专利名称：复合生物素化壳聚糖膜的制法及在牙周组织再生中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种复合生物素化壳聚糖膜的制备及其在牙周组织再生中的应用。
背景技术：
牙周病是人类口腔两大类主要疾病之一，在我国和世界范围均有较高的患 病率，己成为成年人拔牙的首要原因。随着我国和世界人口老龄化，牙周病将 会有更突出的问题，严重影响人的生存质量和身体健康，人们对牙周治疗的要 求将明显增加。牙周病的治疗一直是临床重点研究领域之一。牙周病的治疗不仅在于炎症 消除，更重要的是在于使已破坏的牙周组织再生和形成牙周新附着 (new-attachments如何获得牙周组织完全再生，是至今尚未解决的难题，也 是牙周病研究领域中的重要课题和突破点。弓l导牙周组织再生(periodontal guided tissue regeneration, GTR)技 术是近年来根据Melcher提出的牙周组织再生潜能理论发展起来的牙周病治疗 新方法，被认为是目前最先进的牙周治疗方法。它是将屏障膜置于牙龈瓣和处 理过的根面之间，阻挡牙龈上皮和结缔组织与根面先接触，保证牙周前体细胞 优先占据牙根面，依靠牙周前体细胞迁移、分化、增殖，重新形成牙周组织，一 建立牙周新附着。目前，GTR屏障膜有多种，总体可分为三类(1) 不可吸收膜以膨体聚四氟乙烯(e-PTEE)为主要代表，已较广泛用 于实验研究和临床治疗。但此类膜需二次手术取出，且取出时间难以掌握，放 置时间过长会影响牙周组织再生和增加感染机会。(2) 可吸收性膜主要有聚合胶原膜、聚乳酸膜、乳酸一乙酸共聚体膜等。 此类膜的优点是能在体内逐渐降解，避免二次手术，减少了创伤。(3) 生物素化屏障膜上述两类GTR屏障膜均为单纯性屏障膜，仅能提供 物理性屏障作用，治疗后很难达到牙周组织完全再生，因此生物素化屏障膜逐 渐成为目前研究的趋势。生物素化屏障膜的含义是屏障膜不仅具备上述膜的作 用，还具有一定的生物活性，主动引导牙周组织前体细胞生长、分化、增殖。目前釆用的生物素化屏障膜设计模式是把可吸收性屏障膜材料、生物活性 因子和缓释载体三者复合起来。研究证实生物素化屏障膜的牙周治疗效果优于 单纯性屏障膜。但是，目前生物素化屏障膜的研究还处于探索阶段，缺乏系统 性。如何解决生物活性因子的载体问题及如何充分利用和调动GTR屏障膜材料、 生物活性因子、缓释载体的综合效应，是今后牙周病治疗和GTR技术发展的方 向。牙周组织的再生依赖于牙周前体细胞在多种生长因子的网络调控作用下， 完成分化、增殖和细胞外基质的生物合成。如何正确选用和组合生长因子一直 是研究中的难题。人们在研究中发现，人重组骨形成蛋白-2(rhBMP2)和碱性成纤 维细胞生长因子(bFGF)在生物学功能上有良好的互补性，共同参与骨和软骨 的生长代谢调节。体外试验发现，两者联合应用对牙周膜细胞的增殖有协同作 用。但它们在体内易被迅速弥散和降解，必须频繁给药，且应用效果较差。这 就需要将rhBMP2和bFGF加入到合适的载体/控释系统中，使其免受蛋白水解， 在需要的地方长时间可控释放，并保持生长因子的活性。壳聚糖(chitosan)是甲壳素(chitin)的脱乙酰基产物，是自然界第二 大类天然多糖，广泛存在于昆虫、甲壳类动物的外壳和真菌细胞壁中，无毒、 无免疫原性，具有良好的组织相容性、生物可降解性，被广泛应用生物医学和 药学的实验和临床研究。壳聚糖作为一种新型药用载体在缓释给药系统，特别 是在微球系统中的应用已引起人们广泛的关注。