专利名称：：聚乙二醇修饰的抑肽酶及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种化学修饰的抑肽酶及其制备方法和用途，具体地说涉及一种聚乙二醇修饰的抑肽酶及其制备方法，还包括其在止血和抗炎中的用途。
背景技术：
：抑肽酶(aprotinin)是从牛肺中提取的一种碱性多肽，为非特异性蛋白酶抑制剂，能抑制多种含有丝氨酸活性中心的蛋白酶。抑肽酶由58个氨基酸组成，其氨基酸组成为RPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGA。大量临床研究表明大剂量抑肽酶可明显减少体外循环术后出血，临床主要用于防治各种纤维蛋白溶解所致的急性出血及各种休克，急性胰腺炎及胰腺坏死。近年来广泛应用于各种手术、如体外循环心脏直视手术、癌症手术、骨科手术、剖宫产术、鼻内窥镜术等，以减少术中、术后出血。但是在使用过程中也发现这些药物具有蛋白质药物所共有的缺点，如具有免疫原性，半衰期短等。特别是免疫原性问题，已成为抑肽酶广泛应用的最大障碍。资料显示0.7%的患者首次接触既可发生过敏反应，再次使用者过敏反应发生率增至10%。为此，发明人试图采用蛋白质修饰技术对抑肽酶进行结构修饰以降低或消除抑肽酶的免疫原性，从而改善该类药物的药效，降低毒性。目前，在对蛋白质药物进行化学修饰的研究领域中，应用最多，成功率最高的是聚乙二醇(PEG)修饰技术。用于修饰蛋白质药物的PEG有很多种，典型的修饰反应列举如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>1)SPA-PEG或SBA-PEG所参与的反应；2)带a-支链的SPA-PEG或SBA-PEG所参与的反应(C:几种活化的PEG修饰蛋白质巯基的反应■O1.)mPEG—N+SH-RmPEG—NO—S-ROOII2.)ro:PEG——S—CH-CH2+SH-RO如omPEG—S—CH2CH2SOO■3.)mPEG—NHCCTjI+SR-ROtlmPEG—NHCCH，S-R4,)mPEG—S-S-1)为PEG-马来酰亚胺；2)为PEG-乙烯基砜；3)为PEG-碘乙酰胺;4)为PEG-邻-吡啶-二硫醚。修饰研究中大多数是将多肽分子中的氨基作为修饰位点。为克服抑肽酶作为药物使用所存在的不足，采用聚乙二醇修饰技术对抑肽酶的氨基进行修饰，以获得聚乙二醇修饰的抑肽酶，作为止血药物和抗炎药物在临床上应用。本发明所要解决的技术问题是针对现有技术制备抑肽酶存在免疫原性，半衰期短等缺陷，采用蛋白质修饰技术以降低其免疫原性，延长其半衰期，从而改善该蛋白质的药物动力学特性，以提高其耐受性和减少给药次数，更好地满足抑肽酶在临床应用方面的需求。
发明内容本发明提供一种聚乙二醇修饰的抑肽酶，其特征在于，抑肽酶的氨基上连接有聚乙二醇或其衍生物链。所述的抑肽酶(aprotinin)包括从牛肺或牛的胰腺中提取的或用基因工程手段制备的重组抑肽酶，该抑肽酶的氨基酸组成序列为[R]PDFCLEPPYTGPC[K]ARIIRYFYNA[K]AGLCQTFVYGGCRA[K]RNNF[K]SAEDCMRTCGGA;分子式为C284H432N84079S7;分子量为6511.44。所述的抑肽酶的氨基，具体而言就是指抑肽酶组成中N-末端的a-氨基和赖氨酸的s-氨基，可能的修饰位点为5个(见上述序列中的[]中的氨基酸)。每个抑肽酶分子上可以接15条聚乙二醇的长链，优选每个抑肽酶分子上连接一条聚乙二醇长链。所述的聚乙二醇长链可以为直链聚乙二醇也可以为支链聚乙二醇，优选直链聚乙二醇；聚乙二醇长链的分子量通常在2000200000之间，优选的分子量在3000-30000之间。优选的的聚乙二醇修饰的抑肽酶，其具有如下的通式结构m陽PEG-Y-NH画R其中PEG代表聚乙二醇长链，其可以是直链聚乙二醇长链，也可以是带有支链的聚乙二醇长链，优选直链聚乙二醇；该长链的分子量通常在2000~200000之间，优选的分子量在3000~30000之间；其中m代表d~C4的低级烷氧基，该低级烷氧基用于保证每个聚乙二醇长链上仅修饰一个抑肽酶分子，也即单聚乙二醇修饰抑肽酶，m优选甲氧基；其中Y代表聚乙二醇长链和抑肽酶的连接基团，是聚乙二醇或其衍生物在修饰后留下的残基；其中R代表少了一个氨基的抑肽酶分子。聚乙二醇修饰的抑肽酶的制备方法包括将活化的聚乙二醇或其衍生物与抑肽酶进行反应，然后将聚乙二醇修饰的抑肽酶从反应混合物中分离，得到药用纯度的聚乙二醇修饰的抑肽酶。所述的活化的聚乙二醇或其衍生物是本领域一般技术人员所公知的，例如描述于RobertMJ等，先进的药物传递评论(AdvancedDrugDiliveryReviews)(2002;54:459-476)。