专利名称：Vstm1蛋白在制备促进白血病细胞分化产品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种VSTMl蛋白在制备促进白血病细胞分化产品中的应用。
背景技术：
白血病是以造血细胞分化阻滞为特 征的一类恶性疾病，目前根据累及的细胞类别不同分为淋巴细胞白血病、髓系白血病、红白血病及巨核细胞白血病等。其中以急性髓系白血病(AML)因髓系细胞分化阻滞阶段不同而呈现很大的异质性。传统的对AML的FAB分型已经不足以反映AML的特征，临床应用有限。因此，目前广泛运用的WHO的分型将AML的免疫标志物表达(免疫分型)、细胞遗传学改变及分子生物学(融合基因、突变)等纳入分类因素，更详细的反映了 AML的真实特征及其与预后的关系，对临床治疗的指导意义更大。VSTMl (V-set and transmembrane domain containing I)是由北京大学人类疾病基因研究中心新发现的一种潜在的细胞因子编码基因。人类VSTMl基因定位于染色体19ql3. 42，存在五种剪切体，其中VSTMl-vl和VSTMl_v2是两种主要形式。VSTMl-vl为I型膜蛋白，在NK、T、B、单核和粒细胞中广泛表达，在大多数肿瘤来源的细胞系中表达缺失；VSTM1-V2为经典分泌的糖蛋白，能促进外周血CD4+T细胞分泌IL-17A。Gene Atlas数据库提示VSTMl在正常骨髓CD33+髓系细胞中选择性高表达，而在其它组织、细胞中的表达丰度非常低。提示VSTMl不仅参与正常髓系细胞的发生、发展，而且可能在血液肿瘤的病理机制中发挥重要作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供如下I) -5)中任--种物质的新用途。本发明提供的如下1)-5)中任--种物质在制备促进白血病细胞分化和/或治疗
白血病产品中的应用I),VSTMl蛋白；2) VSTMl蛋白编码基因；3)含有所述VSTMl蛋白编码基因的重组载体；4)含有所述VSTMl蛋白编码基因的表达盒；5)含有所述VSTMl蛋白编码基因的转基因细胞系；所述VSTMl蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列I。上述应用中，所述VSTMl蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2。上述应用中，所述含有所述VSTMl蛋白编码基因的重组载体为将所述VSTMl蛋白编码基因插入表达载体中得到的重组载体。上述含有所述VSTMl蛋白编码基因的重组载体具体为pcDB-VSTMl，为将序列2(VSTMl蛋白编码基因)插入pcDNA3. 1-Myc-his (-)B的Not I和Kpn I酶切位点间得到的载体。上述应用中，所述含有所述VSTMl蛋白编码基因的转基因细胞系为将所述重组载体转入目的细胞得到的转基因细胞系。
上述应用中，所述白血病细胞和所述目的细胞均为慢性髓性白血病细胞或巨核细胞白血病细胞系；所述慢性髓性白血病细胞系具体为K562细胞；所述巨核细胞白血病细胞具体为MEG-Ol细胞；所述促进白血病细胞分化通过促进白血病细胞表面分化抗原⑶Ilb表达体现。本发明的另一个目的是提供如下I)-5)中任一一种物质的新用途。本发明提供的如下I) -5)中任--种物质在制备促进白血病细胞表面分化抗原
⑶I Ib表达产品中的应用I),VSTMl蛋白；2) VSTMl蛋白编码基因；3)含有所述VSTMl蛋白编码基因的重组载体；4)含有所述VSTMl蛋白编码基因的表达盒；5)含有所述VSTMl蛋白编码基因的转基因细胞系； 所述VSTMl蛋白的氣基酸序列为序列表中的序列I ;所述VSTMl蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2。上述应用中，所述含有所述VSTMl蛋白编码基因的重组载体为将所述VSTMl蛋白编码基因插入表达载体中得到的重组载体；所述含有所述VSTMl蛋白编码基因的转基因细胞系为将所述重组载体转入目的细胞得到的转基因细胞系。上述含有所述VSTMl蛋白编码基因的重组载体具体为pcDB-VSTMl，为将序列2(VSTMl蛋白编码基因)插入pcDNA3. 1-Myc-his (-)B的Not I和Kpn I酶切位点间得到的载体。上述应用中，所述白血病细胞和所述目的细胞均为慢性髓性白血病细胞或巨核细胞白血病细胞系；所述慢性髓性白血病细胞系具体为K562细胞；所述巨核细胞白血病细胞具体为MEG-Ol细胞。本发明的第三个目的是提供一种制备促进白细胞分化、促进白血病细胞表面分化抗原⑶I Ib表达和/或治疗白血病产品。本发明提供的产品，为上述的应用中的所述I) -5)中任--种物质。上述产品中，所述白血病细胞为慢性髓性白血病细胞或巨核细胞白血病细胞系；所述慢性髓性白血病细胞系具体为K562细胞；所述巨核细胞白血病细胞具体为MEG-Ol细胞。本发明的实验证明，本发明发现VSTMl蛋白可以促进白血病细胞的分化，将VSTMl蛋白编码基因转染白血病细胞K562细胞或MEG-Ol细胞，得到的转基因细胞的CDllb (细胞分化的细胞标记物，表达量越高，分化程度越高)表达量增加，说明该蛋白可以促进细胞分化，可用于白血病治疗，尤其是为耐化疗药白血病的研究和治疗提供了新的途径。