壳聚糖微球(chitosan microsphere, CM)有如下作用特点①控制释放，CM包封药物后具有明显的控 释和延长药效的作用。②增加药物的靶向性。③提高疏水性药物通过细胞膜， 壳聚糖微球可以改变膜转运机制，增加药物对生物膜的通透性。④增加药物的 稳定性。(D减少给药剂量，降低毒副反应，提高药物疗效。目前，还没有将壳聚糖微球包封生长因子应用于牙周组织再生中的报道； 也没有关于壳聚糖微球包封bFGF或rhBMP2的研究；及含壳聚糖微球的生物素化 壳聚糖膜的研究。发明内容为了能够较长时间控制释放rhBMP2和bFGF,保护生长因子在牙周再生中发 挥更好的作用，以实现牙周组织完全再生，恢复牙周功能，本发明的目的是提供 一种复合生物素化壳聚糖膜的制备及其在牙周组织再生中的应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种复合生物素化壳聚糖膜，其特征在于它包含人重组骨形成蛋白-2
(rhBMP2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，所述人重组骨形成蛋白-2和碱 性成纤维细胞生长因子均由壳聚糖微球包裹；人重组骨形成蛋白-2壳聚糖微球 和碱性成纤维细胞生长因子壳聚糖微球均被包裹于复合生物素化壳聚糖膜中。上述一种复合生物素化壳聚糖膜的制法，包括以下步骤1) 以壳聚糖微球包裹人重组骨形成蛋白-2，制成人重组骨形成蛋白-2壳 聚糖微球；2) 以壳聚糖微球包裹碱性成纤维细胞生长因子，制成碱性成纤维细胞生 长因子壳聚糖微球；3) 分别将人重组骨形成蛋白-2壳聚糖微球和碱性成纤维细胞生长因子壳 聚糖微球加入壳聚糖醋酸溶液中，干燥，制成复合生物素化壳聚糖膜。干燥时， 应在4'C条件下。上述一种复合生物素化壳聚糖膜在牙周组织再生中的应用。又一种复合生物素化壳聚糖膜，其特征在于它包括人重组骨形成蛋白-2， 所述人重组骨形成蛋白-2由壳聚糖微球包裹；人重组骨形成蛋白-2壳聚糖微球 被包裹于生物素化壳聚糖膜中。又一种复合生物素化壳聚糖膜的制法，包括以下步骤1) 以壳聚糖微球包裹人重组骨形成蛋白-2，制成人重组骨形成蛋白-2壳 聚糖微球；2) 将人重组骨形成蛋白-2壳聚糖微球加入壳聚糖醋酸溶液中，干燥，制 成复合生物素化壳聚糖膜。干燥时，应在4'C条件下。又一种复合生物素化壳聚糖膜在牙周组织再生中的应用。再一种复合生物素化壳聚糖膜，其特征在于它包括碱性成纤维细胞生长 因子，所述碱性成纤维细胞生长因子由壳聚糖微球包裹；碱性成纤维细胞生长 因子壳聚糖微球包裹于生物素化壳聚糖膜中。再一种复合生物素化壳聚糖膜的制法，包括以下步骤1)以壳聚糖微球包裹碱性成纤维细胞生长因子，制成碱性成纤维细胞生 长因子壳聚糖微球；2)将碱性成纤维细胞生长因子壳聚糖微球加入壳聚糖醋酸溶液中，干燥， 制成复合生物素化壳聚糖膜。干燥时，应在4'C条件下。再一种复合生物素化壳聚糖膜在牙周组织再生中的应用。 本发明利用rhBMP2和bFGF生物学功能及壳聚糖特点，以组织相容性良好的 壳聚糖微球作为rhBMP2和bFGF的载体/控释系统,制成一种载rhBMP2或载bFGF 或载rhBMP2和bFGF两种生长因子壳聚糖微球的新型GTR壳聚糖膜——复合生物 素化壳聚糖膜，为牙周病的治愈提供一种有效的方法，也为实现牙周组织完全再 生提供一种新的途径。