一种肿瘤相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：一种肿瘤相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
蛋白酪氨酸激酶受体(PTKR)在各种细胞调控水平及肌体不同发育阶段中起着重要作用，比如参与细胞的增殖、分化及抗凋亡等过程(Hunter T.Signaling2000and beyond.Cell 2000；100113-27；Schlessinger J.Cell signaling byreceptor tyrosine kinases.Cell 2000；103211-25)。典型的PTKR结构表现为细胞脂质双分子层上的单跨膜蛋白，分为胞外区、跨膜区及胞内区。胞外区具有相应配体的特异性识别位点，在结合配体过程中起重要作用。胞内区含有酪氨酸激酶功能域，参与胞内的信号转导及受体、衔接蛋白的磷酸化过程，特别是有丝分裂原的信号转导(Blume-Jensen P，Hunter T.Oncogenic kinase signalling.Nature 2001；411355-65)。PTKR在细胞内的异常表达常会导致遗传疾病及肿瘤(Powers CJ，McLeskey SW，Wellstein A.Fibroblast growth factors，theirreceptors and signaling.Endocr Relat Cancer 2000；7165-97)。因此，PTKR蛋白的表达在肌体内受到严格调控(Hubbard SR，Mohammadi M，Schlessinger J.Autoregulatory mechanisms in protein tyrosine kinases.J Biol Chem1998；27311987-90)。目前为止，至少有18种PTKR与肿瘤转化有关，可作为癌基因(Blume-Jensen P，Hunter T.Oncogenic kinase signalling.Nature2001；411355-65)。重要的实例包括成纤维生长因子受体(FGFR)、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板来源的生长因子受体(PDGFR)、胰岛素受体(InsR)和肝细胞生长因子受体(Met)等。
研究显示部分PTKR异常剪接变异体与肿瘤的发生相关。比如从人骨肉瘤及乳腺癌细胞可分离到缺少全部跨膜区的可溶性FGFR3分子(Johnston CL，Cox HC，Gomm JJ，Coombes RC.Fibroblast growth factor receptors(FGFRs)localizein different cellular compartmentsa splice variant of FGFR-3 localizesto the nucleus.J Biol Chem 1995；27030643-50；Jang JH.Identificationand characterization of soluble isoform of fibroblast growth factorreceptor 3 in human SaOS-2 osteosarcoma cells.Biochem Biophys Res Commun2002；292378-82)。而在胃癌细胞中，一种符合蛋白编码的49氨基酸的缺失可导致Ron酪氨酸受体的组成性激活(Collesi C，Santoro MM，Gaudino G，Comoglio PM.A splicing variant of the RON transcript induces constitutive tyrosinekinase activity and an invasive phenotype.Mol Cell Biol1996；165518-26)。最近从脑垂体肿瘤中人们分离到一种新型FGFR4剪接变异体，被称做ptd-FGFR4(Ezzat S，Zheng L，Zhu XF，Wu GE，Asa SL.Targeted expressionof a human pituitary tumor-derived isoform of FGF receptor-4 recapitulatespituitary tumorigenesis.J Clin Investig 2002；10969-78)。这种剪接变异体缺少几乎全部的FGFR4受体胞外区，并且不包含信号肽，导致该成熟蛋白仅在胞浆表达。过量表达ptd-FGFR4可导致细胞转化。通过转基因方式在小鼠体内进行组织特异性表达可形成垂体瘤。另外，利用N端和C端特异性抗体，人们发现部分恶性肌骨骼瘤临床病人样品中也有N端缺失的Met受体表达(Wallenius V，Hisaoka M，Helou K，et al.Overexpression of the hepatocyte growth factor(HGF)receptor(Met)and presence of a truncated and activated intracellular HGFreceptor fragment in locally aggressive/malignant human musculoskeletaltumors.Am J Pathol 2000；156821-9)。

