许多原因，移植是非常受限的治疗形式，所述原因即缺乏适宜的供体、该方法的费用以及很可能产生移植物排斥和相关问题如感染、肾功能异常以及免疫抑制剂相关癌症(美国心脏协会，2002 )。移植治疗的备选方案是使用再生药物修复和再生受损的心肌细胞。再生药物以临床革G向的方式控制干细胞的能力(即身体未特化的主细胞(mastercell))以自身无限地地更新并发育成成熟的特化细胞。在发育早期的胚胎、胎儿组织以及某些成年器官和组织中发现干细胞(Pera等人，2000)。已知胚胎干细胞(下文中称作“ESC”)会变成身体的所有细胞和组织类型。ESC不仅含有个体的全部遗传信息，还含有变成身体200+细胞和组织中任何一种的新生能力。因此，这些细胞具有作为再生药物的巨大潜力。例如ESC能够发育成特定组织如心、肺或肾，然后它们能够被用于修复受损和患病的器官(Assady等人，2001 ；Jacobson等人，2001 ;0dorico等人，2001 )。然而，ESC来源的组织具有临床局限性。因为，ESC必须来自另一个个体，即胚胎，所以存在受体的免疫系统排斥新的生物材料的风险。尽管可以利用防止这些排斥的免疫抑制药物，但已知这些药物也会阻断期望的免疫应答，如针对细菌感染和病毒的免疫应答。此外，对于ESC的来源(即胚胎)的伦理上的辩论是由来已久的，可能是可预见的将来不可克服的障碍。成年干细胞(下面可互换地被称作“ASC”)代表使用ESC的备选方案。ASC静止地存在于许多非胚胎组织中，可能等待对外伤或其他破坏性疾病 进程作出应答，从而它们能够治疗受伤的组织(Arvidsson 等人，2002 ；Bonner-ffeir 和 Sharma, 2002 ；Clarke 和 Frisen,2001 ;Crosby和Strain, 2001 ;Jiang等人,2002a)。值得注意的是,不断出现的科学证据显示每个个体都携带ASC库，其与ESC都具有变成许多(如果不是全部)细胞和组织类型的能力(Young 等人，2001 ；Jiang 等人，2002a ；Jiang 等人，2002b ；Schwartz 等人，2002)。因此，ASC像ESC —样具有再生药物的临床应用的巨大潜力。已经表明ASC群体存在于骨髓、皮肤、肌肉、肝和脑的一种或多种中(Jiang等人，2002b ；Alison, 1998 ；Crosby Strain，2001 )。然而，这些组织中ASC的出现率很低。例如，估计骨髓中间充质干细胞的出现率为100，000个有核细胞中有I个至1，000, 000个有核细胞中I个之间(D，Ippolito等人，1999 ；Banfi等人,2001 ；Falla等人，1993)。类似地，从皮肤提取ASC包括数周内的一系列复杂的细胞培养步骤(Toma等人，2001)并且骨骼肌来源的ASC的临床应用需要两到三周的培养期(Hagege等人，2003)。从而，来自这些组织的ASC的所有的设计的临床应用需要通过细胞纯化和细胞培养方法增加细胞数、纯度和成熟度。尽管细胞培养步骤可以提供增加的细胞数、纯度和成熟度，但是需要付出代价。该代价可以包括下面的技术困难中的一个或多个由于细胞老化丧失细胞功能、可能有用的非干细胞群体的损失、细胞可能应用于患者的延迟、金钱花费增加，以及培养期间细胞受到环境微生物污染的危险增加。最近检查骨髓来源的ASC的治疗效果的研究使用基本上完整的骨髓以克服与细胞培养有关的问题(Horwitz等人，2001 ；Orlic等人，2001 ;Stamm等人，2003 ；Strauer等人，2002 )。然而，临床益处是次最佳的，并且结果几乎无疑与有限的ASC剂量和骨髓中内在可利用的纯度有关。最近，已经证明脂肪组织是ASC的来源之一(Zuk等人，2001 ;Zuk等人，2002)。与骨髓、皮肤、肌肉、肝和脑不同，脂肪组织相当容易以相对大的量收获(Commons等人，2001 ；Katz等人，2001b)。此外，已经表明脂肪来源的ASC具有在体外产生多种组织，包括骨髓、月旨肪、软骨和肌肉的能力(Asbjian等人,2003 ；Mizuno等人,2002 ；Zuk等人,2001 ；Zuk等人，2002)。从而，脂肪组织提供了用于再生药物中ASC的最佳来源。然而，本领域中缺少收获脂肪来源的ASC的适宜方法。现有方法具有许多缺点。例如，现有方法不能最佳地容纳用于除去脂肪组织的吸出装置。现有方法还缺少从脂肪组织收获期到组织加工期的部分或完全自动化(Katz等人，2001a)。现有方法还缺少大于IOOml脂肪组织的体积容量。现有方法还缺少从脂肪组织收获期到组织加工期的部分或全部密闭系统。最后，现有方法缺少组分处理能力以减小一个样品与另一个样品的物质的交叉污染的伴随危险。总之，用于从脂肪组织收获ASC的现有技术方法没有克服与从上述皮肤、肌肉、肝脏和脑收获ASC相关的技术困难。因此，考虑到ASC的巨大的治疗潜力，本领域中迫切需要从产生ASC群体的脂肪组织以高产率、一致性和/或纯度收获ASC并且快速而可靠地收获并且减小或者不存在(nonexistent)对提取后操作的需要的装置、细胞或者方法。理想地，这种装置、系统或者方法将以适于直接置于受体的方式产生ASC。这种装置、系统或方法的获得以及使用脂肪来源的ASC治疗心血管疾病和紊乱的方法和组合物将对这些紊乱的治疗产生根本变化。考虑到心血管疾病的普遍和当前治疗选择的不足，迫切需要这种治疗。

发明内容
本发明涉及可以用于治疗心血管病症、疾病和紊乱的再生细胞例如成年干细胞和祖细胞。本发明还涉及用于从如脂肪组织的组织分离和浓缩再生细胞的系统和方法。本发 明还涉及用于心血管相关治疗应用的再生细胞组合物。因此，在常规的实施方式中，本发明针对使用来源于组织的再生细胞的组合物、方法和系统，所述细胞与促进、产生或者支持治疗心血管相关益处所需的添加剂一起直接置于受体中。在具体的实施方式中，本发明的再生细胞可以被用于治疗心血管病症、疾病和紊乱，其基于例如再生细胞的合成和分泌刺激新血管形成的生长因子的能力，再生细胞的合成和分泌刺激细胞存活、增殖和/或改变其他细胞损伤应答的生长因子的能力，再生细胞的增殖和/或分化成直接参与新血管形成的细胞的能力，再生细胞的移入到受损心肌层并改变疤痕形成(胶原蛋白的沉积、胶原蛋白的分解和交联)的能力，再生细胞的增殖并分化成能够有助于心肌收缩的心肌细胞(cardiomyocyte)或心肌细胞样肌细胞(cardiomyocyte-like muscle cell)的能力，再生细胞的增殖并分化成心肌细胞(myocardial cell)的能力，再生细胞改善灌注并再生受损心肌(myocardium)的能力，再生细胞防止心肌梗死之后肥大(重建)进展的能力。对心脏病患者给药的再生细胞可以包括例如干细胞、祖细胞及其组合。在某些实施方式中，可以需要给药多剂量和/或多类型的再生细胞以产生治疗益处。另外，可以与再生细胞同时给药例如一种或者多种生长因子的添加剂。在优选的实施方式中，再生细胞被与血管生成生长因子、动脉生成生长因子和/或心脏特异性生长因子单独或与其他添加剂的组合进行给药。所述再生细胞也可以与一种或者多种免疫抑制药物进行给药。再生细胞的给药途径是本领域已知的，并且包括直接将细胞给药到期望有利的位置。这可以通过下列达到经心脏的外表面(心外膜)直接注射到心肌，经过插入适当的插管通过内表面(心内膜)直接注射入心肌，通过动脉或静脉输注(包括逆行流动机制)，或者通过这里所公开或本领域中已知的其他方式例如心包注射。本领域中技术人员已知的给药途径包括但不限于静脉内、冠状动脉内、心内膜心肌、心肌外膜、心室内、逆行冠状窦或静脉内给药。在为患者给药前，再生细胞可以在细胞培养中进行生长以例如促进其朝着心脏表型分化。在为患者给药前，可以通过基因转移对细胞进行修饰，这样改变了在被修饰的再生细胞中一种或者多种基因例如心脏基因的表达。
本发明还涉及高度通用的系统和方法，其能够从给定的组织分离和浓缩适合再被输注到受试者的再生细胞，例如干细胞和祖细胞。在优选的实施方式中，该系统是自动化的。通常本发明的系统包括一个或者多个采集腔室(chamber)、处理腔室、废物腔室、输出腔室和样品腔室。不同的腔室通过一个或者多个导管连接到一起，使得包含生物材料的流体可以在闭合的、无菌的流体/组织通道内从一个腔室通到另一个腔室。在某些实施方式中，废物腔室、输出腔室和样本腔室是可选的。在一个实施方式中，从组织提取经过处理和将设备置入受体内的全部程序，会都在相同的装置中进行，事实上，即使在患者的同一房间内也可以进行该程序。因此，在一个实施方式中，治疗患者中心血管相关紊乱的方法包括下列步骤a)提供组织移除系统山)使用组织移除系统从患者移出脂肪组织，脂肪组织具有一定浓度的再生细胞；c)处理至少一部分脂肪组织以获得一定浓度的再生细胞，该浓度与处理前的脂肪组织中再生细胞的浓度不同；以及d)将再生细胞给药给患者，不需要在对病人进行给药前从组织移除系统移除再生细胞。这里所描述的任何特征或者特征的组合都包括在本发明的范围内，只要在任何这 样的组合中包括的特征没有与通过上下文，本说明书和本领域技术人员的知识显而易见的特征互相不符合。本发明的附加优点和方面在接下来的详细描述中变得明显。


图I示出了用于从组织分离并且浓缩再生细胞的系统，该系统包括一个过滤器组件；图2示出了与图I相似的系统，该系统具有多个串联构造的过滤器组件；图3示出了与图I相似的系统，该系统具有多个并联构造的过滤器组件；图4示出了用于从组织分离并且浓缩再生细胞的系统，该系统包括离心分离腔室;图5为包括用于从组织分离并且浓缩再生细胞的系统中使用的前置过滤器的采集腔室的截面图；图6为使用渗滤过滤系统、从组织分离并且浓缩再生细胞的系统的处理腔室的截面图；图7为用于分离和浓缩再生细胞的系统的处理腔室的截面图，其利用离心分离设备来浓缩再生细胞；图8为图7的处理腔室的另一张截面图；图9. I、图9. 2和图9. 3示出了与本发明的系统一起使用的淘析部件；图10示出了用于从组织分离并且浓缩再生细胞的系统，其利用真空压力来使流体运动通过系统。通过将真空泵或真空源施加到系统的出口，控制在预先确定的速率来拉动组织和流体通过，使用旋阀、排出口和夹具的系统来控制流动的方向和定时来构造真空系统；图11示出了用于从组织分离并且浓缩再生细胞的系统，其利用正压力来使流体运动通过系统。正压力系统使用诸如蠕动泵的机械装置来推动或推进流体和组织以预先确定的速率通过系统，使用阀(valve)、旋阀(stopcock)、排出口和夹具来控制流动的方向和定时；图12A示出了过滤过程，其中流入的流体流与过滤器的孔成切向流动；图12B示出了过滤过程，其中流体的流入流垂直于过滤器的孔流动；图13示出了用于本发明的系统的示例性的一次性的用具；图14示出了用于本发明的系统的示例性的可重复使用的部件；图15A示出了使用图13的一次性用具和图14的可重复使用的部件装配的本发明的示例性设备；图15B为示出了示例性的预编程步骤的流程图，其通过软件程序执行，该软件程序控制本发明的系统的自动化实施例。示出了两组可替换的处理参数，以表示该系统的通用性；