本发明利用rhBMP2和bFGF生物学功能和壳聚糖微球的作用特点，通过 Berthold等的沉淀/凝聚法制成壳聚糖微球，用壳聚糖微球包封rhBMP2和bFGF， 形成rhBMP2和bFGF壳聚糖微球。将该微球均匀散布于壳聚糖醋酸溶液中，在一 定条件下成膜，从而制成生物素化屏障膜。因该膜中含有rhBMP2和bFGF壳聚糖 微球，能够较长时间控制释放rhBMP2和bFGF，保护生长因子在牙周再生中发挥 更好的作用。以实现牙周组织完全再生，恢复牙周功能。本发明必将为广大牙 周病患者造福，其社会效益和经济效益很大。
附图是本发明中第一实施例中复合生物素化壳聚糖膜的制法示意图。
具体实施方式
实施例1一种复合生物素化壳聚糖膜，它包括人重组骨形成蛋白-2 (rhBMP2)和碱 性成纤维细胞生长因子(bFGF)，人重组骨形成蛋白-2和碱性成纤维细胞生长 因子均由壳聚糖微球包裹；人重组骨形成蛋白-2壳聚糖微球和碱性成纤维细胞 生长因子壳聚糖微球均被包裹于复合生物素化壳聚糖膜中。上述一种复合生物素化壳聚糖膜的制法，包括以下步骤1) 以壳聚糖微球包裹人重组骨形成蛋白-2，制成人重组骨形成蛋白-2壳 聚糖微球；2) 以壳聚糖微球包裹碱性成纤维细胞生长因子，制成碱性成纤维细胞生 长因子壳聚糖微球；3)分别将人重组骨形成蛋白-2壳聚糖微球和碱性成纤维细胞生长因子壳聚 糖微球加入壳聚糖醋酸溶液中，在4'C条件下干燥，制成复合生物素化壳聚糖膜。 上述一种复合生物素化壳聚糖膜在牙周组织再生中的应用。 本实施例中，(1) 以壳聚糖微球作为的载体/控释系统，实现rhBMP2和bFGF能够缓释， 保护rhBMP2和bFGF不被蛋白水解之目的，(2) 在壳聚糖膜加入载rhBMP2和bFGF壳聚糖微球，制成复合生物素化壳 聚糖膜。实施例2又一种复合生物素化壳聚糖膜，它包括人重组骨形成蛋白-2，所述人重组 骨形成蛋白-2由壳聚糖微球包裹；人重组骨形成蛋白-2壳聚糖微球被包裹于生 物素化壳聚糖膜中。又一种复合生物素化壳聚糖膜的制法，包括以下步骤1) 以壳聚糖微球包裹人重组骨形成蛋白-2，制成人重组骨形成蛋白-2壳 聚糖微球；2) 将人重组骨形成蛋白-2壳聚糖微球加入壳聚糖醋酸溶液中，4t:条件下 干燥，制成复合生物素化壳聚糖膜。又一种复合生物素化壳聚糖膜在牙周组织再生中的应用。 实施例3再一种复合生物素化壳聚糖膜，它包括碱性成纤维细胞生长因子，所述碱 性成纤维细胞生长因子由壳聚糖微球包裹；在碱性成纤维细胞生长因子壳聚糖 微球外包裹生物素化壳聚糖膜。再一种复合生物素化壳聚糖膜的制法，包括以下步骤1) 以壳聚糖微球包裹碱性成纤维细胞生长因子，制成碱性成纤维细胞生 长因子壳聚糖微球；2) 将碱性成纤维细胞生长因子壳聚糖微球加入壳聚糖醋酸溶液中，在4 。C条件下，干燥、制成复合生物素化壳聚糖膜。再一种复合生物素化壳聚糖膜在牙周组织再生中的应用。 以下具体描述制备方法 rhBM&和bFGF壳聚糖微球的制备如下釆用Berthold等的沉淀/凝聚法制成壳聚糖微球，该方法不用有机溶剂和 成二醛。在0. 25%壳聚糖醋酸溶液中，加入分散剂吐温将20%硫酸钠溶液滴入搅拌的 壳聚糖溶液中，经过超声、离心分离、洗涤纯化和冷冻干燥得壳聚糖微球。取 一定量的壳聚糖微球加入壳聚糖醋酸溶液中，分别加一定量的rhBMP2， 4'C条件 下磁力搅拌，离心沉淀，洗涤纯化，冷冻干燥即得rhBMP2壳聚糖微球。将离心 液、洗涤液收集合并，称为"合并液"。同法制成bFGF壳聚糖微球。