其中聚乙二醇或其衍生物包括但不限于单甲氧基聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇羧酸衍生物、单甲氧基聚乙二醇酯类衍生物、单甲氧基聚乙二醇二氯三嗪衍生物、单甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇对硝基苯碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇三氯苯碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇碳酰咪唑、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇羧酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、戊酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、已酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、庚酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇甲醛、单甲氧基聚乙二醇乙醛、单甲氧基聚乙二醇丙醛、单甲氧基聚乙二醇丁醛、单甲氧基聚乙二醇戊醛、单甲氧基聚乙二醇已醛、单甲氧基聚乙二醇庚醛、或单甲氧基聚乙二醇丙醛和单甲氧基聚乙二醇乙醛通过酸水解形成的乙縮醛水合物，也可以在这些种类的修饰剂的结构中引入葡萄糖及其类似物、赖氨酸及其类似物等分子的结构，以形成新的活化的聚乙二醇修饰剂等等。优选地，使用甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、戊酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、已酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、庚酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇甲醛、单甲氧基聚乙二醇乙醛、单甲氧基聚乙二醇丙醛、单甲氧基聚乙二醇丁醛、单甲氧基聚乙二醇戊醛、单甲氧基聚乙二醇已醛或单甲氧基聚乙二醇庚醛。更优选的使用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇丙醛或单甲氧基聚乙二醇丁醛(使用醛进行修饰时需在反应液中加入硼氢化钠)，这些修饰剂可采用美国NektarTherapeutics公司生产的产品。更优选地，所述聚乙二醇修饰的抑肽酶具有如下通式结构m-PEG-0-(CH2)n-T-NH-R其中m代表dC4的低级烷氧基，优选甲氧基；其中PEG代表聚乙二醇长链，其可以是直链聚乙二醇长链，也可以是带有支链的聚乙二醇长链，优选直链聚乙二醇；该长链的分子量通常在2000-200000之间，优选的分子量在300030000之间；n=0~6，优选『2或3;oT为c或CH2;R为去除一个氨基(NH2)的抑肽酶分子。o当T为i'时为一种修饰方法，具体为IImPEG-O(CH2)nC_NH—R当T为CH2时为另一种修饰方法，具体为m-PEG-0-(CH2)n-CH2-NH-R本发明还提供聚乙二醇修饰抑肽酶的制备方法，包括如下步骤在抑肽酶溶液中，加入磷酸氢二钠溶液，调节其pH值在4.5-9.5，优选6.57.5;然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反应温度为4~40°C，优选20~30°C;反应时间，当T为c时，反应时间为5"20分钟，当T为CH2时，反应时间为0.5到48小时；反应中活化的聚乙二醇或其衍生物与抑肽酶的摩尔比为0.1~100，优选15，将反应混合液采用本领域所公知的离子交换层析技术。离子交换层析采用阳离子交换层析，流动相为含NaCl的磷酸盐缓冲液，即可得聚乙二醇修饰的抑肽酶。制备反应按下式进行m-PEG-0-(CH2)n-D+R-NH2-mPEG-0-(CH2)n-T-NH-R其中m代表C广C4的低级垸氧基，优选甲氧基；其中PEG代表聚乙二醇长链，其可以是直链聚乙二醇长链，也可以是带有支链的聚乙二醇长链，优选直链聚乙二醇；该长链的分子量通常在2000200000之间，优选的分子量在300030000之间；当D为0时，T为c;当D为—CH时，T为CHyR为去除一个氨基(NH2)的抑肽酶分子。离子交换层析采用阳离子交换层析进行分离，所使用阳离子交换层析介质为本领域所公知的各种层析介质，根据其骨架的不同可分为聚苯乙烯型、纤维素型、葡聚糖型、琼脂糖型、球状纤维素型等，如SSepharose系列、CMSepharose系列、CMSephacel系列、SPSephadex系列、CMSephadex系列、SOURCES系列等，其中优选使用SOURCE30S作为层析介质进行分离；阳离子层析的柱D为o或—。