专利名称：萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法
技术领域：
本发明涉及谷胱甘肽萃取技术领域，具体涉及一种萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法。
背景技术：
谷胱甘肽(Glutathion，简称GSH)是由谷氨酸半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而 成的三肽化合物，是一种用途广泛的活性短肽。谷胱甘肽具有抗氧化、清除自由基、解毒、增 强免疫力、延缓衰老、抗癌、抗放射线危害等功能，是重要的功能因子，在食品工业、医药工 业中应用非常广泛。由于谷胱甘肽本身的解毒和抗氧化能力，使得谷胱甘肽具有重要的保 肝护肝作用。临床上应用还原型谷胱甘肽作为保肝的重要药物成分。自1938年发表了由 酵母备制谷胱甘肽的最早专利以来，还原型谷胱甘肽在临床上有着广泛的应用，它能够防 止皮肤色素沉积、改善皮肤光泽，是治疗肝病、重金属中毒、放射性损伤、肿瘤、白内障等疾 病的有效药物，最近还发现谷胱甘肽可能具有抗艾滋病毒的功效。谷胱甘肽现在已广泛运 用于食品加工的各个领域，在日本谷胱甘肽被认为是21世纪最有希望的保健食品之一。谷 胱甘肽作为一种重要的氨基酸类生化药物，随着人们在食品添加剂、临床医学和运动营养 学上对它的兴趣日益增长，市场需求量不断增加。随着近年来分离技术在生命科学、天然药物提纯及各类抗生素药物等方面应用的 迅速发展，各种萃取技术应运而生。对于生物物质来说，分离的对象复杂，既包括可溶物，如 蛋白质和核酸，也包括悬浮的小颗粒，如细胞器和整个细胞；由于生物物质极易变性和失 活，给分离带来很大的难度。并且，发酵液黏度高，菌液分离困难；发酵液成分复杂，提取纯 化成本高。目前适合高黏发酵液除菌的方法有高速离心法、絮凝法和微孔滤膜法等。絮凝 法成本过高，且除杂不彻底；由于谷胱甘肽分子大小与菌体较为接近，微孔滤膜法较难有效 实现谷胱甘肽与菌体的分离，并膜污染严重、清洗困难等问题；高速离心较难分离菌液杂蛋 白，并且成本高、能耗大，难以应用于工业化生产。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种操作简单、(常温)条件温 和、选择性高、收率高、能耗较小、有机溶剂残留少，能实现快速分离、易于进行连续化操作 的萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法。为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案一种萃取酵母菌中的谷胱甘肽的 方法，其特征在于用双水相溶液萃取从酵母菌液中萃取谷胱甘肽，所述的双水相溶液为 PEG/Na2C03双水相溶液，所述的PEG/Na2C03双水相溶液的PEG质量浓度为20%_60%，Na2CO3 浓度为0. 3mol/L-l. 5mol/L，萃取温度为20°C _40°C，萃取pH值为6-10。本发明进一步设置为所述的PEG/Na2C03双水相溶液PEG浓度39%，Na2CO3浓度为 0. 6mol/L，萃取pH值为9，温度32°C。本发明PEG分子量为600或1000或2000或4000或6000。
本发明萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法包括以下步骤
1)、将冰冻状态下的酵母菌液在常温下解冻，破碎，将酵母菌悬液于4000r/min，离心 20min，沉淀，取上清液；
2)、将步骤1)的上清夜加入至PEG/Na2C03双水相溶液，并且加入Na2HPO4与NaH2PO4溶 液调整萃取PH值；
3)、将步骤2)的溶液充分混合后，静置，得到上下相谷胱甘肽萃取溶液。本发明萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法具有操作简单、(常温)条件温和、选择性 高、收率高、能耗较小、有机溶剂残留少，能实现快速分离、易于进行连续化操作等一系列 优点。
图1为本发明标准曲线的制备线性图； 图2为PEG分子量对萃取率的影响曲线图； 图3为PEG浓度对萃取率的影响曲线图； 图4为Na2CO3浓度对萃取率的影响曲线图； 图5为温度对萃取率的影响曲线图6为pH对萃取率的影响曲线图； 图7为Y=f(X1,X2)的响应面曲面图； 图8为Y=f(X1,X3)的响应面曲面图； 图9为Y=f(X2，X3)的响应面曲面图。