将rhBMP2壳聚糖微球和bFGF壳聚糖微球加入2%壳聚糖醋酸溶液中，低温 磁力搅拌均匀，灌入模具，4'C干燥成膜，即制成复合生物素化壳聚糖膜。同法 制得分别含rhBMP2壳聚糖微球和bFGF壳聚糖微球的生物素壳聚糖膜及空白壳聚 糖微球膜，共制取得到如下四种膜1、 含rhBMP2壳聚糖微球生物素化壳聚糖膜；2、 含bFGF壳聚糖微球生物素化壳聚糖膜；3、 含有rhBMP2壳聚糖微球和bFGF壳聚糖微球的复合生物素化壳聚糖膜；4、 含空白壳聚糖微球的壳聚糖膜。在光学显微镜下观察，所得的空白壳聚糖微球表面光滑，大小较均匀，在 生理盐水中分散性好，粒径范围1. 2 3. 8陶。rhBMP2壳聚糖微球和bFGF壳聚糖微球载药量及包封率测定如下根据rhBM^和bFGF酶联免疫测试剂盒提供的方法，用DG3022酶联免疫检 测仪，于492nm处测定吸光度(A)值，绘制标准曲线，同法测定"合并液"A492 值。按下式计算壳聚糖微球载药量和包封率载药量(用药量一合并液中药物量)/微球重量X100鬼包封率=(用药量一合并液中药物量)/用药量xiocm体外释药实验用动态透析法进行壳聚糖微球体外释药试验，取rhBMP2壳聚糖微球和bFGF 壳聚糖微球，混悬于磷酸盐缓冲液中，37'C温磁力搅拌，每间隔一段时间取样离 心，取上清液，按一定比例稀释，测定rhBMP2和bFGF浓度。以测定rhBMP2壳聚糖微球和bFGF壳聚糖微球体外释放特征。体外rhBMP2壳聚糖微球和bFGF壳聚糖微球对人牙周膜细胞增殖的影响在体外培养人第5代人牙周膜细胞培养液中加入rhBMP2壳聚糖微球和bFGF 壳聚糖微球，共同孵育，定期观察人牙周膜细胞的增殖、粘附情况，来鉴定微 球的增殖活性，同法设立rhBMP2壳聚糖微球组和bFGF壳聚糖微球组，空白壳聚 糖微球组作为对照。通过动物实验观察复合生物素化壳聚糖膜在牙周组织再生中的作用。将制得的膜分别植入狗牙周病模型中，以相同的时间间隔处死动物取材， 通过组织形态学、骨定量分析、X片等观察方法，比较各组牙周组织再生情况， 明确生物素化壳聚糖膜能够有效地诱导牙周组织再生，恢复牙周功能。对rhBMP2壳聚糖微球和bFGF壳聚糖微球载药量、包封率及体外控制释放 作用测定。壳聚糖微球中bFGF含量为7.81mg/g或4. 68X 104u/mg。包封率为 93. 7%。壳聚糖微球中rhBMP-2含量为91. 8rag/g或9.18xl(fu/g。包封率为91. 8%。bFGF壳聚糖微球体外释放特征初期释药较快，第20天累计释放度约61. 5%。rhBMP2壳聚糖微球体外释放特征第20天累计释放度约64. 4% 。 在体外培养人第5代人牙周膜细胞培养液中分别加入rhBMP2壳聚糖微球和 bFGF壳聚糖微球，共同孵育，定期观察人牙周膜细胞的增殖、粘附情况，可明 显促进牙周膜细胞的增殖。完成了 rhBMP2壳聚糖微球和bFGF壳聚糖微球活性鉴 定。通过动物实验观察生物素化壳聚糖膜在牙周组织再生中的作用① 含rhBMP2壳聚糖微球生物素化壳聚糖膜缓释bFGF壳聚糖膜(实验组) 新生牙槽骨、牙骨质、牙周纤维明显多于对照组(P<0.01)，且较成熟， 形态较规则，与正常牙周韧带结构相似。② 含bFGF壳聚糖微球生物素化壳聚糖膜实验组新生牙槽骨、牙骨质、 牙周纤维明显多于对照组(P<0.01)。③ 含有rhBMP2壳聚糖微球和bFGF壳聚糖微球的复合生物素化壳聚糖膜 新生牙槽骨、牙骨质、牙周纤维明显多于对照各组。本发明将生物医学工程技术、药剂学和牙周病学交叉结合起来，研制一种新 型引导牙周组织再生壳聚糖膜——生物素化壳聚糖膜。该膜中含有一种独特的rhBMP2和bFGF载体/控释系统——壳聚糖微球，壳聚糖微球能够稳定地控释其中 的rhBMPa和bFGF，使它们能在足够的时间诱导牙周组织再生，以实现牙周组织 的完全再生。