图16A和图16B描绘了培养的脂肪来源的干细胞的VEGF (5A)和PIGF (5B)蛋白质的表达；图17描绘了脂肪来源的干细胞群内内皮祖细胞的检测；图18A和图18B描绘了正常(7A)和链唑霉素处理的(7B)小鼠脉管结构的体外发育；图19描绘了与阴性对照比较，脂肪来源的干细胞处理的后肢局部缺血小鼠中血流的平均恢复的增加；图20A和图20B表明增加脂肪来源的干细胞剂量提高移植存活和血管生成(20A)并描绘了组织样品中脂肪组织构造的保持(20B );图21描绘了梗死的心肌区域中来自供体的脂肪来源的干细胞移植的组织学时间线(timeline)；图22描绘了半乳糖苷酶和肌球蛋白重链的双阳性染色。高亮细胞都显示出蓝色的半乳糖苷酶染色，表明它们来源于供体脂肪组织细胞，褐色染色表明心肌蛋白肌球蛋白重链的表达。显示出褐色和蓝色染色的细胞(如通过箭头指出)是呈现出心肌细胞表型的脂肪组织来源的细胞；图23描绘了大鼠中阻塞/再灌注损伤后梗死的心肌区域中来自供体的脂肪来源的干细胞群；图24描绘基于回声和收缩性分析，与盐水相比，接受脂肪来源的再生细胞治疗的大鼠在心肌梗死后12周显著改善的喷血分数；图25描绘基于回声和收缩性分析，与盐水相比，接受脂肪来源的再生细胞治疗的大鼠在心肌梗死后12周显著改善的基线收缩；图26描绘基于回声和收缩性分析，与盐水相比，接受脂肪来源的再生细胞治疗的大鼠在心肌梗死后12周显著改善的基线舒张；图27描绘与盐水相比，接受脂肪来源的再生细胞治疗的大鼠在心肌梗死后12周重建参数方面的改变，即降低的心室隔膜(septal)厚度；图28描绘与盐水相比，在接受ADC治疗的大鼠心肌梗死后12周，以降低心室隔膜厚度(心脏收缩)作为证据的防止心室扩张进程；图29和图30表示与盐水相比，在接受脂肪来源的再生细胞治疗的大鼠心肌梗死后12周，以在心脏舒张(图29)和心脏收缩(图30)中都降低后壁(posterior wall)厚度为证据的防止心室扩张进程；图31描绘在细胞灌注组猪与对照组猪相比，左心室射血分数的显著提高细胞灌注组(3. 0%±6· 0%，平均值土SD)对比对照组(-9. 0%±5· 0%，p=0. 01)。通过血管显像术的LVEF (n=12)表示相似的趋势，其值为分别3. 7%±5· 0%对-2. 0%±7· 5% (p=0. 16)。发明的详细描述本发明提供了使用脂肪来源的再生细胞例如干细胞和祖细胞治疗心血管病症、疾病和紊乱的系统和方法。具体地，本发明阐明本发明的脂肪来源的再生细胞(I)表达血管生成和动脉生成生长因子，包括PIGF、VEGF, bFGF、IGF-II、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin), G-CSF, GM-CSF, IL_12p40/p70、IL_12p70、IL-13、IL-6、IL-9、瘦素(L印tin)、MCP-U M-CSF、MIG、PF-4、TIMP-U ΜΡ-2、TNF-α 和血小板生成素(Thrombopoetin)，(2)含有在血管形成中具有明确功能的内皮祖细胞(EPC)，(3)在体外发育成血管，以及(4)支持体内局部缺血组织生存，(5)诱导后肢的阻塞/再灌注损伤后的恢复灌注(restoreperfusion), (6)当心脏损伤后注射到动物时归巢到心脏，(7)当心脏损伤后注射到动物时 分化成细胞，所述细胞表达与它们分化成心肌细胞或心肌细胞样细胞相一致的标记，(8)改善小鼠后肢局部缺血外科模型中心肌梗死后的灌注，O)防止重建的进展以及(10)改善心肌梗死的小动物和大动物模型中的功能。因此，本公开阐明本发明脂肪来源的再生细胞可用于治疗心血管疾病和紊乱。为了更易理解本发明，首先定义某些术语。其他定义在详细描述中给出。在这里使用的，“再生细胞”指的是使用本发明的系统和方法获得的任何异源的或同源的细胞，其导致或帮助完全或部分再生、恢复或代替器官、组织或生理单元或系统的结构或功能，以由此提供治疗、结构或美容的益处。再生细胞的例子包括成人干细胞(ASC)、内皮细胞、内皮前体细胞、内皮祖细胞、巨噬细胞、纤维原细胞、周皮细胞、平滑肌细胞、前脂肪细胞(preadipocyte)、分化或去分化的脂肪细胞、角化细胞、单能的和多能的祖细胞和前体细胞(和其后代)以及淋巴细胞、中性粒细胞、组织细胞(histiocyte)(组织巨噬细胞)、淋巴系统相关细胞、神经元、神经元前体细胞和施旺细胞(Schwann cell)。再生细胞可以提供治疗、结构或美容的益处的一种机制是通过将它们自身或它们的后代掺入新生成的、现有的或修补的组织或组织成分。例如ASC和/或它们的后代可以掺入新生成的骨、肌肉、或其它结构或功能组织并且由此导致或有助于治疗、结构或美容的改善。相似地，内皮细胞或内皮前体或祖细胞和它们的后代可以掺入现有的、新生成的、修补的或扩张的血管以由此导致或有助于治疗、结构或美容的益处。再生细胞通可以提供治疗、结构或美容的益处的另一种机制是通过表达和/或分泌分子例如生长因子，其促进给定组织或组织成分的结构或功能的形成、保持、恢复和/或再生。例如再生细胞可以表达和/或分泌分子，其导致增强的组织或细胞生长，其随后直接或间接地参与改善的结构或功能。再生细胞可以表达和/或分泌生长因子，包括例如血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PIGF)、bFGF、IGF-II、嗜酸性粒细胞趋化蛋白(Eotaxin), G-CSF, GM-CSF, IL_12p40/p70、IL_12p70、IL-13, IL-6, IL-9、瘦素(L印tin)、MCP-1、M-CSF、MIG、PF-4、 ΜΡ-1、HMP_2、TNF-a、血栓形成素(Thrombopoetin)和它们的同等型，其可以执行一种或多种下面的功能剌激新血管发育，即促进血管生成；通过扩张先存的小血管(旁系血管)的血液运载容量来改善它们的供氧；诱导再生细胞从远离损伤位点的地点迁移，以由此增强将这样的细胞归巢并且迁移到损伤地点；剌激生长和/或促进细胞在损伤位点内的生存，由此促进功能或结构的保持；输送具有抗凋亡性质的分子，由此降低细胞死亡和功能永久丧失的比率或可能性；以及与内源的再生细胞和/或其它生理机制互相作用。再生细胞可以以它们的“天然”形式使用，如存在于组织中或使用本发明的系统和方法从组织分离并且浓缩，或者如在这里进一步描述的，可以通过用生长因子或其它生物应答调节剂来刺激或启动，通过基因转移(瞬时的或稳定转移)，通过对所得到的群体的亚分级分离基于物理性质(例如尺寸或密度)、对 固相材料不同的吸附力、细胞表面或细胞内分子的表达、细胞培养或其它体外或体内操纵、修饰或分级分离，对再生细胞进行修饰。再生细胞也可以与其它细胞或设备结合使用，诸如合成的或生物的骨架、材料或设备，其输送修饰或增强细胞的有关的特性的因子、药物、化学物质或其它制剂如这里进一步描述的。在这里使用的，“再生细胞组合物”指的是组织，例如脂肪组织被清洗并且至少部分分解以后通常存在于一定体积的液体内的细胞组合物。例如，本发明的再生细胞组合物包括多种不同类型的再生细胞包括ASC、内皮细胞、内皮前体细胞、内皮祖细胞、巨噬细胞、纤维原细胞、周皮细胞、平滑肌细胞、前脂肪细胞、分化或去分化的脂肪细胞、角化细胞、单能的和多能的祖细胞和前体细胞(和其后代)和淋巴细胞。再生细胞组合物还可以包含一种或多种污染物，诸如可以存在于组织片段中的胶原蛋白，或在这里描述的组织分解过程中所采用或者从该过程中所产生的残余胶原酶或其它酶或制剂。在这里所使用的“再生药物”是指来自直接或者间接将再生细胞置入受试者内所得到的治疗、结构或者美容的益处。在这里所使用的短语“心血管病症、疾病和紊乱”为了包括特征为不足、不希望或者异常的心脏功能的所有紊乱，例如局部缺血性心脏病、高血压心脏病和肺部高血压心脏病、瓣膜疾病、先天性心脏病、中毒性或传染性心肌症和导致受试者尤其人类受试者中例如充血性心力衰竭的心力衰竭。不足或异常的心脏功能可以由疾病、损伤和/或老化导致。作为背景，对心肌损伤的应答按照确定的途径，其中一些细胞死亡而其他细胞进入休眠状态(hibernation)，它们还没有死亡但是功能异常。接着，炎症细胞的渗入、胶原作为疤痕部分沉积，所有这些都与新血管内不生长和一定程度的持续细胞死亡平行发生。这里所用的术语“局部缺血”指由于血流减少和/或氧和/或其他营养物供应的减少，而引起的任何局部组织缺血(例如局部组织缺血或者全面组织缺血例如休克时)。术语“心肌局部缺血”指冠状动脉粥样硬化和/或心肌的供血、氧和/或营养物不足导致的循环紊乱。术语“心肌梗死”是指由于缺少血液流动而导致的心肌组织的缺血损伤。特别地，这种损伤来自于冠状循环中的阻塞(例如，血栓形成或栓塞)事件并产生这样的环境，心肌代谢需要量超过对心肌组织的供氧和/或营养物的供给。这里所用的术语“血管生成”指从现有的脉管系统和组织产生新血管的过程(Folkman, 1995)。术语“修复”指被损伤脉管系统的再形成(reformation)。组织局部缺血的减轻大大依赖于血管生成。新血管的自发生长提供了局部缺血区域内和周围的侧枝循环，提高了血流，并减轻了局部缺血导致的症状。这里所用的术语“血管生成因子”或者“血管生成蛋白质”指能够从现有脉管系统生长新血管(“血管生成”)的任何已知的蛋白质、肽或者其他试剂。用于本发明适宜的血管生成因子包括但不限于胎盘生长因子(Luttun等人，2002)、巨噬细胞集落刺激因子(Aharinejad等人，1995)、粒细胞巨噬细胞集落剌激因子(Buschmann 等人，2003)、血管内皮生长因子(VEGF) -A, VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E (Mints等人,2002)、神经纤毛蛋白(neuropilin) (Wang等人,2003)、成纤维细胞生长因子(FGF) -I、FGF-2 (bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6 (Botta 等人，2000)、血管生成素(angiopoietin) I、血管生成素2 (Sundberg等人，2002)、红细胞生成素(Ribatti等人，2003)、BMP-2，BMP-4、BMP-7 (Carano 和 Filvaroff，2003),TGF- β (Xiong 等人，2002)、IGF-I (Shigematsu等人，1999)、骨桥蛋白(Asou等人，2001 )、多效营养因子(Beecken等人，2000)、活化素(Lamouille 等人，2002)、内皮素-I (Bagnato 和 Spinella，2003)和它们的组合。血管生成因子可以独立地或者相互组合地作用。当组合时，血管生成因子可以协同起作用，从而因子的组合效果大于单独采取各自因子效果的总和。术语“血管生成因子”或者“血管生成蛋白”还包括这些因子的功能类似物。功能类似物包括例如，因子的功能部分。功能类似物还包括抗独特型抗体，其结合所述因子的受体，从而模拟所述因子的活性以促进血管生成和/或组织修复。产生这些抗独特型抗体的方法是本领域中熟知的并且在例如TO97/23510中被描述，这里将W097/23510的内容完整并入本文作为参考。用于本发明的血管生成因子可以从任何适宜的来源生产或者得到。例如，所述因子可以从它们的天然来源纯化、或者合成产生或者重组表达产生。所述因子可以作为蛋白 质组合物为患者进行给药。备选地，所述因子可以以编码该因子的表达质粒的形式给药。适宜的表达质粒的构建是本领域中熟知的。用于构建表达质粒的适宜的载体包括例如，腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、RNA载体、脂质体、阳离子脂质体、慢病毒载体和转位子。这里所用的术语“动脉生成”指增强侧枝动脉和/或来自现有小动脉连接的其他动脉的生长的过程(CarmeIiet, 2000 ;SchoIz等人,2001 ;SchoIz等人,2002)。更具体地,动脉生成是通过来自现有小动脉连接的内皮和平滑肌细胞的增殖原位募集和扩增动脉，从而为局部缺血组织、肿瘤或者炎症部位提供血液。这些血管大部分生长在受影响的组织外部并且对于将营养物向局部缺血区域、肿瘤或者炎症部位的传输是重要的。动脉生成是对心肌局部缺血的正常应答的一部分(Mills等人，2000 ；Monteiro等人，2003)。此外，冠状动脉旁路移植(CABG)的常规手术技术实际上不过是产生动脉侧枝血管(Sergeant等人，1997)。从而，梗死后增强血管生成的方法是提高到达局部缺血组织的血流，导致细胞死亡减少和梗死尺寸减小。这些提高将导致改善的心脏功能和治疗益处。在这里使用的，“干细胞”指的是多能的再生细胞，其能够分化为多种其它细胞类型，其执行一个或多个特定的功能并且具有自我更新的能力。在这里公开的干细胞的一些可以为多能的。在这里使用的，“祖细胞”指的是多能的再生细胞，其能够分化为多种细胞类型并且具有限制的或不具有自我更新的能力。在这里使用的，“祖细胞”还指的是能够分化为仅单一的细胞类型的单能细胞，其执行一个或多个特定的功能并且具有限制的或不具有自我更新的能力。特别地，在这里使用的，“内皮祖细胞”指的是能够分化为脉管内皮细胞的多能或单能的细胞。在这里使用的，“前体细胞”指的是能够分化为一种细胞类型的单能再生细胞。前体细胞和它们的后代可以保持大量增殖的能力，例如，淋巴细胞和内皮细胞，其能够在适合的条件下增殖。