发明内容
本发明的目的是提供一种肿瘤相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的肿瘤相关蛋白，名称为NOK(Novel Oncogene Protein withKinase-domain)，来源于人属人(Homo sapiens)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤相关的蛋白质。
序列表中的序列2由422个氨基酸残基组成，自氨基端第105位-327位氨基酸残基为典型的酪氨酸激酶功能域。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
本发明的肿瘤相关蛋白的编码基因NOK也属于本发明的保护范围。
所述肿瘤相关蛋白的编码基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的序列1由1269个脱氧核苷酸组成，其编码序列为自序列1的5′端第1位至1269位脱氧核苷酸。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有NOK的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增NOK中任一片段的引物也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供NOK的抗原表位及利用该抗原表位制备的单克隆抗体及多克隆抗体。
本发明所提供的NOK的抗原表位，是具有下述氨基酸残基序列的多肽1)序列表中的SEQ ID №4；2)将序列表中SEQ ID №4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与以本发明的肿瘤相关蛋白为抗原制备的抗体结合的多肽。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
序列表中的序列4由21个氨基酸残基组成，是序列2的自氨基端第360位-380位氨基酸残基。
该NOK的抗原表位的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述NOK的抗原表位的编码基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3(即自序列1的5′端第1078位至1140位碱基)的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №4多肽序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能多肽的DNA序列。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有该NOK的抗原表位的编码基因的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
由该NOK的抗原表位制备的多克隆和单克隆抗体均属于本发明的保护范围。
本发明的NOK在B淋巴细胞肿瘤、头颈部鳞癌、多种胃肠道肿瘤及皮肤癌中特异性高表达，因此NOK蛋白可以作为B淋巴细胞肿瘤、头颈部鳞癌、多种胃肠道肿瘤及皮肤癌诊断治疗的潜在靶点，并由此开发相关抗肿瘤药物及临床诊断试剂盒。本发明的NOK抗原表位可用于制备肿瘤诊断试剂盒，也可作为多肽药物用于抗肿瘤治疗。


图1为NOK蛋白疏水区预测结果图2为预测的NOK蛋白的二级结构图3为Western Blot检测用预测的NOK表位制备的抗体的特异性图4A为用NOK抗体对野生型裸鼠的肝脏切片进行免疫组织化学检测的照片图4B为用NOK抗体对BaF3-NOK注射裸鼠的肝脏切片进行免疫组织化学检测的照片图5为NOK转基因鼠肾和肺呈现淋巴样肿瘤细胞浸润的照片图6为用NOK抗体对NOK转基因鼠肾和肺进行免疫组织化学染色的照片图7为用NOK抗体对接种NOK转基因鼠淋巴结细胞的裸鼠的肝脏进行免疫组化染色的照片图8A为用NOK抗体分析NOK基因在舌鳞状上皮细胞癌组织中表达的照片图8B为用NOK抗体分析NOK基因在颊面部鳞癌组织中表达的照片图8C为以PBS代替NOK抗体分析NOK基因在舌鳞状上皮细胞癌组织中表达的照片图8D为以PBS代替NOK抗体分析NOK基因在颊面部鳞癌组织中表达的照片图9为用NOK肿瘤组织芯片分析NOK基因在甲状腺腺癌、结肠腺癌、皮肤鳞癌和直肠腺癌肿瘤组织中表达的照片具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、NOK及其编码基因的获得
NOK全长cDNA从人扁桃体肿瘤总RNA中经RT-PCR获得，具体步骤如下按常规方法提取人扁桃体肿瘤总RNA，然后以5′-TATAAAGCTTATGGGCATGACACGGATGCT-3′和5′-TATACTCGAGTCAAAGCATGCTATAGTTGT-3′为引物，反应条件按照一步法RT-PCR的使用说明进行(Takara)，得到的PCR产物纯化后直接亚克隆到pT-A载体(购自Promega公司)，得到质粒pT-A-NOK，酶切鉴定后再进行测序。测序结果表明NOK基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的NOK。
