专利名称：一种用于制备hiv－1病毒载量测定外参照的质粒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于制备HIV-1病毒载量测定用外参照的质粒及其在HIV-1病毒载量测定上的应用。具体的说，本发明涉及利用分子生物学技术构建一种用于制备HIV-1病毒载量测定用外参照的质粒。本发明还涉及利用上述质粒建立HIV-1病毒载量测定外参照。本发明还涉及利用上述外参照在HIV-1病毒载量测定上的应用。
背景技术：
艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的破坏机体免疫系统的致死疾病。自1985年我国发现首例艾滋病人以来，该病在全国迅速蔓延，现已进入高速增长期，艾滋病的防治已成为关系到国计民生的大事。
艾滋病的临床治疗，及抗艾滋病新药和疫苗的发现与研究，需要一客观、可靠的指标来评判HIV感染者的病程和预后。已有的血清p24抗原水平检测、逆转录酶活性测定、病毒分离培养等方法也能在一定程度上反映患者体内病毒数量的变化，但以上方法干扰因素多，费时费力且灵敏度较低。大量研究表明，HIV-1病毒载量的变化是HIV-1感染者病程和预后判断的最客观依据，已商品化的定量检测HIV-1的技术有PCR(Amplicor HIV-1 Monitor test；Roche)、NASBA和b-DNA，但是这些商品化的检测试剂价格十分昂贵，技术要求高，有的方法只能在极少数实验室开展，因此难以广泛应用于临床和科学研究。为此，本发明与现有技术相比，操作简单，价格便宜，特异性好，灵敏度高，同时有较好的可重复性，将为HIV的检测以及艾滋病的诊断、防治和科学研究提供有力工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备HIV-1病毒量测定用外参照的质粒；本发明的另一目的是提供了一种制备HIV-1病毒量定量测定外参照的方法；本发明的再一目的是将此外参照应用于HIV-1病毒量测定。
在第一个方面，本发明提供了一种用于制备HIV-1病毒量定量测定的RNA外参照的重组质粒载体，其包含用引物F/R以HIV-1基因组RNA为模板反转录扩增而获得的核酸片段，其中所述引物F/R序列如下F5’-CGACT CATGG AGCAT CCTGC CTAAG-3’，R5’-ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’。
优选其中HIV-1基因组是HIV-1IIIB病毒基因组。其中所述的贺岁片段可以克隆在任何已知的能进行专利的质粒载体上从而形成本发明的重组质粒载体。优选能进行转录的质粒载体为pGEM-T vector，优选本发明的重组质粒载体为pZhcT-550。
在第二个方面，本发明提供了一种构建用于制备HIV-1病毒量定量测定的RNA外参照的重组质粒载体的引物对，其是外围引物F/R，其中所述引物F/R序列如下F5’-CGACT CATGG AGCAT CCTGC CTAAG-3’，R5’-ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’。
引物对中的两个引物可以以任何已知的方式形成引物对，如可以通过将两个引物简单混合而形成引物对；也可以形成一种试剂盒，其中包括以上两种引物，但是这两种引物并不存在物理上的接触。优选通过将两个引物以1∶1的摩尔比简单混合来形成引物对。
在第三个方面，本发明提供了一种用于制备HIV-1病毒量定量测定的RNA外参照的重组质粒载体的构建方法，其特征是，该方法包括以下步骤(1)由本发明第二个方面的引物对，以HIV-1IIIB病毒的RNA为模板，获得所需的HIV-1cDNA片段；(2)导入含有Sp6和T7启动子的质粒载体pGEM-T vector中，得到包含靶片段并且能够对该靶片段进行体外转录的重组质粒pZhcT-550。
在第四个方面，本发明提供了一种由本发明第一个方面所述的重组质粒制备HIV-1病毒量测定用外参照的方法，其特征是，该方法包括以下步骤(1)将本发明第一个方面所述的质粒载体转化大肠杆菌受体菌，获得重组受体菌；
(2)培养重组受体菌，并收集本发明第一个方面所述的重组质粒载体；(3)对本发明第一个方面所述的重组质粒载体进行体外转录，从而获得HIV-1病毒载量定量测定的RNA外参照。
在第五个方面，本发明提供了一种HIV-1寡聚核苷酸LUX引物HIV-LUX/HIV-RP对，其中所述引物序列为HIV-LUX5’-CGACT CATGG AGCAT CCTGC CT*AAG-3’HIV-RP5’-ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’，其中T*为标记有6-羧基荧光素(FAM)的碱基T。