在这里使用的，“干细胞数量”或“干细胞出现率”指的是在克隆源性检定中观察到的集群的数量，在克隆源性检定中，脂肪来源的细胞(ADC)以低细胞密度(〈10000细胞/孔)平铺并且在支持MSC生长的生长培养基(例如，补充有10%的胎牛血清、5%的马血清和抗细菌/抗真菌剂的DMEM/F12培养基)内生长。细胞生长两个星期，随后培养物通过苏木精着色，并且多于50个细胞的集群计算为CFU-F，干细胞出现率计算为每100个平铺的有核细胞观察到的CFU-F的数量(例如在初始具有1000个有核再生细胞的盘中计数到15个集群给出的干细胞出现率为1.5%)。干细胞的数量计算为干细胞出现率乘以获得的有核ADC细胞的总数量。从再生细胞生长的高百分比( 100%)的CFU-F表达细胞表面分子⑶105，其还通过源自骨髓的干细胞表达(Barry等人，1999)。⑶105也通过脂肪来源组织的干细胞表达(Zuk 等人，2002)。在这里使用的，术语“脂肪组织”指的是脂肪，包括存储脂肪的结缔组织。脂肪组织包含多种再生细胞类型，包括ASC和内皮祖细胞和前体细胞。在这里使用的，术语“脂肪组织单元”指的是分离的或可测量的脂肪组织的量。可 以通过确定单元的重量和/或体积来测量脂肪组织单元。基于上面确定的数据，当从患者体内移除时，处理过的脂肪抽出物单元具有细胞成分，其中至少O. 1%的细胞成分为干细胞；即，如上所述确定的其干细胞出现率为至少O. 1%。参考这里所公开的，脂肪组织单元可以指的是从患者移除的全部的量的脂肪组织，或者小于从患者移除的全部的量的脂肪组织。从而，脂肪组织单元可以与另一个脂肪组织单元，结合以形成重量或体积为单独的单元的和的脂肪组织单元。在这里使用的，术语“部分”指的是小于全部的材料的量。较小的部分指的是小于50%的量，并且较大的部分指的是大于50%的量。从而，小于从患者移除的脂肪组织的全部量的脂肪组织单元为移除的脂肪组织的一部分。在这里使用的，术语“处理过的脂肪抽出物”指的是已经被处理以从成熟的脂肪细胞和结缔组织分离活性的细胞成分(例如，包含再生的成分)的脂肪组织。此部分在这里指的是“脂肪来源的细胞”或“ADC”。通常，ADC指的是通过清洗并且从脂肪组织分离并且浓缩细胞获得的再生细胞小团。该小团通常通过离心分离细胞的悬浮液，使得细胞聚集在离心分离腔室或细胞浓缩器的底部来获得。在这里使用的，术语“给药”、“递送”、“输送”、“放置”和“移植”在这里可互换地使用并且指的是通过导致再生细胞至少部分定位在希望的地点的方法或路线，将本发明的再生细胞放置到受试者体内。再生细胞可以通过任何适合的路线给药，其导致输送到受试者体内希望的位置，在该处细胞或细胞成分的至少一部分保持能够生存。在给药到受试者以后细胞能生存的时期可能短到数个小时如24小时，到数天，到长达数年。在这里使用的，术语“治疗”包括减小或减轻疾病或病症的至少一种有害影响或症状。在这里使用的，“治疗有效剂量的再生细胞”指的是一定量的再生细胞，其足够引起有益的或希望的临床效果。所述剂量可以是单次或多次给药。然而，精确地确定被认为是有效的剂量的量可以基于每个患者的独特因素，包括但不限于患者的年龄、尺寸(size)、疾病类型或程度、疾病的阶段、再生细胞的给药途径、所使用补充治疗的类型或程度、正在进行的疾病过程和希望的治疗类型(例如，主动的或者常规的治疗)。
在这里使用的，术语“受试者”包括温血动物，优选为哺乳动物，包括人类，在优选的实施方式中，受试者为灵长类动物。在更优选的实施方式中，受试者为人类。如之前在这里阐明的，再生细胞例如干细胞和祖细胞，可以从多种组织获取。本发明的系统可以用于全部这样的组织。然而，脂肪组织是特别充足的再生细胞来源。因此，在这里示出的本发明的系统使用脂肪组织作为再生细胞源，这仅是作为示例而不是限制性的。可以通过任何本领域中的普通技术人员已知的方法获得脂肪组织。例如，可以通过吸脂(注射器或动力辅助的)或通过脂肪切除术，例如抽吸辅助的脂肪成形术、超声辅助的脂肪成形术和切除的脂肪切除术或它们的组合，来从患者移除脂肪组织。移除脂肪组织并采集，并且可以根据在这里描述的本发明的系统的任何实施方式进行处理。采集的组织的量取决于许多因素，包括指供体的身体质量指数和年龄，可用于采集的时间，可到达的脂肪组织获取地点的可用性，伴随的和预先存在的药物和状态(诸如抗凝血疗法)，以及采集组织的临床目的。例如，从瘦的个体取出的100毫升脂肪组织的再生细胞百分率大于从肥胖的指献者取出的100毫升脂肪组织的再生细胞百分率(表I)。这可能反映肥胖的个体中， 增加的脂肪含量的稀释效率。因此，根据本发明的一个方面，与瘦的患者比较，希望从超重的供体获得更大量的组织。此观察结果还指示本发明的使用不限于具有大量脂肪组织的个体。表I :身体质量指数对组织和细胞产量的影响
身体质量指数状态 I所获得组织的量(克)I总的再生细胞产量(Xio7)
正常641 + 1422. 1 + 0.4
月巴月半I, 225 士 1732. 4 + 0. 5
P 值00306在脂肪组织被处理以后，所得到的再生细胞基本上没有成熟的脂肪细胞和结缔组织。例如，所得到的再生细胞可以基本上没有胶原和细胞外基质组合物，但可以含有出现在结缔组织的成纤维细胞。因此，本发明的系统产生多种异源的脂肪来源的再生细胞，其可以用于研究和/或治疗目的。在优选的实施方式中，细胞适合用于放置或重新注入受体的身体内，在其它实施方式中，这些细胞可以用于研究，例如，这些细胞可以用于建立干细胞或祖细胞系，其可以长时期生存并且用于进一步的研究。现在将详细地参考本发明的当前优选的实施方式，其实施例在附图中示出。可能的话，在附图和描述中使用的相同或相似的参考数字指的是相同或相似的部分。需要注意，附图为简化的形式而不是比例精确的。参考这里所公开的，仅为了方便和清晰，相对于附图使用诸如顶部、底部、左、右、上、下、上面、之上、下面、之下、后、前、远端和近端的方向术语。这样的方向术语不应该解释为以任何方式限制本发明的范围。虽然这里的所公开的指的是某些说明的实施方式，应该理解这些实施方式是通过实施例提出并且不是限制性的。虽然讨论的是示例性的实施方式，下面详细描述的目的应该解释为覆盖属于通过后附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内的实施方式的所有修饰、替代物和等价物。本发明可以与本领域中通常使用的各种医疗过程结合使用。现在参考附图，本发明的系统10通常包括一个或多个组织采集腔室20、处理腔室30、废物腔室40、输出腔室50和样品腔室60。不同的腔室通过一个或多个导管12连接到一起，使得包含生物材料的流体可以从一个腔室通到另一个腔室，同时保持闭合无菌的流体/组织通道。导管可以包括刚性或柔性的主体，在这里可互换地分别指管腔和管道。在某些实施方式中，导管的形式为柔性的管道，诸如临床设施中通常使用的聚乙烯管道、硅树脂管道或本领域中已知的任何其它材料。导管12的尺寸可以根据需要流体通道还是组织通道而变化。导管12的尺寸还可以根据循环通过系统的组织或流体的量而变化。例如，对于流体通道，导管的直径在大约O. 060英寸 大约O. 075英寸的范围内，而对于组织通道，导管的直径在O. 312英寸、.750英寸的范围内。通常，选择导管的尺寸以平衡导管能够容纳的体积和传送组织或流体通过所述导管所需要的时间。在系统的自动化实施方式中，前述参数，即体积和传送时间，必须被识别，以使得适合的信号可以传输到系统的处理设备。这使得设备将准确体积的液体和组织从一个腔室运动到另一个腔室。所使用柔性的管道应该能够承受负压以减小塌陷的可能。所使用柔性的管道还应该能够承受通过例如可以用于系统 中的正排量泵产生的正压。系统的全部腔室可以包括一个或多个口，例如，出口 22或入口 21，其接受标准IV、注射器和抽吸管道连接器。这些口可以为密封的口，诸如用橡胶隔片关闭的注射器针进入口 51。入口可以通过导管连接到一个或多个插管(cannulas)(未示出)。例如，组织入口21可以连接到整体单一使用的吸脂插管，并且导管可以为柔性管道。导管通常定位为提供从系统一个腔室到另一个腔室的流体通道。为此，导管和口可以连接到例如可以手动或自动操作的抽吸设备(未示出)。该抽吸设备可以为例如，注射器或电泵。抽吸设备应该能够提供足够的负压以从患者抽出组织。通常，可以使用本领域中的普通技术人员，例如外科医生已知的任何适合的抽吸设备。导管12还可以包括一个或多个夹具(未示出)以控制材料在系统的不同部件之间流动。通过有效地密封系统的不同区域，夹具可以用于保持系统无菌。替代地，导管12可以包括控制材料流动通过系统的一个或多个阀14。在图中，阀14标识为空心圆(opencircle)。在优选的实施方式中，阀可以为机电夹紧式胶管阀。在另一个实施方式中，阀可以为气动阀。在另一个实施方式中，阀可以为液压阀或机械阀。这样的阀优选为通过可以连接到杠杆的控制系统触发。可以手动操纵杠杆使其被触发。在自动化的实施方式中，控制系统可以连接到杠杆以及连接到处理设备，其可以在预先确定的触发条件触发阀。在某些自动化的实施方式中，阀的触发可以是部分自动并且部分根据使用者的偏好，使得过程可以被优化。在其它的实施方式中，某些阀可以手动触发，同时另一些阀通过处理设备自动地触发。阀14还可以与一个或多个泵，例如蠕动泵34或正排量泵(未示出)结合使用。导管12和/或阀14还可以包括传感器29，例如，光学传感器、超声传感器、压力传感器或本领域已知能够分辨流过系统的不同流体成分和流体水平的其它形式的监控器。在优选的实施方式中，传感器29可以为光学传感器。系统还可以包括多个过滤器36。在某些实施方式中，过滤器可以在系统的腔室28内。系统内的不同腔室可以包括不同的过滤器，过滤器有效地从不期望的细胞和可以根据本系统使用的分解剂中分离再生细胞例如干细胞和/或祖细胞。在一个实施方式中，过滤器组件36包括空心纤维过滤设备。在另一个实施方式中，过滤器组件36包括渗滤(percolative)过滤设备,其可以与或可以不与沉淀过程一起使用。在另一个实施方式中，过滤器组件36包括离心设备，其可以与或可以不与淘析设备和过程一起使用。在另外一个实施方式中，该系统包括这些过滤设备的结合。本发明的过滤功能可以为双重的，一些过滤器从诸如胶原蛋白、游离的脂质、游离的脂肪细胞和残余的胶原酶的最终浓缩物移除物质，其它过滤器用于浓缩最终产品。该系统的过滤器可以包括多个孔，孔的直径和/或长度从20微米 800微米。