图I为转染细胞VSTMl蛋白表达水平检测图2为转染细胞VSTMl蛋白促进⑶Ilb表达
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，部分具体如下列出I、小牛血清、RPMI1640 :购自GIBCO公司。2、人慢性髓性白血病细胞系K562和巨核细胞白血病细胞系MEG-01 (K562细胞购自中国科学院细胞库，产品目录号为TCHul91 ；MEG-OI细胞购自中国科学院细胞库，产品目录号为 TCHul97 ；)。5、6孔、24孔及96孔培养板购自Corning公司。7、突光素标记的单克隆抗体⑶Ilb-PE :购自美国Becton Dickinson公司。8、多克隆抗体VSTM1-FITC :将抗原多肽免疫兔，收集兔血清，纯化并且荧光标记 得到多克隆抗体VSTM1-FITC，抗原为VSTMl，其氨基酸序列为序列表中的序列I。下述实施例中所用主要仪器设备I、超净工作台北京半导体设备厂；2、CO2培养箱美国NAPCO牌；3、低温高速离心机GS_15R型,美国Beckman公司；4、流式细胞仪FACSort 型，美国 Becton Dickinson 公司；5、倒置光学显微镜日本Olympus公司；6、低速离心机BFX5_320型(白洋离心机厂)。下述实施例中的流式细胞检测运用带不同荧光素的抗白细胞表面抗原的抗体标记骨髓细胞，具体步骤如下(I)骨髓细胞计数取IOul样本，加适量冰醋酸裂解红细胞并稀释血细胞，显微镜下计数；(2)按照抗体说明书加适量抗体至200 μ I血样，室温(25°C)避光孵育15min ；(3)加红细胞裂解液(NH4CL I. 8675g, Tris (λ 65g蒸馏水250ml)，室温裂解8min ；(4)离心 1200rpmX IOmin,弃上清液；(5)加磷酸缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)(购自上海耕欣生物科技有限公司。)洗两遍；(6)离心1200rpmX10min，弃上清液，加200μ I PBS上流式细胞仪检测。(7)数据分析下述实施例运用FCS Express V3软件分析流式细胞术检测数据。统计分析在SPSS软件17. O中进行。经不同浓度ATRA诱导分化后不同时间点的NB4细胞VSTMl表达水平与⑶Ilb表达水平的相关性采用Pearson相关系数分析。P值小于0. 05定义为有统计学差异。
下述实施例中的VSTMl蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列I。VSTMl蛋白编码基因的核昔酸序列为序列表中的序列2。实施例I、VSTMl促进白血病细胞分化一、细胞和质粒的制备K562、MEG-01 细胞用 10%FBS/RPMI1640 (4. 5g/L glucose, 4mM L-glutamine, 100U/ml青霉素，lOOug/ml链霉素)培养，细胞复苏及传代按照常规进行。真核细胞表达质粒pcDB-VSTMl为将序列2(VSTMl蛋白编码基因)插入真核表达质粒pcDNA3. 1-Myc-his (-)B (以下简称pcDB,购自Invitrogen公司，产品目录号为V80020)的Not I和kpn I酶切位点间得到的载体。二、细胞转染转染K562、MEG-Ol细胞采用阳离子转染法，按产品说明书所述进行，操作步骤如下(I)细胞培养将K562、MEG-01细胞分别用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基铺在细胞培养板中，在5% C02、37°C的培养箱中培养4小时；(2)制备 DNA-I ipofectamine 2000 复合物用 PBS (PH7. 2，购自上海耕欣生物科技有限公司)稀释pcDB-VSTMl，缓慢混合均匀；同样用PBS稀释相应量的I ipof ectamine 2000，缓慢混合均匀，在室温(25 °C )下放置5分钟后，再与稀释的pcDB-VSTMl缓慢混合，室温放置15分钟，以形成DNA-Iipofectamine 2000复合物。