其中R-NH2为抑肽酶;n=0~6，优选11=2或3;体积为1600ml，流速为0.550ml/min;用起始缓冲液平衡2~8倍柱体积；上样量为2200ml;先用15倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+1.0mol/LNaCl缓冲液(B)，B体积百分含量从0100X，洗脱20倍柱体积。起始缓冲液可使用乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液、巴比妥-盐酸缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液等，这些缓冲液的pH可从3.09.0，其中最优地使用pH为58的Tris-HCl缓冲液。收集各洗脱组份，用SDS-PAGE和反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析，合并聚乙二醇修饰的抑肽酶。本发明还提供聚乙二醇修饰的抑肽酶在制备高效低毒的止血药物和抗炎药物的临床应用，其中可以按照公知技术制备成为注射液或冻干粉针给药。令人吃惊的是，本发明的聚乙二醇修饰的抑肽酶能显著提高抑肽酶的比活力，同时它比未修饰的抑肽酶有较低的免疫原性和更好的稳定性，动物体内试验表明它比未修饰的抑肽酶有更好的止血效果，因此作为药物它比未修饰的抑肽酶有更大的优越性。本发明的聚乙二醇修饰的抑肽酶的制备方法，简单易行。图1聚乙二醇修饰抑肽酶的HPLC分析图谱图2聚乙二醇修饰抑肽酶的SDS-PAGE图(谱图中1为标准蛋白，2为聚乙二醇修饰抑肽酶)图3聚乙二醇修饰抑肽酶的MALDI-TOF-MS分析图谱具体实施例方式实施例1丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SPA-5000)修饰的抑肽酶反应温度的选择取1.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.0，再加入mPEG-SPA-5000固体4.0mg，溶解，混匀，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后分别置于4。C、10°C、25。C和37。C反应30min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些温度下都能得到聚乙二醇修饰的抑肽酶，其中25。C的修饰率最高，具体数据见表一。表一不同温度对抑肽酶修饰率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>反应时间的选择取l.Omg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.0，再加入mPEG-SPA-5000固体4.0mg，溶解，混匀，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后于25t:分别反应5、15、30、60、120min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的抑肽酶，其中30min后的修饰率没有明显提高，具体数据见表二。表二不同时间对抑肽酶修饰率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>mPEG-SPA-5000同抑肽酶的摩尔比的选择取10.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.0，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后分别加入1.2、2.3、5.8和11.5mgmPEG-SPA-5000(相当于mPEG-SPA-5000同抑肽酶的摩尔比分别为1:1，1:2，1:5，h10)，溶解，混匀，反应30min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的抑肽酶，当mPEG-SPA-5000同抑肽酶的摩尔比在2时修饰率已达到最高，进一步增加mPEG-SPA-5000的量修饰率也没有明显地增加，具体数据见表三。表三不同摩尔比对抑肽酶修饰率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例2聚乙二醇修饰抑肽酶的分离纯化与鉴定取1.0mg/ml的抑肽酶溶液10ml，加约5ml的磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.0，再加入mPEG-SPA-5000固体16mg，溶解，混匀，于25。C反应30min，加入3g甘氨酸固体终止反应。