具体实施例方式萃取率计算方式
分配系数K=Ci/CA 相比R=vyvA 萃取率 Y=RXK/1+RXK
式中Ci为上相浓度，Cb为下相浓度，Vi为上相体积，\为下相体积。谷胱甘肽浓度的测定
标准曲线的制备(采用ALLOXAN试剂法测定GSH): GSH质量称取，分别取lmg，0. 9 mg, 0.8 mg,0. 7 mg,0. 6 mg,0. 5 mg,0. 4 mg,0. 3 mg,0. 2 mg，0.1 mg，分别加入0ml，0. 1 ml，0.2 ml,0. 3 ml, 0.4 ml, 0.5 ml, 0.6 ml, 0.7 ml, 0.8 ml, 0.9 ml 的水，配制成 1 X 1(T3，0. 9 X 1(T3， 0. 8X 1(Γ3，0· 7X 1(Γ3，0· 6X 1(Γ3，0· 5X 1(Γ3，0· 4X 1(Γ3，0· 3X 1(Γ3，0· 2X 1(Γ3，0· IX 1(T3， OX lO—W /L的GSH溶液。然后依次加入0. 24 mol /L、ρΗ7· 6的磷酸缓冲液，0. Imol /L 的甘氨酸溶液，及ALLOXAN试剂，反映20分钟后测吸光度，此吸光度再减去ALLOXAN试剂的 校正值后作GSH标准曲线如图1。如图1所示，谷胱甘肽标准溶液浓度在0-1 X 10-3mol/L之间，吸光度测定值与浓度 之间呈良好的线性关系，谷胱甘肽浓度的标准曲线方程为γ=1. 4884X+0. 0016。R^=O. 9999。 从图中可看出线性回归系数为0.9999，线性显著，所以可以作为吸光度来求谷胱甘肽浓度。酵母菌液的制备固体培养基成分蛋白胨5 g/L、酵母膏5g/L、氯化钠5 g/L、葡萄糖5 g/L、琼脂5 g/ L。调整pH为7，配制成1L。再分装成10瓶，加塞，包扎。在高压蒸汽锅里灭菌。然后在无 菌操作台中将酵母菌种接到已配好的培养基中。再将酵母菌种转移到液体培养基中，放入 冰箱冷冻保藏。从冰箱中取出酵母菌液常温下解冻，破碎，将酵母菌悬液于4000r/min，离心 20min，沉淀，取上清液。双水相萃取工艺
采取PEG/Na2C03系统，分别称取PEG和Na2CO3固体，溶解，充分混合，置于5支试管中， 得到总体积为9mL的双水相体系，并依次编号1、2、3、4、5，振动，静置15min，分层后，分别量 取上下相体积，并记录。取已制备好的酵母菌液lmL，加入双水相系统中，并且加入Na2HPO4 与NaH2PO4溶液调整萃取pH值，混合，摇勻，静置15min，分别取上下相于比色皿中，测吸光 度，再根据谷胱甘肽的标准工作曲线计算出谷胱甘肽的浓度。
单因素实验
1、PEG分子量对萃取率的影响 PEG 浓度 40%、Na2C03 浓度为 1. 5mol/L、温度 20°C、pH9. 0，PEG 分子量分别取 600、1000、 2000、4000、6000进行上述双水相萃取工艺操作。如图2所示，PEG2000到PEG6000之间萃取率相差不大，这说明PEG分子量的大小 对萃取率的影响不大，五种PEG分子量不同的试验数据中，萃取率先减小后增大最后趋于 稳定，但PEG相对分子量越小，成相所需的PEG浓度和Na2CO3浓度越高，成本也就越高。当 PEG分子量取6000时，萃取率最大。2、PEG浓度对萃取率的影响
PEG 分子量 6000、Na2C03 浓度为 1. 5mol/L、温度 20°C、pH9. 0，PEG 浓度分别取 20%、30%、 40%、50%、60%进行上述双水相萃取工艺操作。如图3所示，随着PEG6000浓度的增加，上相体积也逐渐增大，当PEG浓度取30% 时，上相体积最大，但下相谷胱甘肽浓度含量过高，造成萃取率不高，而且也不利于回收，给 后期处理工作造成负担，在浓度逐渐增加的过程中，萃取率先增大后缓慢下降，当PEG浓度 为40%时萃取率最高。3、Na2CO3浓度对萃取率的影响
PEG 分子量 6000、PEG浓度 40%、温度 20°C、pH9. 0，Na2CO3 浓度分别取 0. 3mol/L、0. 6mol/ L、0. 9mol/L、l. 2mol/L、l. 5mol/L进行上述双水相萃取工艺操作。如图4所示，Na2CO3浓度对萃取率的大小有很大的影响。当Na2CO3浓度取0. mol/ L-0. 9mol/L时，萃取率先减小后增大并在0. 9mol/L时取得最大值，当质量继续加大时，相 比逐渐减小，萃取率也迅速减小继而缓慢增加趋于平衡，当Na2CO3浓度少于0. 3mol/L,浓度 太低时容易与水和空气反应生成碳酸氢钠。4、温度对萃取率的影响