(3)转染将DNA-Iipofectamine 2000复合物缓慢滴入细胞培养板，轻微摇匀。5% C02，37°C的培养箱中培养。转染第二天加入G418800 μ g/ml筛选，后以400 μ g/ml维持，待长出细胞克隆后挑取克隆，经扩增培养后用于实验，分别得到转染pcDB-VSTMl的K562细胞和转染pcDB-VSTMl的MEG-Ol细胞；都经过提取质粒测序验证正确。采用同样的方法将空载体pcDB-null分别转染K562细胞和MEG-01细胞，分别得到转染pcDB-null的K562细胞和转染pcDB-null的MEG-01细胞。三、检测I、转染细胞VSTMl的mRNA的表达水平检测收获转染30天的转染pcDB-VSTMl的K562细胞和转染pcDB-VSTMl的MEG-01细胞，提取总RNA，逆转录为cDNA，运用实时定量RCR检测VSTMl的表达水平。反转录得到cDNA作为模板，利用上游引物 VSTMl-FP :5’ -GCCGAGGCAGATTTATCCAA-3’ ；下游引物 VSTMl-RP 5，-CCTGGGTGGTGTCTGAAGCT-3，；探针 VSTMl-probe 5’ -FAM-CTCGACGGCAGACCCCCAAGG-BHQ-3,进行实时定量 PCR 扩增，以 ABL为内参基因，内参的引物、探针为上游引物ABLl-F :5’ -TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3，；ABL1_R :5，-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’ ；探针 ABLl-T-probe(5’一 3’)FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT - TAMRA。VSTMl 的表达水平以 VSTM1/ABL表示。以转染pcDB-null的K562细胞、转染pcDB-null的MEG-01细胞为对照。结果如下转染pcDB-VSTMl的K562细胞中VSTMl的相对表达量为13. 323 ；转染pcDB-VSTMl的MEG-01细胞中VSTMl的相对表达量为9. 971 ；转染pcDB-null的K562细胞中VSTMl的相对表达量为0. 000 ；转染pcDB-null的MEG-01细胞中VSTMl的相对表达量为0. 000。2、转染细胞VSTMl蛋白表达水平检测收获转染30天的转染pcDB-VSTMl的K562细胞和转染pcDB-VSTMl的MEG-01细胞，PBS洗两遍后，加带荧光素标记的抗VSTMl抗体(VSTM1-FITC)标记转染细胞，转染细胞VSTMl的表达水平以表达VSTMl的阳性细胞百分比和VSTMl的平均荧光强度表示。以转染pcDB-null的K562细胞和转染pcDB-null的MEG-01细胞为对照。检测方法采用上述的流式细胞检测，抗体为VSTM1-FITC。结果如图I所示，转染pcDB-VSTMl的K562细胞中VSTMl的阳性细胞百分比和平均荧光强分别为70. 77%和318. 30 ；转染pcDB-VSTMl的MEG-01细胞中VSTMl的阳性细胞百分比和平均荧光强分别为69. 65% 和 214. 26 ；转染pcDB-null的K562细胞中VSTMl的阳性细胞百分比和平均荧光强分别为3. 79% 和 72. 84 ；转染pcDB-null的MEG-01细胞中VSTMl的阳性细胞百分比和平均荧光强分别为
O.61% 和 39. 94。从上述可以看出，VSTMl被成功转染并表达于K562及MEG-Ol细胞表面。与转染不含VSTMl基因的空载体(pcDB-null)相比，转染携带VSTMl基因的真核表达载体(pcDB-VSTMl)的K562及MEG-Ol的VSTMl表达阳性率分别上升67%和69%。
四、VSTMl促进白血病细胞分化由于VSTMl的表达与髓系细胞的分化有关，为观察VSTMl对细胞分化的影响，转染30天的转染pcDB-VSTMl的K562细胞用流式细胞检测髓系细胞成熟的常见细胞表面分化抗原CDllb表达水平的变化，CDllb为细胞分化的标志物，表达量越高，分化程度越高。具体步骤如下(I)收获细胞系，细胞计数；(2) PBS洗两遍，用200 μ IPBS重悬细胞；(3)按照抗体说明书加适量抗体至上述细胞悬液，室温(25°C)避光孵育15min ；(4)加 PBS 洗两遍；(5)离心1200rpmX10min，弃上清液，加200 μ I PBS上流式细胞仪检测。(6)数据分析。检测方法采用上述的流式细胞检测，抗体为CDllb-PE。以转染pcDB-null的K562细胞、转染前的K562细胞为对照。结果如图2所示，转染前的K562细胞中VSTMl和⑶Ilb的阳性细胞百分比分别为
O.33%和 2. 61% ；转染前的K562细胞中VSTMl和CDllb的平均荧光强度分别为26. 93和6. 22 ；转染pcDB-null的K562细胞中VSTMl和CDllb的阳性细胞百分比分别为3. 79%和 2. 97% ；转染pcDB-null的K562细胞中VSTMl和CDllb的平均荧光强度分别为72. 84和31. 38 ；转染pcDB-VSTMl的K562细胞中VSTMl和CDllb的阳性细胞百分比分别为70. 77%和 20. 51%转染pcDB-VSTMl的K562细胞中VSTMl和CDllb的平均荧光强度分别为318. 3和77. 93 ；可以看出，转染VSTMl后，⑶Ilb的表达水平随VSTMl的表达升高而升高。转染VSTMl后，K562细胞⑶Ilb的表达水平随VSTMl表达升高而升高。说明VSTMl不仅是髓系细胞分化过程中伴随出现的分子标志物，而且促进细胞表面分化抗原CDllb的表达，说明VSTMl参与调控髓系细胞的分化。VSTMl基因与骨髓细胞的分化有关，为明确VSTMl表达升高是骨髓细胞分化过程中的伴随现象还是参与了骨髓细胞分化的机制，研究了 VSTMl在骨髓细胞中的作用。通过体外转染携带VSTMl基因的真核表达质粒，结果发现，被转染的K562细胞CDllb的表达与VSTMl的表达量呈正相关。提示VSTMl不仅是髓系细胞分化中的标志物，而且可能在细胞分