权利要求
1、一种复合生物素化壳聚糖膜，其特征在于它包含人重组骨形成蛋白-2和碱性成纤维细胞生长因子，所述人重组骨形成蛋白-2和碱性成纤维细胞生长因子均由壳聚糖微球包裹；人重组骨形成蛋白-2壳聚糖微球和碱性成纤维细胞生长因子壳聚糖微球均被包裹于复合生物素化壳聚糖膜中。
2、 一种权利要求1所述复合生物素化壳聚糖膜的制法，包括以下步骤1) 以壳聚糖微球包裹人重组骨形成蛋白-2，制成人重组骨形成蛋白-2壳 聚糖微球；2) 以壳聚糖微球包裹碱性成纤维细胞生长因子，制成碱性成纤维细胞生 长因子壳聚糖微球；3) 分别将人重组骨形成蛋白-2壳聚糖微球和碱性成纤维细胞生长因子壳 聚糖微球加入壳聚糖醋酸溶液中，干燥，制成复合生物素化壳聚糖膜。
3、 一种权利要求1所述复合生物素化壳聚糖膜在牙周组织再生中的应用。
4、 一种复合生物素化壳聚糖膜，其特征在于它包含人重组骨形成蛋白 -2，所述人重组骨形成蛋白-2由壳聚糖微球包裹；人重组骨形成蛋白-2壳聚糖 微球被包裹于生物素化壳聚糖膜中。
5、 一种权利要求4所述复合生物素化壳聚糖膜的制法，包括以下步骤1) 以壳聚糖微球包裹人重组骨形成蛋白-2，制成人重组骨形成蛋白-2壳 聚糖微球；2) 将人重组骨形成蛋白-2壳聚糖微球加入壳聚糖醋酸溶液中，干燥，制 成复合生物素化壳聚糖膜。
6、 一种权利要求4所述复合生物素化壳聚糖膜在牙周组织再生中的应用。
7、 一种复合生物素化壳聚糖膜，其特征在于它包含碱性成纤维细胞生 长因子，所述碱性成纤维细胞生长因子由壳聚糖微球包裹；在碱性成纤维细胞 生长因子壳聚糖微球被包裹于生物素化壳聚糖膜中。
8、 一种权利要求7所述复合生物素化壳聚糖膜的制法，包括以下步骤1) 以壳聚糖微球包裹碱性成纤维细胞生长因子，制成碱性成纤维细胞生长因子壳聚糖微球；2) 将碱性成纤维细胞生长因子壳聚糖微球加入壳聚糖醋酸溶液中，干燥， 制成复合生物素化壳聚糖膜。
9、 一种权利要求7所述复合生物素化壳聚糖膜在牙周组织再生中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种复合生物素化壳聚糖膜的制法及其在牙周组织再生中的应用，复合生物素化壳聚糖膜中包含载人重组骨形成蛋白-2(rhBMP<sub>2</sub>)壳聚糖微球和载碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)壳聚糖微球，rhBMP<sub>2</sub>和bFGF均由壳聚糖微球包裹；rhBMP<sub>2</sub>壳聚糖微球和bFGF壳聚糖微球均被包裹于复合生物素化壳聚糖膜中。也可以是rhBMP<sub>2</sub>壳聚糖和bFGF壳聚糖中的任意一种壳聚糖微球被包裹于复合生物素化壳聚糖膜中。本发明能够较长时间控制释放rhBMP<sub>2</sub>和bFGF，保护生长因子在牙周再生中发挥更好的作用，以实现牙周组织完全再生，恢复牙周功能。
文档编号A61K38/18GK101152564SQ200710132648
公开日2008年4月2日 申请日期2007年9月18日 优先权日2007年9月18日
发明者卜寿山, 许金菊, 金颂良 申请人:江苏省人民医院