实施例2、NOK抗原表位的获得及特异性抗体的制备1、NOK抗原表位的预测及特异性抗体的制备用Kyte-Doolittle软件对NOK氨基酸序列的疏水性及亲水性进行分析，结果表明自序列2的氨基端第60-80位氨基酸残基及360-380位氨基酸残基片段亲水性最强(图1)。在用nnpredict方法预测NOK蛋白的二级结构(图2)的基础上，用3D-PSSM Web Server V 2.6.0软件进一步对NOK蛋白的三维结构进行预测，结果表明自序列2的氨基端第360-380位氨基酸残基片段位于表面的可能性较自序列2的氨基端第60-80位氨基酸残基片段大，因此，选择SEQ ID No.4为潜在最佳表位制备抗体。此21氨基酸多肽由北京赛百盛有限公司协助合成。合成的多肽与缩苹果酰胺(maleimide)活化的钥孔嘁血蓝素(keyhole limpet hemocyanin，KLH)在标准条件下进行交联(按PIERCE公司试剂盒实验步骤进行)。100μg交联产物与0.5ml弗氏完全佐剂充分混合后皮下注射一只2kg新西兰大白兔，每隔两周以100μg交联产物与0.5ml弗氏不完全佐剂混合后加强免疫，共加强两次。6周后，由颈动脉获取全血，制备抗血清，用辛酸-硫酸铵法从抗血清中纯化NOK多克隆抗体。
2、NOK抗原表位及特异性抗体的验证为检测NOK抗体的特异性，将pT-A-NOK经HindIII/XhoI双酶切后亚克隆到质粒pcDNA3.0的HindIII和XhoI识别位点间，构建NOK真核表达载体pcDNA3.0-NOK。通过瞬时转染的方法在293T细胞中表达，以转染空载体pcDNA3.0为阴性对照。转染48小时后，制备全细胞裂解液。每个样品取15μg蛋白经10％SDS-PAGE分离后转到硝酸纤维素膜上。封闭后，以1∶4000稀释度的NOK抗体为一抗进行杂交，以荧光素(florescein)标记的羊源抗兔抗体(AmershamBiosciences UK Limited)为二抗，最后用ECF化学发光的底物进行杂交信号放大，结果如图3所示，用pcDNA3.0-NOK转染的样品，有一条45kDa(图3中标出的43kDa为标准蛋白标记)的特异性条带，而pcDNA3.0转染的样品无该条带，说明NOK抗体的制备是成功的。为进一步验证NOK抗体在免疫组织化学检测中的有效性。首先制备了可持续表达NOK基因的BaF3稳定细胞系-BaF3-NOK。具体的方法是，离心富集1×106个BaF3细胞，重悬于0.5ml无血清RPMI-1640培养液。将3μg pcDNA3.0-NOK与BaF3细胞混合，冰浴10分钟后，用ECM399(BTX公司)电转仪进行电转。电转条件为200-230V，电流为25-35毫秒。电转染后的细胞在RPMI-1640全培养基中生长。由于质粒pcDNA3携带新酶素抗性基因，稳定细胞可在500μg/ml G418下进行筛选。每三天换一次液，连续培养三周后，在100mm培养皿中进行扩增。在药物G418的筛选下获得稳定外源基因的表达的细胞系BaF3-NOK。
用NOK抗体对BaF3-NOK接种裸鼠的肝脏组织切片进行免疫组织化学检测采用1∶800稀释度的NOK抗体为一抗孵育条件为4℃过夜。0.1％Tween-PBS洗10分钟×2次。滴加生物素标记二抗(羊抗兔IgG)工作液，室温孵育10分钟；肝细胞癌组织切片滴加增强液室温20分钟，PBS洗5分钟×3次，滴加辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG聚合物室温30分钟，PBS洗5分钟×3次，DAB显色，蒸馏水洗终止显色。结果如图4A和图4B所示，表明肝脏转移灶中的肿瘤细胞NOK基因的表达呈强阳性，而转移灶旁正常肝脏组织为阴性。图4B中，右下角的方框为右上角方框的放大图。
实施例3、验证NOK与肿瘤相关的动物实验质粒pcDNA3.0-NOK经NruI/DraI双酶切后，1％琼脂糖电泳分离，胶回收2574bp片段。该片段含有完整的NOK基因表达盒，采用CMV启动子及SV40的多聚腺苷酸信号。将纯化的2574bp片段DNA通过显微注射到昆明鼠受精卵的原核中。将注射好的受精卵植入受体鼠的输卵管中。术后19-21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，并抽提鼠尾基因组DNA。产生的首建鼠(Founder)经基因组PCR检测为阳性后，与野生型昆明鼠回交，然后不断自交，以获得纯合的基因型转基因子代鼠。剪取自交每代3周龄的转基因鼠尾约1cm，加入600μl鼠尾DNA裂解缓冲液TNES(0.6％SDS，0.4M NaCl，0.1M EDTA，0.01M Tris，pH7.5)及35μ蛋白酶K(10mg/ml)。混匀后，56℃过夜消化。加入150μl 6M NaCl混合后，以95％乙醇沉淀，溶于无菌水中，得到基因组DNA。分别以每只自交每代转基因鼠基因组DNA为模板，分别在5′端引物对和3′端引物对的引导下，分别PCR扩增CMV启动子525位碱基至NOK基因编码序列140位碱基和NOK基因编码序列981位碱基至BGH加尾序列的222位碱基。其中，5′端引物对为CMV525-554(5′-tggcccgcctggcattatgcccagtacatg-3′)和FR4b111-140(5′agccacaggatgaccccaagaaggatgagg-3′)；3′端引物对为FR4b981-1010(5′tcctgaagtccctcctaccagcatcctaga-3′)和BGH1210-1240(5′-tcttcccaatcctcccccttgctgtcctgc-3′)；基因组PCR扩增反应条件为，95℃退火5分钟，然后进入35个循环的扩增，每个循环的扩增条件为94℃，30秒；72℃，2分钟。最后72℃延伸10分钟。扩增结果表明，自交转基因鼠的基因组DNA用5′端引物对扩增得到了518bp片段，用3′端引物对扩增得到了583bp片段，说明自交转基因鼠阳性率为100％。