取上述反应液，对0.05mol/L，pH6.0的Tris-HCl缓冲液透析，用截流分子量为3000的超滤膜浓縮至5ml，上柱分离。色谱条件如下层析介质SOURCE30S柱体积5ml流速3.0ml/min柱平衡用0.05mol/L，pH6.0的Tris-HCl(起始缓冲液)平衡5倍柱体积上样量5ml洗脱先用3倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+1.0mol/LNaCl缓冲液(B)，B从0100%，洗脱20倍CV收集3.0ml/管用SDS-PAGE和RP-HPLC进行跟踪分析，合并聚乙二醇修饰的抑肽酶。RP-HPLC分析表明得到的聚乙二醇修饰的抑肽酶的纯度在98%以上，见附图l，具有较高的纯度。SDS-PAGE测定表明聚乙二醇修饰的抑肽酶在电泳图上为单一条带，经计算表观分子量为14373，见附图2。聚乙二醇修饰的抑肽酶经MALDI-TOF-MS分析，测得其分子量为11539.29，见附图3。抑肽酶的分子量为6511.44，二者分子量相差约5000，同时在11540.29(M+l峰)附近有一系列峰，相邻两峰的分子量相差44，具有聚乙二醇的典型结构特征，证实得到的聚乙二醇抑肽酶的单修饰产物。实施例3抑肽酶和聚乙二醇修饰的抑肽酶生物效价测定(方法参见中国药典2005年二部抑肽酶)按照药典中抑肽酶的效价测定方法，测定抑肽酶和聚乙二醇修饰的抑肽酶的效价，然后计算样品的比活力(U/mg)。效价测定表明聚乙二醇修饰的抑肽酶不但比活力没有降低，而且还升高了近l倍，具体结果见表四。表四抑肽酶和聚乙二醇修饰的抑肽酶生物效价测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例4抑肽酶和聚乙二醇修饰的抑肽酶止血作用比较按照Ga'borVeres等公布的抑肽酶对实验动物止血作用的影响的试验方法，以beagle犬作为实验动物进行开胸手术试验，方法参见Ga'borVeres，Tama'sRadovitsHolgerSchultz等，EuropeanJournalofCardio-thoracicSurgery,2007;32(2):340-345。24只beagle犬被分成3组，每组8只，雌雄各半，分为阴性对照组(生理盐水)、聚乙二醇修饰抑肽酶和抑肽酶组。抑肽酶和聚乙二醇修饰抑肽酶组在手术前每只犬按1.57单位/kg静脉给药，手术过程中用泵循环给药，剂量为1.57U/kg，速率为111.1U/h，循环时间为卯min。试验结果表明抑肽酶和聚乙二醇修饰抑肽酶均能显著降低因开胸手术引起的出血量(p<0.05)。具体结果见表五表五抑肽酶和聚乙二醇修饰的抑肽酶止血作用比较结果纟1￥—出血量(n^T"5"血减少Q)SSSJiir180±63抑肽酶93±3548.3%聚乙二醇修饰抑肽酶68士2462.2%这些结果表明聚乙二醇修饰的抑肽酶在体内不但保留了抑肽酶止血的生理作用，而且在同等剂量下还能提高止血效果。因此，预期在人体内聚乙二醇修饰的抑肽酶会有更好的止血作用效果。实施例5聚乙二醇修饰的抑肽酶对实验动物免疫原性的研究以家兔作为制备抗血清的实验动物，采用福氏佐剂免疫法，并分别以抑肽酶和聚乙二醇修饰的抑肽酶作为抗原，剂量均为6U/kg/次，每周1次，共5次。分别以抑肽酶和聚乙二醇修饰的抑肽酶作为抗原，用双向免疫扩散法测定它们各自抗血清的效价，测定结果为抑肽酶组抗血清的效价为h16;聚乙二醇修饰的抑肽酶组抗血清的效价测不出。分别以抑肽酶和聚乙二醇修饰的抑肽酶作为抗原，然后用抑肽酶组的抗血清作为第一抗体，再以辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG作为第二抗体，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定它们各自的免疫原性，测定结果为抑肽酶组为阳性，聚乙二醇修饰的抑肽酶组为阴性。以上结果表明同抑肽酶比较，聚乙二醇修饰的抑肽酶的免疫原性显著降低，这样更有利用作为治疗药物进行使用。实施例6用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SPA-2000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SPA-10000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SPA-20000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000(mPEG-SPA-30000)或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯60000(mPEG-SPA-60000)代替实施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了实施例中1-5相似的结果。