在优选的实施方式中，采集腔室20具有前置过滤器28，前置过滤器28具有多个80微米 400微米的孔。在另一个优选的实施方式中，采集腔室20具有前置过滤器28，前置过滤器28具有多个265微米的孔。在其它实施方式中，过滤器可以为可拆的和/或一次性的。系统还可以包括一个或多个温度控制设备(未示出)，其定位为调节包含在系统的一个或多个腔室内材料的温度。温度控制设备可以为加热器、冷却器或二者都有，即可以能够在加热器和冷却器之间转换。温度设备可以调节通过系统的任何材料的温度，包括组织、 分解剂、重悬浮剂、漂洗剂、清洗剂或添加剂。例如，加热脂肪组织促进分解，而冷却再生细胞输出对保持生存能力是需要的。而且，如果需要预热的试剂以优化组织处理，则温度设备的任务为保持预先确定的温度而不是增加或降低该温度。为了保持闭合无菌的流体/组织通道，全部口和阀可以包括保持系统的密封构造的封闭装置。封闭装置可以为不能渗透流体、空气和其它污染物的膜，或者其可以为本领域中已知的任何其它适合的封闭装置。此外，系统的全部口可以设计为使得它们可以容纳注射器、针或其它用于在不会危害系统的无菌性的情况下抽出腔室内的材料的设备。如在这里阐明的，可以通过任何本领域中公认的方法从患者取出组织。抽吸的组织可以在放置在系统内用于处理之前取出。抽吸的组织通常经由密封的入口，诸如用橡胶隔片关闭的注射器针入口(未在采集腔室上示出)，通过导管12传输到采集腔室20。替代地，组织取出步骤可以为系统的一部分。例如，采集腔室20可以包括真空管线11，其促进使用插入患者的标准插管来移除组织。从而，在此实施例中，整个系统接附到患者。可以经由为闭合的无菌通道的一部分的诸如12a的导管，通过入口 21将组织引入采集腔室20。采集腔室20可以包括多个柔性的或刚性的罐或圆筒或它们的组合。例如，采集腔室20可以包括一个或多个不同尺寸的刚性罐。采集腔室20还可以包括一个或多个柔性的袋。在这样的系统中，袋优选为提供有支撑件，诸如内部或外部的框，其帮助减小袋在抽吸作用下塌陷的可能。采集腔室20的尺寸为保持需要量的盐水，以在处理腔室30内执行过程的清洗和浓缩阶段之前，适当地清洗和分解组织。优选地，可以容易地用肉眼确定存在于采集腔室20内的组织或流体的体积。例如，为了从脂肪组织获得再生细胞，适合的采集腔室具有保持800毫升脂肪抽出物和1200毫升盐水的容量。因此，在一个实施方式中，采集腔室20具有至少2升的容量。在另一个实施方式中，为了从血液分离并且浓缩红细胞，采集腔室20具有至少I. 5升的容量。通常，采集腔室20的尺寸将根据从患者采集的组织的类型和量变化。采集腔室20的尺寸为保持最小大约5毫升到大约2升组织。对于较小的组织体积，例如，5毫升到100毫升，在传输到采集腔室20之前可以将组织收集在注射器内。采集腔室20可以使用任何能够被杀菌的生物相容的适合的材料制造。在优选的实施方式中，采集腔室20用一次性材料制造，该材料符合在ISO10993标准中描述的用于血管内接触的生物相容性要求。例如，可以使用聚碳酸酯丙烯酸树脂或ABS。采集腔室20的流体通道优选为无热原的，即，适用于血液用途，没有传输疾病的危险。在一个实施方式中，采集腔室20由允许使用者用视觉确定存在于腔室内的组织的大致体积的材料制造。在其它实施方式中，采集腔室20内的组织和/或流 体的体积通过自动传感器29确定。采集腔室20优选地设计为使得在自动化的实施方式中，系统能够以合理的精确度确定腔室内的组织和/或流体的体积。在优选的实施方式中，系统以正负百分之十五的精确度感测采集腔室内的体积。在仅作为示例提供的特定实施方式中，采集腔室20为刚性腔室的形式，例如，由医用聚碳酸酯制造的腔室，包含由网格尺寸为265微米(参看图5)的医用聚酯制造的大致为圆锥形的前置过滤器28。刚性的组织采集容器的尺寸可以为大约8英寸高并且直径大约为5英寸；壁厚可以为大约O. 125英寸。圆筒的内部可以通过以下口进入例如，一个或多个用于抽吸管道的口，一个或多个具有用于通过无菌对接技术连接的管道的口，和/或一个或多个用于针通过橡胶隔片刺穿进入的口。采集腔室20内部的前置过滤器28优选构造为例如在从患者移除组织时，保留脂肪组织并且让非脂肪组织通过。更特定地，在开始获取脂肪组织期间或者在另一个实施方式中在开始获取脂肪组织以后，过滤器28可以允许游离的脂质、血液和盐水通过，而保留脂肪组织的片段。因此，过滤器28包括多个相同或不同尺寸的孔，孔的尺寸在20微米 5毫米的范围内。在优选的实施方式中，过滤器28包括多个400微米的孔。在优选的实施方式中，过滤器28为厚度大约200微米、孔尺寸为大约265微米并且开孔面积为大约47%的医用聚酯网。此材料在漂洗过程中保留组织但是随着组织分解允许细胞通过该网。从而，当组织从患者体内抽出时，可以从脂肪组织分离非脂肪组织。可以用不同的材料、网格尺寸和孔的数量和类型实现相同的功能。例如，小于100微米或数千微米大的网格孔尺寸可以实现相同的目的，即在保留脂肪聚集体和片段的同时允许盐水和血细胞通过。相似地，可以使用替代的刚性塑料材料，或者通过本领域中的普通技术人员所知道的许多其它修饰实现相同的目的。系统10也可以包括一个或多个溶液源22。溶液源可以包括清洗溶液源23，以及组织分解剂源24，诸如胶原酶。采集腔室20包括允许以无菌的方式将清洗和分解溶液或制剂添加到组织的闭合的流体通道。用于清洗溶液23和分解剂24的容器可以为任何适合的容器，其能够以无茵的方式保持它们的内容物，例如，可折叠收缩的袋，诸如用于临床设施中的IV袋。这些容器可以具有导管12，诸如导管12e，其连接到采集腔室20，使得清洗溶液和分解剂能够输送到采集腔室20内部。清洗溶液和分解剂可以通过任何本领域认可的方式输送到采集腔室20内部，包括施加到用于盐水23和/或分解剂24的容器外部的简单的重力压力，或者通过在例如图4所示导管12d的导管上放置正排量泵。在自动化的实施方式中，系统的处理设备基于使用者初始输入的信息(例如，处理的组织的体积)来计算不同的参数，例如，盐水的体积和清洗需妥的时间或循环的数量，以及分解剂的浓度或量和分解需要的时间。替代地，量、时间等参数可以由使用者手动操纵。采集腔室内的组织和/或流体应该保持在30 V到40 V的温度范围内。在优选的实施方式中，采集腔室内的悬浮液的温度保持在37 °C。在某些实施方式中，如果外科手术过程或治疗应用需要延迟，可以将选择的组织存储在采集腔室内稍后使用。组织可以存储在室温或大约室温或者存储在大约4°C达到96小时。清洗溶液可以为本领域中的普通技术人员已知的任何溶液,包括盐水或任何其它含缓冲剂或不含缓冲剂的电解质溶液。处理的组织类型将指示使用的清洗溶液的类型或组合。通常，清洗溶液，诸如盐水，在已经从患者移除脂肪组织并且将脂肪组织放置到采集腔室内以后进入采集腔室20。然而，清洗溶液可以在取出脂肪组织以前输送到采集容器20，或者可以与脂肪组织同时输送到采集腔室20。在采集腔室20中，清洗溶液和取出的脂肪组织可以通过包括下述方法的任何方法混合。例如，该组织可以通过搅动清洗(其最大化细胞生存能力并且最小化输送的游离的脂质的量)。在一个实施方式中，经由通过不同度的弧(例如，通过大约45度到大约90度的孤)以不同的速度，例如大约每分钟30转，旋转整个采集腔室20来搅动组织。在其它实施方式中，经由通过不同度的孤(例如，通过大约45度到大约90度的弧)以不同的速度，例如大约每分钟30转，旋转整个采集腔室20来搅动组织，其中采集腔室20包括一个或多个刚性接附到采集腔室内表面的桨或突出物。上述采集腔室20的旋转可以通过接附到或接 近采集腔室20的驱动机构实现。驱动机构可以为简单的传动带或齿轮或本领域已知的其它驱动机构。旋转的速度可以为例如每分钟30转。通常，发现较高速度产生较大量游离的脂质，因此不是最佳的。在其它实施方式中，通过将可旋转的轴25放置在采集腔室20内部来搅动组织，其中，可旋转的轴包括一个或多个刚性接附到可旋转的轴25的桨25a或突出物，在旋转轴时，桨25a或突出物通过混合物。在某些实施方式中，具有刚性接附的桨25a的可旋转的轴25可以靠在采集腔室20的底部上。这可以，例如，通过将桨状设备放置到旋转磁场内实现(例如，磁力搅拌器)。替代地，可以使用本领域中已知的简单的搅拌器，即，执行上下摇动而不旋转的设备来实现。也可以使用本领域认可的任何其它方法来清洗组织，包括摇摆、摇动、倒转等等。在需要的数量的清洗循环以后，可以将组织分解剂输送到采集腔室20，以从剩下的脂肪组织成分分离再生细胞。分解剂可以为本领域中的普通技术人员已知的任何分解齐U。可以使用的分解剂包括中性蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、Blendzyme酶混合物族成员，例如LiberaseHl、胃蛋白酶、超声或其它物理能量、激光、微波、其它机械设备和/或它们的组合。本发明优选的分解剂为胶原酶。分解剂可以与其它溶液一起添加。例如，盐水，诸如从上述盐水源23输送的盐水，可以与胶原酶同时添加或者紧接着之后添加到脂肪组织。在一个实施方式中，清洗的脂肪组织在37°C或在37°C左右与包含胶原酶的酶溶液混合大约2(Γ60分钟。在其它实施方式中，可以添加更高浓度的胶原酶或相似制剂以减小消化时间。清洗的脂肪组织和组织分解剂可以随后以与上述搅动方法相似的方式搅动，直到清洗的脂肪组织分解。例如，可以经由通过大约90度的弧旋转整个采集腔室，通过具有包含一个或多个桨的轴，该桨在轴旋转时通过溶液和/或通过旋转整个采集腔室，在该采集腔室的内表面上包含桨或突出物，来搅动清洗的脂肪组织和组织分解剂。根据脂肪来源的细胞的使用目的，脂肪组织可以部分分解或完全分解。例如，在脂肪来源的细胞要与脂肪组织单元结合的实施方式中，需要部分分解获取的脂肪组织，移除部分分解的脂肪组织的一部分，并且随后继续分解剩余在采集腔室中的脂肪组织的剩余部分。替代地，在任何消化以前，可以移除一部分清洗的脂肪组织并且将其搁置在样品容器内。在另一个实施方式中，获取的脂肪组织被部分地分解以在被重新引入回到患者体内以前浓缩细胞。在一个实施方式中，脂肪组织与组织分解剂混合通常小于大约20分钟的一段时间。随后从采集腔室移除部分地分解的组织的一部分，并且可以通过将脂肪组织与组织分解剂再混合40分钟来进一步分解剩余的部分地分解的组织。当脂肪来源的细胞要用作基本上纯的再生细胞群体时，脂肪组织可以被完全分解。消化以后，允许组织和分解剂溶液沉淀一段足够的时间，以允许溶液能漂浮的部分和不能漂浮的部分在采集腔室内区分。通常，时间在大约15秒到数分钟的范围内，但是在修饰的实施例中，也可以使用其它时间。能漂浮的层包括需要进一步清洗和浓缩的再生细胞。不能漂浮的层包括血液、胶原蛋白、脂质和组织的其它非再生细胞成分。不能漂浮的层必须被移除到废物腔室。因此，采集腔室20优选为包括在腔室的最下面的位置的出口 22，使得血液和组织的其它不能漂浮的部分可以通过一个或多个导管12排出到一个或多个废物容器400采集腔室20通常处于(或者可以放置在)直立的位置，使得出口 22定位在采集腔室的底部。排 出可以为被动的或主动的。例如，上述不能漂浮的成分可以使用重力、通过施加正或负压力、通过使用泵34或通过使用排出口 32排出。在自动化的实施方式中，处理设备可以发信号通知某些阀和/或泵以从采集腔室20排出不能漂浮的层。自动化的实施方式也可以包括传感器29，其能够探测能飘浮的和不能漂浮的液体之间何时达到分界面。自动化的实施方式也可以包括传感器29，例如，光学传感器，其可以能够探测直通采集腔室的导管内流动的流出物的光折射的变化，光折射的适当变化可以标志输出导管内存在能漂浮的层，其指示不能漂浮的层已经被排出。