阳性NOK基因转基因鼠中有＞50％呈现多种临床表型，主要常见表型为头颈部瘙痒、淋巴结肿大、腹胀、皮肤结痂、肢体发育异常如关节肿大等；30-40％行走异常，甚至个别(0.5％)有鼠肢体痉挛的现象。对阳性NOK基因转基因鼠的组织解剖显示，基因组PCR检测为阳性的鼠浅表淋巴结如颈淋巴结、腋下淋巴结、腹股沟淋巴结呈现不同程度的肿大，尤以颈淋巴结和腋下淋巴结肿大常见；胸腔内肺脏常呈现散在斑点、花斑样、大面积甚至全肺叶实变；常见肺门淋巴结肿大，偶见胸腺肿大；腹腔内常见肝脾色泽病理性改变，呈斑点状或花斑样改变，肿大等；肠系膜淋巴结呈现不同程度的肿大，晚期病变状态更加明显，甚至肾脏呈现大面积浸润灶；对主要脏器如肝、脾、淋巴、肾、胃、肺、心、脑、直肠、结肠、骨骼肌等用4％福尔马林固定，HE染色显示脾脏、肺脏、淋巴结、及肝脏等组织最常出现淋巴样肿瘤细胞大面积浸润(图5，箭头示淋巴样肿瘤细胞)。用实施例2制备的NOK抗体，按照实施例2用NOK抗体对BaF3-NOK接种裸鼠的肝脏组织切片进行免疫组织化学检测的方法，对肺和肾进行免疫组织化学分析，结果表明浸润灶内的淋巴样细胞为NOK阳性细胞(图6，箭头示NOK阳性细胞)。将显著肿大的淋巴结制备成细胞悬液后，皮下接种裸鼠。结果注射细胞很快形成远处脏器转移，导致动物死亡；表现为肝、脾、肾、淋巴结肿大，HE染色显示大量淋巴样细胞浸润，免疫组织化学染色结果表明该淋巴样细胞为NOK基因表达阳性(图7，箭头示NOK阳性细胞)。
实施例4、NOK肿瘤组织芯片杂交显示NOK基因在多种头颈部肿瘤及实体瘤中高表达肿瘤组织芯片由超英生物科技有限公司提供，系统检测了135点头颈部鳞癌组织，以及108点多种器官(其中包括肝、胃、食道、肾、脑、子宫、结肠、乳腺、肌肉、舌、肺、直肠、膀胱、甲状腺、胰腺、皮肤、卵巢等)肿瘤组织样品及舌粘膜及齿龈粘膜正常组织样品。将实施例2制备的NOK抗体进行1000倍稀释，孵育条件为4℃12小时；阴性对照用PBS代替一抗，其余条件同实验组。切片抗原预处理条件为0.01M柠檬酸盐缓冲液(柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g，水1000ml，pH6.0)缓慢加压及高温浸泡5分钟，用18cm不锈钢高压锅对玻片进行高压处理10分钟。免疫组织化学方法采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法(超敏SP法)(链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组织化学染色超敏试剂盒购自中杉公司)。以3％H2O2封闭内源性过氧化物酶，以非免疫羊血清封闭非特异性位点，以生物素封闭内源性生物素。检测结果显示，NOK基因在舌鳞状上皮细胞癌、颊面部鳞癌及喉鳞状上皮细胞癌等组织中呈高表达趋势(图8A，图8B，图8C和图8D)。图8A中，方框示NOK高表达细胞，左上角方框位中间方框的放大图；图8B中，箭头示NOK高表达细胞。图8C和图8D分别是以PBS代替NOK抗体进行的免疫组化结果。并且，在高分化、中分化及低分化的舌鳞状上皮细胞癌中，NOK基因表达呈递增的趋势，提示NOK基因与该肿瘤的恶性程度可能存在正相关的关系。另外，NOK基因在甲状腺腺癌、结肠腺癌、皮肤鳞癌、直肠腺癌、及胃粘液细胞癌等组织中也呈现特异性高表达的现象(图9)，预示NOK基因在这些肿瘤的发生过程中发挥重要作用。图9中，箭头示NOK高表达细胞。
序列表<160>4<210>1<211>1269<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>1atgggcatga cacggatgct cctggaatgc agtctcagtg acaagttgtg tgtcatccag 60gagaagcagt atgaagtgat tatcgtccca actttgttgg ttactatctt cctcatcctt120cttggggtca tcctgtggct ttttatcaga gaacaaagaa ctcaacagca gcgttctgga180cctcaaggca ttgcccctgt tcctccacct agggacctaa gctgggaagc aggacatgga240ggaaatgtgg ctttgccact taaggagaca tccgtggaaa actttctggg agctaccaca300cctgccctgg ctaagctgca ggtgccgcgg gagcaactct ctgaagttct ggagcagatt360tgcagcggta