引物对中的两个引物可以以任何已知的方式形成引物对，如可以通过将两个引物简单混合而形成引物对；也可以形成一种试剂盒，其中包括以上两种引物，但是这两种引物并不存在物理上的接触。优选通过将两个引物以1∶1的摩尔比简单混合来形成引物对。
在第六个方面，本发明提供了一种对样品中HIV-1病毒量的测定方法，其包括以下步骤(1)进行本发明第四个方面的方法，获得HIV-1病毒量定量测定的RNA外参照；(2)用本发明第五个方面的引物对分别对样品和步骤(1)得到的RNA外参照进行扩增；(3)参照RNA外参照扩增的结果，确定样品中的HIV-1病毒量。
优选在上述方法中，样品是HIV感染者和艾滋病患者的血浆。
在第七个方面，本发明提供了一种用于测定样品中HIV-1病毒量的试剂盒，其包括1)，权力要求1或2所述的重组质粒载体；和2)，权利要求6所述的引物对。
在以上试剂盒中还可以进一步包括用于对重组质粒载体进行体外专利的试剂，如SP6RNA聚合酶。
另外，在一个实施方式中，本发明提供一种用于制备HIV-1病毒载量测定用外参照的质粒，它包括的步骤是(1)由设计的HIV-1引物F/R，以HIV-1IIIB病毒的RNA为模板，获得所需的HIV-1cDNA片段；
(2)经T-A克隆导入含有Sp6和T7启动子的质粒载体中，得到能够针对目的片段进行体外转录的重组质粒pZhcT-550。
本发明的另一个实施方式提供了一种制备HIV-1病毒载量定量测定用外参照的方法，它包括的步骤是(1)将重组质粒pZhcT-550转化至大肠杆菌感受态细胞；(2)经PCR鉴定，筛选出阳性克隆子，获得大量重组质粒pZhcT-550；(3)体外转录重组质粒pZhcT-550，获得病毒载量定量测定的RNA外参照。
本发明的再一个实施方式将由以上方法得到的外参照应用于HIV-1病毒载量测定，它包括的步骤是(1)对引物F/R扩增片段进行序列测定，确定其分子量；(2)在波长260nm和280nm处测定RNA外参照的光吸收值，确定其纯度和浓度，进而确定其质量；(3)确定获得的RNA外参照的分子数，即拷贝数，据此将RNA外参照稀释成10倍浓度梯度，从而制备成定量用外参照标准品；(4)设计HIV LUX引物，该引物扩增片段位于外围引物F/R扩增片段内；(5)利用HIV LUX引物可以在荧光定量PCR仪上对构建的外参照标准品以及HIV感染者和艾滋病人血浆中的HIV RNA进行RT-PCR，并且获得有效的荧光信号。利用外参照标准品的RNA拷贝数与扩增信号强度的对应关系建立标准曲线，就可以定量测定未知样品中所含有的HIV RNA拷贝数。
附图的简要说明附
图1为pZhcT-550质粒的构建示意图。
附图2F/R为引物的PCR扩增结果电泳图谱。图中1DL2000分子量标准；2扩增产物(HIV-1IIIB病毒的RNA为模板)。
附图3为重组质粒的电泳分析图谱。图中1DL2000分子量标准；2重组质粒pZhcT-550。
附图4是重组质粒为模板，F/R为引物的PCR扩增结果电泳图谱。图中1DL2000分子量标准；2阴性对照；3重组质粒PCR扩增结果(559bp)。
附图5重组质粒为模板，以LUX引物进行荧光实时PCR图谱。
附图6HIV-1外围引物F/R扩增获得的cDNA序列测定结果，黑体表示引物F/R序列。
附图7-A至图7-B定量用外参照体系标准曲线。图中标准曲线的相关系数R为0.99825。
附图8-A、图8-B、图8-C对未知样品的荧光定量PCR检测。
发明的详细描述可以认为，不需进一步的解释，本领域的人员就可以根据前面的描述，充分利用本发明。下面结合实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)或彭秀玲等人，基因工程实验技术(科学技术出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例①重组质粒载体pZhcT-550的制备引物F/R是根据HIV-1IIIB病毒基因组核苷酸序列(Genebank登录号A04321)设计而获得，由中国大连宝生物工程公司合成。引物序列为引物F5’-CGACT CATGG AGCATCCTGC CTAAG-3’)；引物R5’-ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’。