PEG 分子量 6000、PEG浓度 40%，Na2CO3 浓度为 0. 9mol/L、pH9. 0，温度分别取 20°C、25°C、 30°C、35°C、40°C进行上述双水相萃取工艺 操作。如图5所示，温度的变化对萃取率的大小有很大的影响。萃取率在温度20_25°C之间迅速减少，在温度25-30°C又逐渐增加，在温度30-35°C减小继而随着温度的增加而增 加，若温度低于20°C或温度高于40°C，Na2CO3容易结晶成块且不易溶解，当温度为20°C时， 体系分相比最大有助于相的分离，萃取率最高。5、pH对萃取率的影响
PEG 分子量 6000、PEG 浓度 40%、Na2CO3 浓度为 0. 9mol/L、温度 20°C，pH 分别取 6、7、8、 9,10进行上述双水相萃取工艺操作。如图6所示，体系的pH值对谷胱甘肽的分配有很大的影响，这是由于体系的PH值 变化能明显的改变两相的电位差。而且谷胱甘肽分子中含有羧基和氨基，PH会影响其电荷 作用而导致对其的分配影响。当PH浓度小于7时，萃取率随着pH的增加而减小，而且下相 保持较高的谷胱甘肽浓度，会增加后序工序的处理负担，当PH继续逐渐升高时，萃取率迅 速增大后减小然后趋于稳定，且在PH=S时达到最大萃取率。正交分析试验
影响双水相萃取酵母菌中谷胱甘肽的因素主要有PEG分子量，PEG浓度，Na2CO3浓度， PH，浓度等，在单因素试验的基础上，针对这些因素的影响规律，确定提取谷胱甘肽的正交 实验的提取水平，如表1，按L9(34)正交法设计试验。每组加入1 mL的酵母菌液。以谷胱 甘肽萃取率为指标，确立谷胱甘肽萃取的最佳条件。
表1双水相萃取酵母菌中的谷胱甘Ikft四因索E个水平
权利要求
一种萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法，其特征在于用双水相溶液萃取酵母菌液中的谷胱甘肽，所述的双水相溶液为PEG/Na2CO3双水相溶液，所述的PEG/Na2CO3双水相溶液的PEG质量浓度为20% 60%，Na2CO3 浓度为0.3mol/L 1.5mol/L，萃取温度为20℃ 40℃，萃取pH值为6 10。
2.根据权利要求1所述的萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法，其特征在于所述的PEG/ Na2CO3双水相溶液的PEG浓度39%，Na2CO3浓度为0. 6mol/L,萃取pH值为9，温度32°C。
3.根据权利要求1或2所述的萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法，其特征在于所述的 PEG分子量为600或1000或2000或4000或6000。
4.根据权利要求3所述的萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法，其特征在于所述的PEG 分子量为6000。
5.根据权利要求1或2或4所述的萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法，其特征在于包 括以下步骤1)、将冰冻状态下的酵母菌液在常温下解冻，破碎，将酵母菌悬液于4000r/min，离心 20min，沉淀，取上清液；2)、将步骤1)的上清液加入至PEG/Na2C03双水相溶液，并且加入Na2HPO4与NaH2PO4溶 液调整萃取PH值；3)、将步骤2)的溶液充分混合后，静置，得到上下相谷胱甘肽萃取溶液。
全文摘要
本发明涉及一种萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法，其特征在于用双水相溶液萃取酵母菌液中的谷胱甘肽，所述的双水相溶液为PEG/Na2CO3双水相溶液，所述的PEG/Na2CO3双水相溶液的PEG质量浓度为20%-60%，Na2CO3浓度为0.3mol/L-1.5mol/L，萃取温度为20℃-40℃，萃取pH值为6-10。本发明萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法具有操作简单、(常温)条件温和、选择性高、收率高、能耗较小、有机溶剂残留少,能实现快速分离、易于进行连续化操作等一系列优点。
文档编号C07K1/14GK101955509SQ20101052986
公开日2011年1月26日 申请日期2010年11月3日 优先权日2010年11月3日
发明者吴祥庭 申请人:温州大学