传感器29能够随后发信号通知处理设备继续下一个步骤。然而，在某些实施方式中，组织可以被处理以取回组织的非再生细胞成分。例如，在某些治疗的或研究的应用中，可能需要胶原质、蛋白质、基质或基质的成分、脂质、脂肪细胞或组织的其它成分。在这样的实施方式中，包括再生细胞的能漂浮的层必须如上述般被移除到废物腔室。不能漂浮的层随后保留在系统中以根据需要用于进一步处理。一旦移除不能漂浮的层，包括再生细胞的能漂浮的层可以被清洗一次或多次以移除残余的污染物。因此，采集腔室20通常包括用于允许清洗溶液被输送到腔室内部的一个或多个口(port) 21，以及用于允许废物和其它材料被引导出采集腔室20的一个或多个口22。例如，采集腔室可以包括一个或多个如在这里描述的密封的进入口。采集腔室20还可以包括一个或多个帽(未示出)，诸如顶部帽和底部帽，以进一步确保在清洗溶液被输送到采集腔室内和/或废物被传送出采集腔室的同时系统保持无菌。口 21可以提供在采集腔室的帽上或者在采集腔室的侧壁上。可以重复使用新的清洗溶液的清洗过程，直到溶液内的不能漂的污染物的残余量达到预先确定的水平。换句话说，采集腔室20内剩余的材料，其包括上述混合物的能漂浮的材料，包括脂肪组织片段，可以被额外清洗一次或多次，直到不需要的材料的量减小到需要的预先确定的水平。一种确定清洗的终点的方法为测量组织溶液内红细胞的量。这能够通过测量在540纳米波长吸收光来实现。在优选的实施方式中，认为大约O. 546 大约O. 842之间的范围是可以接受的。在清洗和/或分解期间，一种或多种添加剂可以根据需要添加到不同的容器以增强结果。一些添加剂的例子包括优化清洗和分解的制剂、增强处理期间活性的细胞群体的生存能力的添加剂、抗微生物剂(例如抗生素)、溶解脂肪细胞和/或红细胞的添加剂、或富集所期望细胞群体的添加剂(通过有差别地粘附到回相部分或另外促进细胞群体的相当大的减少或者富集)。其它可能的添加剂包括那些促进再生细胞恢复和生存能力的添加剂(例如，半脱氨酸蛋白酶抑制剂)或那些减小注入或安置中的有害反应的可能性的添加剂(例如，细胞或结缔组织再次分解的抑制剂)。在足够的沉淀时间以后，所得到的清洗的脂肪组织片段和脂肪分解剂的混合物的不能漂浮的部份将包含再生细胞，例如，干细胞和其它脂肪来源的祖细胞。如在这里讨论的，包含再生细胞的不能漂浮的部份将被传输到处理腔室30，其中，所关心的再生细胞，诸如脂肪来源的干细胞，将从存在于混合物的不能漂浮的部份中的其它细胞和材料分离。在这里，不能漂浮的部份指的是再生细胞组合物并且包括多种不同类型的细胞，包括干细胞、祖细胞、内皮前体细胞、脂肪细胞和其它在这里描述的再生细胞。再生细胞组合物还可以包含一种或多种污染物，诸如存在于脂肪组织片段中的胶原蛋白和其它结缔组织蛋白质和其片段，或来自组织分解过程的残余的胶原酶。
本发明的处理腔室30优选地定位在系统内部，使得再生细胞组合物通过管道12、阀14和泵34以无菌的方式从采集腔室20运动到处理腔室30。处理腔室的尺寸为容纳10毫升 I. 2升范围内的组织/流体混合物。在优选的实施方式中，处理腔室的尺寸为容纳800毫升。在某些实施方式中，来自采集腔室20的全部再生细胞组合物被引导到处理腔室30。然而，在其它实施方式中，再生细胞组合物的一部分被引导到处理腔室30，并且另一部分被引导到系统的不同的区域，例如，样品腔室60，以稍后与处理腔室30内处理的细胞重新结合。处理腔室30可以使用任何能够与被杀菌的生物相容的适合材料制造。在优选的实施方式中，采集腔室30用一次性材料制造，该材料符合在ISO10993标准中描述的用于血管内接触的生物相容性要求，例如，可以使用聚碳酸酯、丙烯酸树脂、ABS、乙烯-醋酸乙烯共聚物或苯乙烯丁二烯共聚物(SBC)。在另一个实施方式中，一次性的处理腔室的流体通道为无热原的，处理腔室可以采取塑料袋的形式，诸如那些通常用于在血库中处理血液的塑料袋；或者在其它实施方式中，其可以为刚性结构(图6)。在一个实施方式中，处理腔室30可以与共同拥有的2001年12月7日提出的美国专利申请No. 10/316, 127和2002年12月20日提出的美国专利申请No. 10/325,728中公开的处理腔室相似，这里将这两篇专利申请的内容全文通过参考进行引入。处理腔室30可以以任何适合于分离和浓缩细胞的方式构造，包括过滤和离心分离和/或它们的组合。在某些实施方式中，来自采集腔室20的再生细胞组合物被引入处理腔室30，此处能够过滤该组合物以分离和/或浓缩特定的再生细胞群体。细胞过滤为将特定的成分和细胞从其它不同的成分或不同类型的细胞分离的方法。例如，本发明的再生细胞组合物包括多种不同类型的细胞，包括干细胞、祖细胞和脂肪细胞以及一种或多种污染物，诸如胶原蛋白，其存在于脂肪组织片段中或来自组织分解过程的残余的胶原酶。存在于处理腔室30中的过滤器36可以允许分离和浓缩再生细胞的特定的亚群体，例如，干细胞或内皮祖细胞等等。一些与从液体过滤细胞相关的变量包括但不限于，过滤器介质的孔尺寸、孔的几何形状(形状)、过滤器的表面积、过滤的溶液的流动方向、贯穿膜的压力、特定的细胞群体的稀释度、微粒的大小和形状以及细胞大小和细胞生存能力。根据这里的公开物，需要分离或过滤的特定细胞通常为脂肪来源的干细胞。然而，在某些实施方式中，特定的细胞可以包括脂肪来源的祖细胞，诸如单独的内皮前体细胞或内皮前体细胞与干细胞组合。再生细胞组合物可以被引导通过过滤器组件，诸如过滤器组件36。在某些实施方式中，过滤器组件36包括构造为执行不同的功能并且将再生细胞组合物分离为不同的部分或成分的多个过滤器。例如，过滤器之一可以构造为从再生细胞组合物分离胶原蛋白，过滤器之一可以构造为从再生细胞组合物分离脂肪细胞和/或脂质成分，以及过滤器之一可以构造为从再生细胞组合物分离残余的酶，诸如组织分解剂。在某些实施方式中，过滤器之一能够执行两个功能，诸如从组合物分离胶原蛋白和组织 分解剂。多个过滤器通常串联地布置，然而，过滤器的至少一部分也可以并联地布置。图2中示出了过滤器组件36的过滤器的串联布置。图3中示出了过滤器组件36的过滤器的并联布置。在一个实施方式中，过滤器组件36包括第一过滤器、第二过滤器和第三过滤器。第一过滤器构造为移除存在于再生细胞组合物中的胶原质颗粒。这些胶原蛋白颗粒通常直径大约为O. I微米并且长度能够达到20微米。根据消化能力，胶原蛋白颗粒可以为不同的尺寸。它们也可以是原纤维，意味着它们具有扭曲和旋转。这里描述的任何过滤器可以由聚醚砜、聚醋、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚偏氟乙稀、或可能由纤维素构造。过滤胶原蛋白存在两种可能性。一种为试图首先移除较大的颗粒，让细胞通过，这需要例如大约在10微米范围的过滤器。第二种方法为使用较小尺寸的过滤器，诸如4.5微米，目的为很好地消化胶原蛋白，以便捕获细胞，并且让胶原蛋白通过。这需要让细胞从过滤器漂浮退出的装置。还可能实现吸引并且保持胶原蛋白纤维的过滤器。第二过滤器构造为移除在再生细胞组合物中不能漂浮的游离不成熟脂肪细胞。在一个实施方式中，第二过滤器可以由聚酯构造并且孔尺寸在大约30和大约50微米之间，优选的孔尺寸为大约40微米。虽然称作第二过滤器，这样的设备可以放置在第一而不是第二位置，以促进初始移除较大的细胞和颗粒。第三过滤器构造为移除存在于组合物中的未用过的或残余的胶原酶或其它组织分解剂。在优选的实施方式中，胶原酶可以随着时间的过去而退化。在一个实施方式中，第三过滤器包括多个直径或长度小于I微米的孔。在某些实施方式中，孔的直径可以小于I微米。在其它实施方式中，孔的直径在10千道尔顿和5微米之间。在某些实施方式中，第二过滤器可以构造为将再生细胞群体浓缩到小体积的盐水或其它清洗溶液中，如在这里描述的。当前优选地，仅最终过滤器为空心纤维单元。没有必要任何过滤器必须是空心纤维类型的。在优选的实施方式中，空心纤维单元用于最终过滤器，因为其对在对再生细胞的有害影响最小的情况下移除胶原酶是最有效的。在设备采用现成的物品的实施例中，三个过滤器在分开的壳体中。如果空心纤维单元用于第二过滤器，将第一和第二过滤器结合到一个壳体内是合理的。如采最终过滤器不是空心纤维配置，那么全部三个过滤器能够包在一个壳体内。过滤器组件36的过滤器可以定位在处理腔室30内或可以提供为从处理腔室30分离的部件。另外，过滤器组件36的过滤器可以提供在多个处理腔室内或者以在管线内的方式提供。在某些实施方式中，导管或管道可以作为一个或多个处理腔室。处理腔室的尺寸可以减小，使得其变成连接过滤器的导管的内部体积。如果组织溶液的体积大小适合，此类型系统将正确地起作用。从而，通过在具有细胞的流体穿过过滤器时容纳该流体，导管可以作为处理腔室。应该注意使得导管的体积最小，使得在起动和运行系统的过程中不会不必要地损失细胞/组织。参考上述实施方式，包含清洗的细胞和残余的胶原蛋白、脂肪细胞和/或未消化的组织分解剂的再生细胞组合物可以被引导通过第一过滤器，以从该组合物移除胶原颗粒的至少一部分并且优选地移除基本上全部，使得较少优选没有胶原蛋白颗粒存在于过滤的溶液内。包含脂肪细胞和/或未消化的组织分解剂的过滤的再生细胞组合物，可以随后被引导通过第二过滤器，以从过滤的再生细胞组合物移除游离的脂肪细胞的至少一部分并且优选移除基本上全部。随后，包含未消化的组织分解剂的两次过滤的再生细胞组合物，可以被引导通过第二过滤器，诸如如在这里所讨论的空心纤维过滤设备，以从再生细胞组合物移除或减少未消化的组织分解剂。三次过滤的再生细胞组合物(即在通过第一、第二和第二过滤器后剩余的组合物)可以随后被引导到多个出口，其可以包括包含多个出口的处理腔室30的一部分。这些出口 可以用来维持必要的压力，以及通过导管提供到其它容器的连接，其它容器可以包括采集腔室20、输出腔室50和/或废物容器40。在一个实施方式中，过滤器组件36的过滤器包括空心纤维过滤构件。或者换句话说，过滤器包括用过滤器介质形成的空心管的聚集。可以与公开的系统10—起使用的过滤器介质的示例包括聚砜、聚醚砜或混合的酯材料和类似物。这些过滤器介质的空心纤维或空心管可以包含在过滤器组件36的圆柱形滤筒内。过滤器介质的单独的管或纤维的内直径通常在大约O. I毫米到大约I毫米的范围内，优选的值为大约O. 5毫米。适合的圆柱形滤筒的直径和长度将确定可以放置在滤筒内的过滤器介质的单独的管的数量。一个适合的空心纤维过滤器滤筒的示例为l.-iberFto185切向流过滤器，目录#M-c-050-K(MinntechMinneapolis, Minnesota)。过滤器介质的孔尺寸能够在大约IOK道尔顿和大约5微米之间的范围内，优选的孔尺寸为大约O. 5微米。在空心纤维过滤器中，每个空心管的主体具有第一端、第二端和定位在主体内并且在第一端和第二端之间延伸的内腔。每个空心管的主体包括多个孔。孔通常在主体内定向为使得通过使再生细胞组合物流动通过主体的内腔来过滤再生细胞组合物，并且要被过滤的产品切向地通过孔，如图12A所示。换句话说，液体中的较小颗粒相对于通过主体的内腔的流体流动切向地通过孔。当过滤组合物时，具有再生细胞的组合物通过每个空心管的内腔。优选地，组合物的流动与每个空心管的主体的孔成切向。通过使用切向地流动的流体，与其它过滤技术相比，可以增强干细胞的过滤效率。例如，根据一些过滤技术，过滤器介质的孔以这样的方式布置，使得过滤器定向为垂直于流体的流动，使得过滤器介质阻塞被过滤的流体的通道，如在图12B中所示。在此类型的过滤中，被从例如干细胞的再生细胞组合物中滤出的颗粒倾向于在过滤器的一侧积累并且阻塞流体通过孔的流动。此阻塞可以减小过滤器的效率。另外，细胞被流体流的压力以及积累在过滤器的上游侧的细胞的重量不断地压缩。这能够导致增加干细胞溶解。从而，在这样的流体的流动与过滤器内的孔的方位平行的过滤技术中，在流体通过孔时，大细胞和小颗粒都可能被不合需要地引导靠着过滤器介质。从而，诸如细胞的液体内的较大的产品可能阻塞孔，从而降低过滤效果并且增加细胞破裂或伤害的发生。