从本实验室利用C8166细胞培养获得的200μl HIV-1IIIB病毒培养上清中用High PureViral Nucleic Acid Kit(Roche，Penzberg，Germany)提取RNA，用50μl Tris·HCl(pH8.0)悬浮，10μl的样品保存在-80℃用于每次RT-PCR。
通过引物F/R，利用AMV One Step RT-PCR Kit(大连宝生物工程公司，中国)对HIV-1IIIB病毒的RNA进行逆转录扩增，扩增条件为逆转录50℃，30分钟；预变性94℃，2分钟，然后是40个循环PCR扩增，每个循环包括94℃，30秒变性，58℃，30秒退火和72℃，1分钟延伸，最后72℃，5分钟扩增产物。
经1％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离产物(如图2)，然后用Agrose gel purificationKit(大连宝生物工程公司，中国)纯化DNA(序列如图6所示，该序列也可以通过人工合成核酸片段来连接而成)。纯化片段与质粒载体pGEM-T vector(Promega Company，USA)进行T-A克隆，从而构建成新的重组质粒载体pZhcT-550(如图1)，实验步骤详见pGEM-Tvector说明书。
实施例②重组质粒pZhcT-550的扩增及鉴定制备宿主大肠杆菌JM109(Promega Company，USA)感受态细胞，完成重组质粒pZhcT-550对感受态细胞的转化反应，利用氨卞抗性和蓝白斑双筛选获得阳性克隆。提取质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定(图3)。以重组质粒pZhcT-550作为模板，分别用F/R引物和LUX引物(Invitrogen Company，Canada)进一步作PCR扩增鉴定(如图4)和荧光实时PCR鉴定(如图5)。LUX引物序列如下HIV-LUX5’-CGACT CATGG AGCAT CCTGC C TAAG-3’HIV-RP5’ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’其中引物HIV-LUX近3’端的碱基T上标记有6-羧基荧光素(FAM)。
(1)F/R引物扩增获得的克隆片断的PCR电泳结果表明用F/R引物扩增HIV-1IIIB病毒基因组保守序列产生特异条带(图4)，条带大小(559bp)与预期结果一致。
(2)以pZhcT-550质粒为模板，用LUX引物进行荧光实时PCR鉴定，结果表明能够产生有效的荧光信号(图5)。进一步说明质粒构建成功，其中含有特异克隆片段。
实施例③制备HIV-1病毒量定量测定的外参照以重组质粒pZhcT-550作为实验材料进行体外转录，该实验采用SP6 RNA聚合酶(大连宝生物工程公司，中国)完成，具体方法参照SP6 RNA聚合酶说明书。RNA转录产物用紫外分光光度计定量，以十倍系列稀释，其中最小浓度为稀释至10拷贝/ml，从而获得一系列稀释度的含有由pZhcT-550转录的mRNA的样品，以这些样品作为HIV-1病毒量定量测定的外参照。以十倍系列稀释的HIV-1病毒外参照为模板，用LUX引物进行荧光实时定量PCR，获取标准曲线(图7)。
实施例④未知样品HIV-1病毒量(Viral load)的测定分别取十倍系列稀释的外参照RNA(10～107拷贝/ml)和未知样品RNA作为模板，利用LUX引物，依SuperScriptTMIII PlatinumOne-Step Quantitative RT-PCR System(Invitrogen Company，Canada)操作说明书在荧光PCR仪RotorGene3000(CorbettResearch，Australia)进行荧光实时定量PCR，根据不同拷贝数的外参照，其荧光强度(Norm.fluoro.)不同，达到某一荧光强度所需的PCR循环数(CT值)也不同的原理，以CT值为纵坐标，拷贝数为横坐标获得标准曲线。根据未知样品在扩增中获得的荧光信号强度，在标准曲线中找到未知样品中HIV RNA的初始拷贝数，进而计算出单位体积血浆中HIV的病毒量。
如上述荧光实时定量PCR结果(图8)所显示外参照的CT值(Value)随浓度(concentration)的增大而递减。获得的工作曲线有好的线性关系(R＝0.99848)，根据标准曲线计算出六病人的病毒量分别为4.09×10-2拷贝/ml、1.30×10-2拷贝/ml、9.43×10-3拷贝/ml、1.36×103拷贝/ml、1.54×104Copies/ml、1.87×104Copies/ml，结果表明本发明对高、中和低拷贝数样品都能够准确定量并有效区分。