化中发挥一定作用。
权利要求
1.如下1)-5)中任--种物质在制备促进白血病细胞分化和/或治疗白血病产品中的应用 I)>VSTMl蛋白；2)VSTM1蛋白编码基因；3)含有所述VSTMl蛋白编码基因的重组载体；4)含有所述VSTMl蛋白编码基因的表达盒；5)含有所述VSTMl蛋白编码基因的转基因细胞系; 所述VSTMl蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列I。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述VSTMl蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2。
3.根据权利要求I或2所述的应用，其特征在于所述含有所述VSTMl蛋白编码基因的重组载体为将所述VSTMl蛋白编码基因插入表达载体中得到的重组载体。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于所述含有所述VSTMl蛋白编码基因的转基因细胞系为将所述重组载体转入目的细胞得到的转基因细胞系。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述白血病细胞和所述目的细胞均为慢性髓性白血病细胞或巨核细胞白血病细胞系；所述慢性髓性白血病细胞系具体为K562细胞；所述巨核细胞白血病细胞具体为MEG-Ol细胞； 所述促进白血病细胞分化通过促进白血病细胞表面分化抗原CDllb表达体现。
6.如下I)-5)中任种物质在制备促进白血病细胞表面分化抗原⑶Ilb表达产品中的应用 I)>VSTMl蛋白；2)VSTM1蛋白编码基因；3)含有所述VSTMl蛋白编码基因的重组载体；4)含有所述VSTMl蛋白编码基因的表达盒；5)含有所述VSTMl蛋白编码基因的转基因细胞系; 所述VSTMl蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列I ;所述VSTMl蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述含有所述VSTMl蛋白编码基因的重组载体为将所述VSTMl蛋白编码基因插入表达载体中得到的重组载体； 所述含有所述VSTMl蛋白编码基因的转基因细胞系为将所述重组载体转入目的细胞得到的转基因细胞系。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述白血病细胞和所述目的细胞均为慢性髓性白血病细胞或巨核细胞白血病细胞系；所述慢性髓性白血病细胞系具体为K562细胞；所述巨核细胞白血病细胞具体为MEG-Ol细胞。
9.一种制备促进白细胞分化、促进白血病细胞表面分化抗原CDllb表达和/或治疗白血病产品，为权利要求1-8中任一所述的应用中的所述I) -5)中任--种物质。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于所述白血病细胞为慢性髓性白血病细胞或巨核细胞白血病细胞系；所述慢性髓性白血病细胞系具体为K562细胞；所述巨核细胞白血病细胞具体为MEG-Ol细胞。
全文摘要
本发明公开了一种VSTM1蛋白在制备促进白血病细胞分化产品中的应用。本发明提供的如下1)-5)中任一一种物质在制备促进白血病细胞分化产品中的应用1)、VSTM1蛋白；2)VSTM1蛋白编码基因；3)含有所述VSTM1蛋白编码基因的重组载体；4)含有所述VSTM1蛋白编码基因的表达盒；5)含有所述VSTM1蛋白编码基因的转基因细胞系；所述VSTM1蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1。本发明的实验证明，本发明说明该蛋白可以促进细胞分化，可用于白血病治疗，尤其是为耐化疗药白血病的研究和治疗提供了新的途径。
文档编号A61K48/00GK102757938SQ20121026561
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者冷馨, 刘艳荣, 李婷, 王绪华, 谢敏, 阮国瑞, 陈珊珊, 韩文玲, 马大龙, 黄晓军 申请人:北京大学人民医院