实施例7用丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SBA-2000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SBA-5000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SBA-10000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SBA-20000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000(mPEG-SBA-30000)或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯60000(mPEG-SBA-60000)代替实施例1中的mPEG-SPA-5000，得到了实施例中1-5相似的结果。实施例8甲氧基聚乙二醇丙醛5000(mPEG-ALD-5000)修饰的抑肽酶反应温度的选择取1.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为6.5，再加入mPEG-ALD-5000固体4.0mg，溶解，混匀，再加0.164ml的lmol/LNaBH4，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后分别置于4°C、10°C、25。C和37。C反应16h后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些温度下都能得到聚乙二醇修饰的抑肽酶，其中25。C的修饰率最高，具体数据见表六。表六不同温度mPEG-ALD-5000对抑肽酶修饰率的影响<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>反应时间的选择取1.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为6.5，再加入mPEG-ALD-5000固体4.0mg，溶解，混匀，再加0.164ml的lmol/LNaBH4，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后于25。C分别反应0.5、1.0、8.0、16.0、24.0h后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的抑肽酶，其中16h后的修饰率没有明显提高，具体数据见表七。表七不同时间mPEG-ALD-5000对抑肽酶修饰率的影响<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>mPEG-ALD-5000同抑肽酶的摩尔比的选择取10.0mg/ml的抑肽酶溶液2ml，加2ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为6.5，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后分别加入1.2、2.3、5.8、11.5mgmPEG-ALD-5000(相当于mPEG-ALD-5000同抑肽酶的摩尔比在1.010.0)，溶解，混匀，再分别加0.041ml的lmol/LNaBH4反应16.0h后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。结果表明在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的抑肽酶，当mPEG-ALD-5000同抑肽酶的摩尔比在2.0时修饰率已达到最高，进一步增加mPEG-ALD-5000的量修饰率也没有明显地增加，具体数据见表八。表八不同摩尔比的mPEG-ALD-5000对抑肽酶修饰率的影响<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>聚乙二醇修饰抑肽酶(醛修饰)的分离纯化与鉴定取1.0mg/ml的抑肽酶溶液10ml,加5ml磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为7.0，再加入mPEG-ALD-5000固体16.0mg，溶解，混匀，再加0.328ml的lmol/LNaBH4，反应16h后，加入3g甘氨酸固体终止反应。然后按照实施例2中的方法进行聚乙二醇修饰抑肽酶的分离纯化与鉴定。RP-HPLC分析表明得到的聚乙二醇修饰的抑肽酶的纯度在98%以上，具有较高的纯度。测定表明该聚乙二醇修饰的抑肽酶在电泳图上为单一条带，经计算表观分子量为14588。