相反，在当前系统10的空心纤维构造中，被过滤的流体在空心管的内腔内流动。能够通过过滤器的主体的孔的流体的部分借助于在主体的内侧上的流体的正压力以及施加在主体的外侧上的负压力通过过滤器的主体的孔。在此实施例中，细胞通常不遭受流体流的压力或其它细胞的重量，并且因此，减小了在干细胞上的剪切力。从而，能够通过减小阻塞率和减小再生细胞溶解增强过滤的效率和效果。由于盐水和不需要的蛋白质分子的尺寸，在过滤期间，这些分子和其它小成分通过空心管的主体的孔到达空心管外部，并且被引导到废物容器40。在一个实施方式中，通过在空心管过滤器介质的外侧产生真空来自增强过滤。由于再生细胞例如干细胞或祖细胞的尺寸，这些细胞通常不能通过主体的孔，并且因此保留在空心管过滤器的内侧上(例如，在管的内腔内)，并且通过在过滤器和处理腔室之间的导管被引导回到处理腔室30，或者到输出腔室50。在一个特定的实施方式中，空心纤维过滤器的孔尺寸为大约O. 05微米，并且包含大约550平方厘米的过滤器介质表面积。单独的介质管的直径通常为大约O. 5毫米。在处理130毫升再生细胞组合物中，大约120毫升附加的盐水可以添加到组合物。处理或过滤器时间可以为大约8分钟。空心纤维管的主体任一侧上的压力差异(例如，主体内腔内的压 力和主体外部)认为是贯穿膜的压力。贯穿膜的压力可以在大约I毫米汞柱到大约500毫米汞柱的范围内，优选为大约200毫米汞柱。使用空心纤维过滤的平均有核细胞恢复和生存能力可以为大约生存的细胞的80%。在这样的系统中通常被移除的胶原酶的量等于减少了 1000倍。例如，如果从采集腔室传输到处理腔室的再生细胞组合物中的胶原酶的初始浓度为O. 078U/ml，最终的再生细胞组合物中的胶原酶浓度将为O. 00078U/ml。胶原酶在空心纤维过滤器中被移除，并且空心纤维过滤器对应上述第二过滤器。说明了一种或多种上述细胞过滤方法的处理腔室在图中示出，特别是图广3。参考图广3，在处理腔室30和过滤器组件36的过滤腔室之间，可以提供泵，诸如泵34。另外，排出口和压力传感器，诸如排出口 32和压力传感器39，可以和处理腔室30和过滤器组件36共管线提供。也可以提供用于输出腔室50的配件。这些可选的部件(例如，泵34、排出口 32、压力传感器39，以及用于输出腔室50的配件)可以提供在处理腔室30和过滤器组件36之间，使得容纳在处理腔室30内的液体可以在流动通过过滤器组件36以前流到这些可选的部件中的一个或多个。例如，液体可以在通到过滤器组件36以前流动通过泵34。或者，液体可以在通过过滤器组件以前通过压力传感器39，以在系统内获得过滤器前的液体压力。在某些情况中，一种或多种这样的部件也可以提供为处理腔室30的元件，诸如图6中所示的排出口 32。在示出的实施方式中，压力传感器39在管线内，以在再生细胞组合物进入过滤器组件36的过滤腔室时确定由泵34产生的再生细胞组合物的压力。此构造能够促进监测穿过过滤器膜的贯穿膜的压力。附加的盐水或其它缓冲和清洗溶液可以添加到再生细胞组合物，以当该组合物通过过滤器组件36被过滤时，帮助移除不需要的蛋白质。此重复的清洗能够被执行多次以增强再生细胞的纯度。在某些实施例中，盐水能够在任何认为有必要的步骤添加，以增强过滤。在一个作为示例提供并且不是限制性的特定的实施方式中，以接下来的方式移除不需要的蛋白质和盐水或其它清洗溶液。具有再生细胞，以及胶原蛋白和结缔组织颗粒或片段、脂肪细胞和胶原酶的组合物，被循环通过一系列过滤器，直到达到最小的体积。该最小的体积为系统的总滞留体积和一些预先确定的常数的函数。滞留体积为如果全部处理腔室是空的，包含在管道和导管中的液体的体积。在一个实施例中，最小的体积为15毫升。当达到最小的体积时，将预先确定量的清洗溶液引入系统以与再生细胞组合物混合。此清洗溶液和再生细胞组合物的混合物随后被循环通过过滤器，直到再次达到最小体积。此循环可以重复多次以提高再生细胞的纯度，或者换句话说，增加组合物中的再生细胞对组合物中的其它材料的比率。参看图10和图11。在已经确定已经从再生细胞组合物清除了不需要的蛋白质并且充分地浓缩(在示例性的实施方式中，可以使用的最小浓度在大约IxlO5到大约IxlO7细胞/毫升的范围内并且，在优选的实施方式中最小浓度可以为大约IxlO7细胞/毫升)以后，输出腔室50，诸如输出袋，可以根据特定的实施方式连接到处理腔室30和/或过滤器组件36的出口。诸如排出口 32的排出口可以随后打开以促进浓缩的再生细胞输出。在一个实施方式中，在已经运行实验以后，根据经验确定何时到达最小浓度，并且编程序到设备的电子控制器内。该确定可以为需要出产什么，即需要多少干/祖细胞，或者细胞浓度的范围的过程的输入。基于科 学的数据，预定量的脂肪组织需要被获得并且放置到系统内以获得需要的输出。通过排出口 32打开，诸如泵34的泵可以工作以将浓缩的再生细胞传输到输出袋内。在一个实施方式中，输出袋50与具有在一端具有配件的管的空的血袋相似。输出袋上的配件可以以无菌的方式接附到出口，并且浓缩的再生细胞可以被传输到输出袋。如图I到图3所示，可以在系统10中提供真空泵26以改变系统内的压力和其它参数。例如，真空泵26可以通过诸如导管12b的导管连接到采集腔室20，以导致采集腔室20内的压力降低。真空泵26也可以通过诸如导管12g的导管连接到处理腔室30。考虑到真空泵26连同泵34的操作，可以实施两个分开的真空泵或源，或者，通过使用将真空拉力引导到在过程的特定点需要真空拉力的不同的导管的阀，可以实施单独的真空泵或源。另夕卜，真空泵26可以通过诸如导管12f的导管连接到废物容器40。参考图10和图11，通过真空泵26产生的压力可以用于引导包括再生细胞的流体流动通过导管12。此压力可以以多个方向施加，例如，通过自动地或手动地控制系统10中的一个或多个阀14的位置。可以通过使用正压力或负压力或它们的组合来使得系统10正确地发挥作用。例如，再生细胞可以被拉动通过上述第一和第二过滤器进入连接到第三过滤器的软侧的容器。软侧容器可以连接在第三过滤器前面的管线内(串联)。最终输出腔室可以为软侧的容器，其在第三过滤器的另一侧(例如，下游侧)。在此实施方式中，使用压力将再生细胞从一个软侧容器通过过滤器运动到第二软侧容器。在系统10的另一个实施方式中，可以使用渗滤过滤和沉淀结合来实现对干细胞和/或源自脂肪的祖细胞的过滤，例如，这样的系统使用盐水，将该盐水通过组织再生细胞组合物(例如，包含干细胞和/或源自脂肪的祖细胞的组合物)并且随后通过过滤器。与从再生细胞组合物渗滤过滤细胞有关的变量的一些包括但不限于，过滤器介质的孔尺寸、孔几何形状或形状、过滤器的表面积、被过滤的再生细胞组合物的流动方向、注入的盐水的流速、贯穿膜的压力、细胞群体的稀释度、细胞尺寸和生存能力。在系统10的一个实施方式中，处理腔室30使用过滤器组件36，其执行渗滤过滤和沉淀以分离和浓缩再生细胞。示例性的而不是限制性的，处理腔室30限定为如图6所示的大致上圆筒形的主体，具有侧壁30a、顶部表面30b和底部表面30C。在顶部表面30b内提供了无菌的排出口 32。在图6所示的实施方式中，处理腔室30示出为包括过滤器组件36，过滤器组件36包括两个过滤器，诸如大孔过滤器36a和小孔过滤器36b。过滤器36a和36b的孔尺寸通常在大约O. 05微米和大约10微米的范围内。大孔过滤器36a可以包括直径为大约5微米的孔，并且小孔过滤器36b可以包括直径为大约I到3微米的孔。在一个实施方式中，过滤器的表面积为大约785平方毫米。过滤器36a和36b划分处理腔室30的内部以包括第一腔室37a、第二腔室37b和第三腔室37c。如图6所示，第一腔室37a定位在第二腔室37b和第二腔室37c之间。另外，第一腔室37a示出为具有入口 31a和出口 31b的处理腔室30的区域。示出的处理腔室30包括多个提供从处理腔室30的外部到处理腔室30的内部的连通通道的口，诸如口 31a、31b和31c。口 31a、31b和31c示出为设置在处理腔室30的主体的侧壁30a内。然而，口 31a、31b和31c也可以定位在其它区域内。口 31a示出为样品入口，其构造为连接到导管，使得包含再生细胞的组合物可以进入处理腔室30内部。口 31b示出为出口，其构造为连接到导管，使得分离并且浓缩的细胞可以从处理腔室30的内部移 除。口 31c示出为入口，其构造为连接到导管，用于将诸如盐水的新的清洗溶液输送到处理腔室30的内部。使用中，再生细胞可以通过入口 31a引入中央的腔室37a。盐水或其它缓冲剂通过入口 31c引入底部腔室37b。可以以大约10毫升/分钟的速率引导盐水通过腔室37a中的再生细胞组合物。盐水的流速为使得其抵消重力。盐水的流动使得腔室内的细胞能够基于细胞的密度分离。通常，当迫使盐水上升通过组合物时，组合物中的较大的细胞将沉淀到中央腔室37a的底部，而较小的细胞和蛋白质将被运走通过第二过滤器36b进入顶部腔室37c。通过调节盐水的流边，使得较大的细胞在允许使较小的颗粒脱离并且用盐水带走的位置滚动，该过滤可以实现。在腔室30中包括无菌的排出口 32以确保在处理单元内部的三个腔室内维持正确的压力梯度。上腔室37c可以包括吸收剂介质33。吸收剂介质的目的为捕获溶液中的不合需要的蛋白质，以确保如果例如盐水的流速降低，溶液中的不合需要的蛋白质不会穿过过滤器介质回到处理溶液内。吸收剂介质可以为某种类型的过滤器材料，其为吸收剂、或吸引要被滤出的材料或成分。可以在顶部过滤器上方添加流出口以帮助排出废物。排出废物的另一个实施方式可以为从顶部施加轻度的真空以帮助排出废物。如在示出的实施例中，吸收剂介质可以在流速相对较小时实施。多余的盐水和蛋白质随后被运走到废物容器。当已经充分地从较小的细胞和蛋白质分离较大的细胞(例如，源自脂肪的干细胞和/或祖细胞)后，如在这里讨论的，可以浓缩包含分离的细胞的组合物。在已经通过出口31b从腔室37a移除组合物以后，或当其在腔室37a中时，该组合物可以被进一步浓缩。在一个实施例中，以接下来的方式增加组合物中的细胞浓度。在细胞已经被充分地分离以后，诸如过滤器36a和36b的过滤器可以朝向彼此运动。此运动的效果为减小两个过滤器之间的体积(例如，腔室37a的体积)。也可以提供与处理腔室30相结合的振动构件，以促进组合物中的细胞浓缩。在一个实施方式中，振动构件可以连接到过滤器36b (例如，小孔过滤器)。振动可以减小细胞被捕获在过滤器内的发生率。组合物体积的减小允许移除多余的盐水作为废物和细胞浓缩为较小的体积。在另一个实施方式中，以接下来的方式实现对再生细胞的浓缩。在细胞已经被充分地分离以后，可以将再生细胞组合物传输到另一个腔室(未示出)，该腔室使用重力来滤出多余的盐水。在优选的实施例中，沉淀可以在渗滤的同时发生。可以通过将组合物引入到孔尺寸从大约10千道尔顿到大约2微米的范围内的过滤器的顶部来实现沉淀。在一个实施方式中，适合的过滤器的孔尺寸为大约I微米。重力将在防止组合物中的细胞流动通过过滤器的同时允许盐水和较小的颗粒通过过滤器。在已经获得对细胞的需要的浓缩以后，并且在已经从过滤器下方移除过滤的较小的颗粒以后，可以搅动再生细胞组合物以从过滤器移除细胞，并且随后将浓缩的再生细胞传输到输出袋。较小的颗粒可以作为废物通过出口排出。在特定的实施例中，来自采集腔室20的再生细胞组合物被传送到处理腔室30，其中可以离心分离组合物以分离和浓缩再生细胞。