gctgtgggcc catctttcga gccaatatga acactgggga cccttctaag420cccaagagtg ttattctcaa ggctttaaaa gaaccagctg ggctccatga ggtacaagat480ttcttagggc gaatccaatt ccatcaatac ctggggaaac acaaaaacct ggtgcagctg540gaaggctgct gcactgaaaa gctgccactc tatgtggtgt tggaggatgt ggcccagggg600gacctgctta gctttctctg gacctgtcgg cgggatgtga tgactatgga tggtcttctc660tatgatctca cagaaaaaca agtatatcac atcggaaagc aggtcctttt ggcgctggaa720ttcctgcagg agaagcattt gttccatggg gatgtggcag ccaggaatat tctgatgcaa780agtgatctca ctgctaagct ctgtggatta ggcctggctt atgaagttta cacccgaggg840gccatctcct ctactcaaac catacctctc aagtggcttg ccccagaacg gcttctcctg900agacctgctc gcatcagagc agatgtctgg tcttttggga tcctgctcta tgagatggtg960actctaggag caccaccgta tcctgaagtc cctcctacca gcatcctaga gcatctccaa 1020agaaggaaaa tcatgaagag acccagtagc tgcacacata ccatgtacag tatcatgaag 1080tcctgctggc gctggcgtga ggctgaccgc ccctcaccta gagagctgcg cttgcgccta 1140gaagctgcca ttaaaactgc agatgacgag gctgtgttac aagtaccaga gttggtggta 1200cctgaactgt atgcagctgt ggccggcatc agagtggaga gcctcttcta caactatagc 1260
atgctttga 1269<210>2<211>422<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)<400>2Met Gly Met Thr Arg Met Leu Leu Glu Cys Ser Leu Ser Asp Lys Leu1 5 10 15Cys Val Ile Gln Glu Lys Gln Tyr Glu Val Ile Ile Val Pro Thr Leu20 25 30Leu Val Thr Ile Phe Leu Ile Leu Leu Gly Val Ile Leu Trp Leu Phe35 40 45Ile Arg Glu Gln Arg Thr Gln Gln Gln Arg Ser Gly Pro Gln Gly Ile50 55 60Ala Pro Val Pro Pro Pro Arg Asp Leu Ser Trp Glu Ala Gly His Gly65 70 75 80Gly Asn Val Ala Leu Pro Leu Lys Glu Thr Ser Val Glu Asn Phe Leu85 90 95Gly Ala Thr Thr Pro Ala Leu Ala Lys Leu Gln Val Pro Arg Glu Gln100 105 110Leu Ser Glu Val Leu Glu Gln Ile Cys Ser Gly Ser Cys Gly Pro Ile115 120 125Phe Arg Ala Asn Met Asn Thr Gly Asp Pro Ser Lys Pro Lys Ser Val130 135 140Ile Leu Lys Ala Leu Lys Glu Pro Ala Gly Leu His Glu Val Gln Asp145 150 155 160Phe Leu Gly Arg Ile Gln Phe His Gln Tyr Leu Gly Lys His Lys Asn165 170 175Leu Val Gln Leu Glu Gly Cys Cys Thr Glu Lys Leu Pro Leu Tyr Val