本发明的结果表明，当以重组质粒pZhcT-550转录的RNA作为测定病毒量的外参照时，RNA外参照包含有HIV-1 LUX引物扩增的靶序列。它的检测灵敏度高，一个反应管内初始拷贝数低至10拷贝/μl甚至1拷贝/μl的RNA时都能很好地扩增，扩增效果和特异性都好。
目前商品化的试剂Amplicor Monitor test(Roche Diagnostics，UK)的检测范围是50-50,000拷贝/毫升(临床样本)。本研究建立的定量PCR方法检测范围是10-107拷贝/毫升(临床样本)。如果采用高速离心浓缩样品内的病毒核酸，检测下限将能进一步提高。经对7个标准品的二～三次重复测定，方法本身造成的变异系数基本低于30％。
目前，检测HIV-1病毒载量的商品化的技术中，Roche公司的Amplicor Monitortest(PCR)是FDA批准的唯一用于临床检测HIV-1的试剂盒。现有的商品化检测试剂盒价格十分昂贵(每个样品的检测费用在200至500美元之间)[12]，而我们在本文中介绍的方法的成本则低得多，检测一个样品的试剂成本在50元人民币左右，除荧光定量PCR仪之外再不需要其他大型设备，一般临床和研究机构都可以购买得起，而且操作比较简易。
本发明与现有技术相比，具有操作简单，价格便宜，特异性好，灵敏度高，同时有较好的可重复性，将为HIV的检测以及艾滋病的诊断、防治和科学研究提供有力工具。
权利要求
1.一种用于制备HIV-1病毒测定的RNA外参照的重组质粒载体，其包含用引物F/R以HIV-1基因组RNA为模板反转录扩增而获得的核酸片段，其中所述引物F/R序列如下F5’-CGACT CATGG AGCAT CCTGC CTAAG-3’，R5’-ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’。
2.权利要求1所述的质粒载体，其中HIV-1基因组是HIV-1IIIB病毒基因组。
3.一种构建用于制备HIV-1病毒量定量测定的RNA外参照的重组质粒载体的引物对，其是外围引物F/R，其中所述引物F/R序列如下F5’-CGACT CATGG AGCAT CCTGC CTAAG-3’，R5’-ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’。
4.一种用于制备HIV-1病毒量定量测定的RNA外参照的重组质粒载体的构建方法，其特征是，该方法包括以下步骤(1)由权利要求3所述的引物对，以HIV-1IIIB病毒的RNA为模板，获得所需的HIV-1cDNA片段；(2)导入含有Sp6和T7启动子的质粒载体pGEM-T vector中，得到包含靶片段并且能够对该靶片段进行体外转录的重组质粒pZhcT-550。
5.一种由权利要求1所述的重组质粒制备HIV-1病毒量测定用外参照的方法，其特征是，该方法包括以下步骤(1)将权利要求1或2所述的质粒载体转化大肠杆菌受体菌，获得重组受体菌；(2)培养重组受体菌，并收集权利要求1或2所述的重组质粒载体；(3)对权利要求1或2所述的重组质粒载体进行体外转录，从而获得HIV-1病毒载量定量测定的RNA外参照。
6.一种HIV-1寡聚核苷酸LUX引物HIV-LUX/HIV-RP对，其中所述引物序列为HIV-LUX5’-CGACT CATGG AGCAT CCTGC CT*AAG-3’HIV-RP5’-ACAGC GGTCA CTTGA CGAGT AATCA CTAGC-3’，其中T*为标记有6-羧基荧光素(FAM)的碱基T。
7.一种对样品中HIV-1病毒量的测定方法，其包括以下步骤(1)进行权利要求5的方法，获得HIV-1病毒量定量测定的RNA外参照；(2)用权力要求6的引物对分别对样品和步骤(1)得到的RNA外参照进行扩增；(3)参照RNA外参照扩增的结果，确定样品中的HIV-1病毒量。
8.权利要求7所述的方法，其中样品是HIV感染者和艾滋病患者的血浆。
9.一种用于测定样品中HIV-1病毒量的试剂盒，其包括1)，权力要求1或2所述的重组质粒载体；和2)，权利要求6所述的引物对。
全文摘要
本发明涉及一种用于制备HIV－1病毒量测定用外参照的质粒，建立HIV－1感染者和艾滋病人血浆中HIV病毒量定量测定用外参照的方法以及该外参照在HIV病毒量测定中的应用。其制备方法为利用HIV外围引物HF/HR从HIV－文档编号C12N15/63GK1814800SQ20051009018
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月16日 优先权日2005年12月16日
发明者任若通, 贲昆龙, 李卫云, 陈韵, 陈震球, 陶剑 申请人:李卫云, 李燕琴