离心分离原理在本技术领域中众所周知，因此为了简短，将不在这里重复叙述。这里使用标准的、领域内认可的离心分离设备、部件和参数。用作离心分离设备的一部分的示例性的处理腔室在图7和图8中示出。通常，离心分离设备导致离心分离腔室(诸如图7中所示的离心分离腔室)围绕轴线旋转，以由此增加作用在溶液中的细胞上的力以使得该力大于重力。溶液中密度较大或较重的材料通常沉淀到离心分离腔室，即图7所示的输出腔室50的一端，以形成再生细胞小团。该小团可以 随后重新悬浮以获得具有需要的细胞浓度和/或需要的细胞和介质量的溶液。图7所示的处理腔室构造为使用离心力和重力分离和浓缩细胞。特定地，在离心分离期间，离心力引导再生细胞组合物的密度较大的成分，例如再生细胞，朝向离心分离腔室的最远端。在离心分离腔室慢下来并且最终停止时，重力帮助再生细胞保持在离心分离腔室的最远端并且形成细胞小团。因此，再生细胞组合物的不需要的成分，即废物，可以在不防碍细胞小团的情况下被移除。在本发明的再一个实施方式中，处理腔室可以包括旋转膜过滤器形式的细胞浓缩器。在离心分离过程的再一个实施方式中，也可以应用离心淘析法。在此实施例中，可以基于个体细胞的沉淀速率分离细胞，使得通过离心分离施加的定向的(例如，向外的)力导致细胞和溶液以不同的速率沉淀。在淘析中，目标细胞群体的沉淀速率与通过在与离心力相反的方向泵送溶液施加的相反的(例如，向内的)流速对抗。调节该逆流使得溶液内的细胞和颗粒分离。淘析已经被应用于许多细胞分离的例子中(Inoue, Carsten等人,1981 ；Hayner, Braun等人，1984 ;Nogal999),并且用于优化流动和离心参数的原理和实践可以由本领域中的普通技术人员根据本公开物在这里实施。图9示出了与根据本发明的淘析实现有关的原理。在使用旋转转子将力施加到溶液的方面，该淘析实施例与尚心分尚实现相似。与目前具体化的淘析分尚有关的一些变量包括但不限于，旋转腔室的尺寸和形状、转子的直径、转子的速度、逆流管道的直径、逆流的流速、以及要从溶液移除的颗粒和细胞的尺寸和密度。如在离心分离中一样，再生细胞可以基于个体细胞密度分离。在一个实施方式中，再生细胞组合物，例如，包含再生细胞和胶原酶的溶液，被引入如图9. I所示的旋转转子的腔室。在溶液已经添加到腔室以后，以预先确定的流速将附加的盐水添加到腔室。盐水的流速可以作为转子速度、细胞直径和根据经验所设的腔室常数的函数确定。例如使用与IV泵相似的设备来控制流速。附加的盐水的目的为在转子腔室内提供某种状态，在该状态下，较大的颗粒将运动到腔室的一侧并且较小的颗粒将运动到另一侧，如图9. 2中所示。调节该流动使得，在此应用中，较小的颗粒将退出腔室并且运动到废物容器，如图9. 3中所示。此运动导致转子腔室内的溶液具有基本上均匀的细胞群体，诸如干细胞。在已经确定干细胞已经被从溶液中剩下的物品分离以后(不需要的蛋白质和游离的脂质已经从腔室移除)，停止逆流。腔室内的细胞将随后在腔室的外壁上形成浓缩的小团。逆流反转并且细胞小团被传输到输出袋。如之前在这里阐明的，处理腔室30或输出腔室50可以包括一个或多个口，例如口51或52。一个或多个这些口可以设计为将使用任何上述方法的组合获得的再生细胞或其一部分通过导管传送到其它外科手术设备、细胞培养设备、细胞腌泡设备、基因治疗设备或纯化设备。这些口也可以设计为将再生细胞通过导管传送到系统内另外的腔室或容器或作为用于与上述相同的目的的另一个系统的一部分的腔室或容器。口和导管也可以用于添加一种或多种添加剂，例如，生长因子、重新悬浮流体、细胞培养试剂、细胞扩张试剂、细胞保存试剂或包括将基因传输到细胞的制剂的细胞修改试剂。口和导管也可以用于将再生细胞传送到诸如植入材料(例如，架子或骨片段)以及其它外科手术植入物和设备的其它目标。
还可以通过重构现有系统的一次性用具的相互连接、为现有系统的处理设备重新编程序、通过为现有系统提供不同的或附加的容器和/或腔室、通过将细胞传送到一个或多个附加的系统或设备和/或它们的任何组合，来开始对细胞的进一步处理。例如，系统可以通过任何上述方法重构，使得使用该系统获得的再生细胞可以经历接下来的一种或多种处理细胞扩张(针对一种或多种再生细胞)和细胞维护(包括细胞片漂洗和介质变化);次培养；细胞播种；瞬时转染(包括从大量供给播种转染的细胞)；获取(包括酶促、非酶促的获取和通过机械刮削获取)；测量细胞生存能力；细胞平铺(例如，在微量滴定板上，包括从单独的井拾取用于扩张的细胞，将细胞扩张到新的井内)；高吞吐量筛选；细胞治疗应用；基因治疗应用；组织工程应用；治疗的蛋白质应用；病毒疫苗应用；获取再生细胞或上清液用于库存或筛选，测量细胞生长、溶解、培植、感染或引入；产生细胞系(包括杂交瘤细胞)；培养细胞用于渗透性研究；用于RNAi和抗病毒研究的细胞；用于破坏和转基因动物研究的细胞；亲和力纯化作用研究；结构生物学应用；检定开发和蛋白质工程应用。例如，如果对于特定的应用需要扩张再生细胞群体，可能使用这样的方法，其使用培养条件来优选地扩张该群体，而其它群体由于需要的生长条件缺乏而维持(并且因此通过被生长的选择的细胞稀释而减小)或损失。Sekiya等人已经描述了可以在这点上用于源自骨髓的干细胞的条件(Sekiya等人，2002)。可以将此方法(到组织培养塑料的附着力有差异或没有差异)应用到本发明的再一个实施方式。在此实施方式中，从输出腔室移除最终的再生细胞小团并且将其放置到提供细胞培养部件的第二系统内。这可以采取传统的实验室组织培养培育器或生物反应器类型的设备的形式，诸如Tsao等人在美国专利No. 6,001,642中所描述的，或Armstrong等人在美国专利No. 6，238，908中所描述的。在替代的实施例中，细胞扩张或细胞培养部件可以添加到现有系统中，例如，添加到输出腔室内，允许脂肪来源的细胞群体短期粘附和/或细胞培养。此替代的实施方式允许将细胞培养和/或细胞扩张部件整合到系统并且不再需要从此系统移除细胞并且将其放置到另一个系统内。在处理期间，根据需要，可以将一种或多种添加剂添加到不同的腔室或容器或与其一起提供，以增强结果。这些添加剂也可以提供为与现有系统相关或分开的另一个系统的一部分。例如，在某些实施方式中，添加剂在不需要从系统移除再生细胞的情况下添加或提供。在其它实施例中，通过以无菌的方式将包括该添加剂的新的容器或腔室连接到系统的未使用的口内来添加或提供添加剂。在再一个实施方式中，通过未连接到本发明的系统的第二系统或设备添加或提供添加剂。一些添加剂的示例包括如这里所描述的优化清洗和分解的制剂、增强在处理期间活性的细胞群体的生存能力的添加剂、抗微生物剂(例如，抗生素)、溶解脂肪细胞和/或红细胞的添加剂、或富集所关心的细胞群体的添加剂(通过有差别地粘附到固相部分或另外促进细胞群体的相当大的减少或者富集)。例如，为了获得同源的再生细胞群体，可以使用任何适合的方法来分离并且浓缩特定的再生细胞类型，诸如使用细胞特定的抗体，其识别并且结合存在于例如，干细胞或祖细胞，例如，内皮前体细胞上的抗原。这些包括正向选择(选择目标细胞)、负向选择(选择性地移除不需要的细胞)、或它们的结合。诸如酶的细胞内的标记也可以用于使用当与特定的酶起作用时发荧光的分子的选择。另外，可以将具有选择为允许区别地附着和/或洗脱在最终的细胞小团内的特定的再生细胞群体的附着特性的固相材料插入系统的输出腔室。此区别附着方法的替代的实施例可以包括使用识别目标的再生细胞和不需要的 细胞上区别地表达的表面分子的抗体和/或抗体的组合。基于特定细胞表面标记(或它们的组合)的表达的选择是另一种通常应用的技术，其中抗体被接附(直接地或间接地)到固相支撑结构上(Geiselhart 等人，1996 ；Formanek 等人，1998 ；Graepler 等人，1998 ；Kobari等人，2001 ；Mohr 等人，2001)。在另一个实施方式中，细胞小团可以被重新悬浮在流体材料上(或下)分层，该流体材料形成为连续的或不连续的密度梯度并且被放置在离心机内以基于细胞密度分离细胞群体。在相似的实施例中，也可以使用连续流动方法，诸如脱落(Smithl997),和淘析(有或没有逆流)(Lasch 等人,2000) (Ito 和 Shinomiya, 2001 )。如在这里讨论的，添加剂的其它示例可以包括附加的生物学的或结构的成分，诸如细胞分化因子、生长促进剂、免疫抑制剂、医疗设备、或它们的任何组合。例如，可以添加其它细胞(例如，心球样细胞(cardiosphere))、组织(例如,心脏组织)、组织片段、诸如VEGF的生长因子和其它已知的血管生成的或动脉生成的生长因子、生物活性或惰性化合物(如cardiogenol C)、可再吸收的支架、或其它倾向于增强再生细胞群体的输送、功效、可容许性、或功能的添加剂。再生细胞群体也可以通过插入DNA (例如编码Id蛋白质、WNT家族蛋白、如RXR家族蛋白和gpl30的信号蛋白和/或如IGF-I的生长因子，)或通过以改变、增强、或补充再生细胞的功能以实现结构的或治疗的目的的方式放置到细胞培养系统(如在这里所述或本领域内已知的)内来修饰。例如，基因工程可以用于定制再生细胞的基本速率(pacing rate),其再输注到患者内之前分化成心肌细胞或心肌细胞样细胞以确保最佳心跳速率(beatingrate)。本领域中的普通技术人员已知用于干细胞的基因转移技术，如在(Morizono等人，2003 ;M0Sca等人，2000)中公开的，并且可以包括病毒转染技术，并且更特定地，腺相关的病毒基因转移技术，如在(Walther和Stein, 2000)和(Athanasopoulos等人，1998)中公开的。也可以执行非基于病毒的技术，如在(Muramatsu等人，1998)中公开的。可以添加编码一个或多个细胞分化因子，例如，生长因子或细胞活素，的基因。不同的细胞分化剂的不例在(Gimble 等人，1995 ； Lennon 等人，1995 ； Majumdar 等人，1998 ； Cap I an 和 Goldberg,1999 ；Ohgushi 和 Cap I an, 1999 ；Pittenger 等人，1999 ； Cap I an 和 Bruder, 2001 ；Fukuda,2001 ;Worster等人，2001 ;Zuk等人，2001)中公开。也可以添加编码抗凋亡因子或制剂的基因。基因(或基因的组合)的添加可以通过本领域中已知的任何技术，包括但不限于腺病毒转导、”基因枪”、脂质体介导的转导和逆转录病毒或慢病毒介导的转导、质粒、腺相关的病毒。这些再生细胞可以随后与载有能够随着时间的过去，将基因释放和/或提供给细胞的基因输送媒介物的载体材料一起植入，使得转导可以继续或在原位开始。当包含细胞和/或包含细胞的组织所给药的患者不是获得该细胞和/或组织的患者时，可以给予接受该细胞和/或组织的患者一种或多种免疫抑制剂，以减小并且优选地防止移植的排斥反应。如在这里使用的，术语“免疫抑制药品或制剂”倾向于包括抑制或防碍正常的免疫功能的药剂。这里公开的方法适合的免疫抑制剂的示例包括抑制T细胞/B细胞协同剌激通道的制剂，诸如防碍T细胞和B细胞通过CTLA4和B7通道连结的制剂，如在美国专利No. 20020182211中所公开的。优选的免疫抑制剂为环抱霉素A。其它示例包括myophenylatemofetil、雷伯霉素和抗胸腺细胞球蛋白。在一个实施方式中，免疫抑制药品与至少一种其它治疗试剂一起给药，免疫抑制药品以与给药的路线相容的自己方给药，并 且给药受试者足够的剂量以得到理想的治疗效果。在另一个实施方式中，免疫抑制药品瞬时地给药足够的时间以导致对本发明的再生细胞的耐受性。