180 185 190Val Leu Glu Asp Val Ala Gln Gly Asp Leu Leu Ser Phe Leu Trp Thr195 200 205Cys Arg Arg Asp Val Met Thr Met Asp Gly Leu Leu Tyr Asp Leu Thr210 215 220Glu Lys Gln Val Tyr His Ile Gly Lys Gln Val Leu Leu Ala Leu Glu225 230 235 240Phe Leu Gln Glu Lys His Leu Phe His Gly Asp Val Ala Ala Arg Asn245 250 255Ile Leu Met Gln Ser Asp Leu Thr Ala Lys Leu Cys Gly Leu Gly Leu260 265 270Ala Tyr Glu Val Tyr Thr Arg Gly Ala Ile Ser Ser Thr Gln Thr Ile275 280 285Pro Leu Lys Trp Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Leu Arg Pro Ala Arg290 295 300Ile Arg Ala Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Tyr Glu Met Val305 310 315 320Thr Leu Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Glu Val Pro Pro Thr Ser Ile Leu325 330 335Glu His Leu Gln Arg Arg Lys Ile Met Lys Arg Pro Ser Ser Cys Thr340 345 350His Thr Met Tyr Ser Ile Met Lys Ser Cys Trp Arg Trp Arg Glu Ala355 360 365Asp Arg Pro Ser Pro Arg Glu Leu Arg Leu Arg Leu Glu Ala Ala Ile370 375 380Lys Thr Ala Asp Asp Glu Ala Val Leu Gln Val Pro Glu Leu Val Val385 390 395 400Pro Glu Leu Tyr Ala Ala Val Ala Gly Ile Arg Val Glu Ser Leu Phe405 410 415Tyr Asn Tyr Ser Met Leu420
<210>3<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3aagtcctgct ggcgctggcg tgaggctgac cgcccctcac ctagagagct gcgcttgcgc60cta 63<210>4<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Lys Ser Cys Trp Arg Trp Arg Glu Ala Asp Arg Pro Ser Pro Arg Glu1 5 10 15Leu Arg Leu Arg Leu20
权利要求
1.肿瘤相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤相关的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的肿瘤相关蛋白，其特征在于所述序列表中序列2的自氨基端第105位-327位氨基酸残基为酪氨酸激酶功能域。
3.权利要求1或2所述的肿瘤相关蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述肿瘤相关蛋白的编码基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
5.含有权利要求3所述的肿瘤相关蛋白的编码基因的表达载体，细胞系和宿主菌。
6.权利要求1或2所述的肿瘤相关蛋白的抗原表位，是具有下述氨基酸残基序列的多肽1)序列表中的SEQ ID №4；2)将序列表中SEQ ID №4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与以所述肿瘤相关蛋白为抗原制备的抗体结合的多肽。
7.权利要求6所述的肿瘤相关蛋白的抗原表位的编码基因。
8.根据权利要求7所述的基因，其特征在于所述抗原表位的编码基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №4多肽序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能多肽的DNA序列。
9.含有权利要求7所述的抗原表位的编码基因的表达载体，细胞系和宿主菌。
10.由权利要求6所述的肿瘤相关蛋白的抗原表位制备的多克隆和单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种肿瘤相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的肿瘤相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤相关的蛋白质。本发明还提供了该肿瘤相关蛋白的抗原表位。本发明的肿瘤相关蛋白可以作为B淋巴细胞肿瘤、头颈部鳞癌、多种胃肠道肿瘤及皮肤癌诊断治疗的潜在靶点，并由此开发相关抗肿瘤药物及临床诊断试剂盒。本发明的肿瘤相关蛋白的抗原表位可用于制备肿瘤诊断试剂盒，也可作为多肽药物用于抗肿瘤治疗。
文档编号C12N15/12GK1730490SQ20051008896
公开日2006年2月8日 申请日期2005年8月3日 优先权日2005年8月3日
发明者刘力, 陈钺, 李颖华, 傅新元, 常智杰, 张淑平 申请人:清华大学