实施例11聚乙二醇修饰抑肽酶(醛修饰)的特性研究按照实施例3~6中的方法进行mPEG-ALD-5000修饰抑肽酶生物活性、稳定性、对实验动物血栓形成的影响和免疫原性的研究，结果见表九。表九聚乙二醇修饰抑肽酶(醛修饰)的特性研究结果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例12用甲氧基聚乙二醇丙醛2000(mPEG-ALD-2000)、甲氧基聚乙二醇氧基聚乙二醇丙醛10000(mPEG-ALD-10000)、甲氧基聚乙二醇丙醛20000(mPEG-ALD-20000)、甲氧基聚乙二醇丙醛30000(mPEG-ALD-30000)或甲氧基聚乙二醇丙醛60000(mPEG-ALD-60000)代替实施例9中的mPEG-ALD-5000，得到了实施例中9-ll相似的结果。实施例13用甲氧基聚乙二醇丁醛2000(mPEG-ButyrALD-2000)、甲氧基聚乙二醇丁醛5000(mPEG-ButyrALD-5000)、甲氧基聚乙二醇聚乙二醇丁醛10000(mPEG-ButyrALD-10000)、甲氧基聚乙二醇丁醛20000(mPEG-ButyrALD-20000)、甲氧基聚乙二醇丁醛30000(mPEG-ButyrALD-30000)或甲氧基聚乙二醇丁醛60000(mPEG-ButyrALD-60000)代替实施例1中的实施例9中的mPEG-ALD-5000，得到了实施例中9-11相似的结果。权利要求1.一种聚乙二醇修饰的抑肽酶，其特征在于抑肽酶的氨基上连接有聚乙二醇或其衍生物链。2.权利要求l所述的聚乙二醇修饰的抑肽酶，其特征在于每个抑肽酶分子上连接一条聚乙二醇长链。3.权利要求2的聚乙二醇修饰的抑肽酶，其具有如下的通式结构m-PEG-Y-NH-R，其中m代表dC4的低级烷氧基，PEG代表聚乙二醇长链，Y代表聚乙二醇长链和抑肽酶的连接基团，R代表少了一个氨基的抑肽酶分子。4.权利要求3的聚乙二醇修饰的抑肽酶，其具有如下的通式结构m-PEG-0-(CH2)n-T-NH-R，其中m代表dC4的低级烷氧基，PEG代表聚乙o二醇长链，n=0~6，T为^或CH2，R代表少了一个氨基的抑肽酶分子。5.权利要求4所述的聚乙二醇修饰的抑肽酶，其具有如下的通式结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6.权利要求4所述的聚乙二醇修饰的抑肽酶，其具有如下的通式结构m-PEG-0-(CH2)n-CH2-NH-R。7.权利要求4-6所述的聚乙二醇修饰的抑肽酶，其特征在于11=2或3。8.权利要求1-6所述的聚乙二醇修饰的抑肽酶，其特征在于聚乙二醇长链的分子量在2000200000之间。9.权利要求8所述的聚乙二醇修饰的抑肽酶，其特征在于聚乙二醇长链的分子量在3000~30000之间。10.权利要求3-6所述的聚乙二醇修饰的抑肽酶，其特征在于m为甲氧基。11.一种聚乙二醇修饰的抑肽酶的制备方法，其特征在于制备反应按下式进行<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中m代表dC4的低级烷氧基；其中PEG代表聚乙二醇长链；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>;其中R-NH2为抑肽酶；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>当D为O时，T为^;当D为一CH时，T为CH2;R为去除一个氨基(NH2)的抑肽酶分子；反应步骤如下在抑肽酶溶液中，加入磷酸氢二钠溶液，调节其pH值在4.5-9.5;然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反应温度为44(TC;反应时间，o当T为i'时，反应时间为5120分钟，当T为CH2时，反应时间为0.5到48小时；反应中活化的聚乙二醇或其衍生物与抑肽酶的摩尔比为0.1100;将反应混合液采用离子交换层析技术，离子交换层析采用阳离子交换层析，流动相为含NaCl的磷酸盐缓冲液，即可得聚乙二醇修饰的抑肽酶。12.权利要求1-6所述的聚乙二醇修饰的抑肽酶，其在制备高效低毒的止血药物或抗炎药物中的用途。全文摘要本发明公开了一种聚乙二醇修饰的抑肽酶及其制备方法，其特征在于，抑肽酶的氨基上连接有聚乙二醇或其衍生物链。本发明的聚乙二醇修饰的抑肽酶能够提高抑肽酶的比活力，同时它显著地降低了抑肽酶的免疫原性并提高了抑肽酶的稳定性，从而改善了抑肽酶的药物动力学特性，提高了耐受性并减少了给药次数。文档编号A61P29/00GK101412995SQ20071013332公开日2009年4月22日申请日期2007年10月17日优先权日2007年10月17日发明者军冯,吕达娜,张喜全,张来芳,鹏朱,娟潘,伟赵,珍赵申请人:上海医药工业研究院;江苏正大天晴药业股份有限公司