在这些实施方式中，再生细胞可以通过本领域中认可的任何方式接触、结合、混合或添加到添加剂，包括诸如搅动设备的设备和在这里描述的相关方法。例如，可以使用摇动、倒转、压缩脉冲或运动的转子。在另一个方面，细胞群体可以被放置在受体内并且被可重新吸收的塑料护套或其它材料和诸如那些由MacroPoreBiosurgery公司制造的相关联的部件(参看例如，美国专利 No. 6，269，716 ;5，919，234 ;6，673，362 ;6，635，064 ;6，653，146 ;6，391，059 ;6，343，531 ；6，280,473)围绕。在所有前述实施方式中，分离并且浓缩的再生细胞的至少一部分可以被低温贮藏，如在 2002 年 9 月 12 日提出的题目为 “PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROMNON HEMATOPOIETIC TISSUES”的美国专利申请No. 10/242，094中所描述的，其要求2001年9月14日提出的美国临时专利申请60/322,070的优先权，其已经共同转让，并且其内容在这里通过参考全文清楚地加入。在处理的结尾，可以手动地从输出腔室取回再生细胞。该细胞可以被装载到诸如注射器的输送设备中，用于通过皮下的、肌肉内的或其它允许将细胞输送到患者体内的目标位置的技术将该细胞放置到受体内。换句话说，可以通过本领域中的普通技术人员已知的任何方式将细胞放置到患者体内。优选的实施方式包括通过针或导液管放置，或者通过直接外科手术植入。在其它实施方式中，细胞可以自动地传送到输出腔室，其形式可以为容器、注射器或导液管等等，其可以用于将细胞放置在患者体内。该容器也可以用于存储细胞，用于稍后使用或用于低温贮藏。所有取回方法以无菌的方式执行。在外科手术植入的实施方式中，细胞可以与诸如在这里描述的预形成的基质或架子的添加剂联合施加。在本发明的优选的实施方式中(例如，图4中所示的实施例)，系统是自动的。在另一个实施方式中，系统具有自动部件，和手动部件。系统可以包括一个或多个连接到或安装在可重复使用的硬件部件或模块上的一次性部件。本发明的自动的系统提供屏幕显示(参看图16)，其促使正确地操作该系统。自动的系统也可以提供屏幕，其提供过程的状态和/或逐步的说明，以正确地设置系统的一次性部件。屏幕也可以指示系统内发生的问题或故障，如果它们发生的话，并且如果适当的话提供”排除故障”指导。在一个实施方式中，屏幕为使用者接口屏幕，其允许使用者通过例如触摸屏将参数输入系统。部分和完全自动的系统可以包括处理设备(例如，微处理器或个人计算机)和提供用于系统基于使用者输入操作和自动化过程的一个或多个步骤的控制逻辑的相关的软件程序。在某些实施方式中，系统的一种或多种情况可以为使用者能够通过驻留在处理设备中的软件编程序的。处理设备可以具有一个或多个在只读存储器(ROM)中的预编程序的软件程序。例如，处理设备可以具有定制为用于处理血液的预编程序的软件，用于处理脂肪组织以获得小体积的再生细胞的另一个程序，并且用于处理脂肪组织以获得较大体积的再生细胞的另一个程序。处理设备也可以具有预编程序的软件，其向使用者提供适当的参数以基于使用者输入的有关信息优化过程，使用者输入的有关信息诸如，需要的再生细胞的量，处理的组织类型，需要的处理后操纵的类型，治疗应用的类型等等。软件还可以允许步骤自动化，诸如通过控制系统的泵和阀，控制流体和组织沿特 定的管道通道进入和外出；控制触发的适当的顺序和/或方向；用压力传感器探测阻塞；混合机构，使用测量体积的机构测量要沿特定的通道运动的组织和/或流体的量；使用加热控制设备维持不同部件的温度；并且整合分离和浓缩过程与定时和软件机构。处理设备也可以基于处理的组织类型和/或获取的细胞群体或子群体，和要执行的过程的类型(例如，使用再生细胞增加的脂肪组织的组织增强，或用于使用再生细胞涂覆的骨移植物来修复骨的应用的细胞的处理)，来控制离心机速度。处理设备还可以包括标准并行或串行口或其它用于与其它计算机或网络通信的装置。因此，处理设备可以为独立单元或者联合用于在这里描述的其它处理方法的一种或多种附加的设备。软件可以允许自动采集”运行数据”，包括例如，一次性的部件的批号、温度和体积测量结果、组织体积和细胞数量参数、施加的酶的剂量、培育时间、操作者身份、数据和时间、患者身份等等。在设备的优选的实施方式中，可以整合诸如条形码读取系统的字符识别系统，以允许这些变量(例如一次性的用具批号和有效期，胶原酶的批号和有效期，患者/样品标识符等等)数据输入处理设备作为处理文件的一部分。这将减小数据输入错误的可能性。可以使用USB或本领域中已知的其它接口端口和系统容易地将这样的条形码读取系统加入处理设备。这样，设备可以提供整合控制过程的数据输入和文件。这些参数的打印出的报告将作为该系统的编程序的操作的使用者定义的参数的一部分。自然，这需要整合打印机部件(硬件和驱动程序)，或软件中的打印机驱动程序加上在设备的硬件中用于打印机的接口输出连接器(例如，USB 口)。在某些实施方式中，系统为完全自动的系统。例如，使用者可以初始地选择要处理的组织的量，将系统接附到患者并且系统可以自动地抽吸需要的组织并且在不需要使用者进一步输入的情况下以连续的顺序分离并且浓缩再生细胞。使用者也可以输入需要的再生细胞的量并且允许系统抽吸需要的量的组织并且处理该组织。完全自动的系统还包括能够基于数个(例如，两个或更多)使用者的输入参数，例如，清洗循环的数量，离心分离速度等等重新配置的系统。系统也可以以半自动方式运行，期间系统在不需要使用者干涉的情况下经过某些步骤，但是在某些过程能够发生以前需要使用者干涉。在其它实施方式中，系统为单一的整合的系统，其显示说明以引导使用者在预先确定的时间执行预先确定的操作。例如，处理设备可以提示使用者适当地插入管道、腔室和系统的其它部件所必需的步骤。因此，使用者能够确保执行操作的顺序正确。这样的系统可能附加地需要使用者确认每个操作步骤以防止在过程中无意地触发或中止步骤。在再一个实施方式中，系统可以开始自动地测试以确保正确地插入管道、腔室、没有阻塞等等。在再一个实施方式中，本发明的系统能够编程序以通过自动控制组织流动通过系统，执行多个分离和浓缩过程。此特征可以是重要的，例如，在对患者的外科手术期间，其中否则可能损失的组织被采集到系统内，并且来自组织的再生细胞分离并且浓缩并且将其返回患者体内。如上所述，系统的部件可以是一次性的(在这里称作“一次性用具”)，使得系统的部分可以在单次使用后除掉。此实现可以帮助确保与患者的组织接触的任何表面将在使用后适当地除掉。图13示出了示例性的一次性用具。在优选的实施方式中，系统的一次性部件被预先杀菌并且封装，以便能够“现贷供应”地使用，其容易使用并且容易装载并且其消除了对许多管道连接和复杂的管道连接路线的需要。这样的一次性部件的制造相对便宜，并且因此，不由于它们的废弃导致较大的费用。在一个实施方式中，一次性的系统(在这里 可交换地称作“一次性用具”)包括，基本上包含，或者包含，采集腔室20、处理腔室30、废物腔室40、输出腔室50、过滤器组件36、样品袋60和相关的导管12或管道。在系统的一次性用具的优选的实施方式中，采集腔室20和处理腔室30通过容纳在刚性框内的导管12连接。处理腔室30的旋转密封网络(图7和8)也可以容纳在同一个刚性框内。在另一个优选的实施方式中，一次性用具的不同腔室和容器包括必要的接口，该接口能够与系统的处理设备连通，使得自动化系统的泵、阀、传感器和其它设备在没有使用者干涉的情况下根据需要被适当地触发或停用。该接口还减小了需要设置系统的时间和所需要的专业技术，并且还通过指示如何正确地设置系统并且在设置错误时警告使用者减小了错误。本发明的大多数一次性用具可以具有许多通用的元件。然而，本领域中的普通技术人员可以理解，系统的不同应用可能需要附加的部件，其可以为一次性用具的一部分。因此，一次性用具还可以包括适合于从患者获得脂肪或其它组织并且将再生细胞返回患者体内的一种或多种针或注射器。包括的针和注射器的类型数和种类将取决于被处理的组织的类型和量。一次性用具还可以包括保持系统中使用的清洗流体和其它处理试剂的一个或多个刚性或柔性的容器。例如，一次性用具可以包括用于保持盐水、酶和过程需要的任何其它处理或置换流体的容器。另外，适合的清洗溶液、重新悬浮流体、添加剂、制剂或移植材料可以与一次性用具一起提供，以与本发明的系统和方法一起使用。在这里描述的或另外需要用于实施本发明的系统部件、装备或供给源的任何组合可以以成套器具的形式提供。例如，本发明的成套器具可以包括，例如，用于基于注射器的吸脂的最佳长度和规格的针和包含允许处理小体积的组织的优选的过滤器介质的无菌的注射器。在表II和III中列出了可以与本发明一起使用并且可以与本发明的成套器具包括在一起的其它示例性的装备和供给源。下面的表II列出了能够用于根据本发明的系统和方法获得脂肪来源的再生细胞的供给源的示例表II
权利要求
1.包含脂肪来源的干细胞的浓缩细胞群体在制备用于心肌梗死后的恢复灌注和减少心肌疤痕形成的药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其中，所述包含脂肪来源的干细胞的浓缩细胞群体还包含脂肪来源的祖细胞。
3.根据权利要求I所述的应用，其中，制成所述药物用于大剂量给药。
4.根据权利要求I所述的应用，其中，制成所述药物用于多剂量给药。
5.根据权利要求1-4中的任意一项所述的应用，其中，所述药物还包含至少一种血管生成因子。
6.根据权利要求1-5中的任意一项所述的应用，其中，所述药物还包含至少一种动脉 生成因子。
7.根据权利要求1-6中的任意一项所述的应用，其中，所述药物还包含一种或者多种免疫抑制药物。
8.根据权利要求1-7中的任意一项所述的应用，其中，制成所述药物用于通过心内膜心肌、心肌外膜、心室内、冠状动脉内、逆行冠状窦、动脉内、心包内或者静脉内给药途径给药。
9.根据权利要求1-8中的任意一项所述的应用，其中，包含脂肪来源的干细胞的浓缩细胞群体被基因转移所修饰。
10.根据权利要求I所述的应用，其中，所述包含脂肪来源的干细胞的浓缩细胞群体还包含添加剂。
11.根据权利要求10所述的应用，其中，所述添加剂选自由生长因子、免疫抑制剂、细胞再分解抑制剂组成的组。
12.根据权利要求I所述的应用，其中，所述包含脂肪来源的干细胞的浓缩细胞群体没有被培养。
13.根据权利要求I所述的应用，其中，所述包含脂肪来源的干细胞的浓缩细胞群体被隔离在设置成维持闭合的无菌的流体/组织通道的系统中。
全文摘要
本申请涉及使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法。本申请提供了包含脂肪来源的干细胞的浓缩细胞群体在制备用于心肌梗死后的恢复灌注和减少心肌疤痕形成的药物中的应用。脂肪来源的再生细胞被用于治疗患者，包括患有心血管病症、疾病或紊乱的患者。治疗患者的方法包括处理脂肪组织以为患者提供来自脂肪组织的浓缩量的再生细胞例如干细胞和祖细胞。该方法可以在封闭系统中实施，这样在被给药给患者之前，干细胞不会被暴露到外部环境中。因此，在优选的实施方式中，脂肪来源的再生细胞与对于促进、产生或支持治疗性心血管益处必要的添加剂一起被直接置入受体内。
文档编号A61K35/34GK102861105SQ201210266229
公开日2013年1月9日 申请日期2005年5月25日 优先权日2005年5月25日
发明者约翰·K.·弗雷泽, 马克·H.·赫德里克, 朱敏, 布赖恩·M.·斯特雷姆, 埃里克·丹尼尔斯, 伊莎贝拉·武卢尔 申请人:再生医疗技术公司