专利名称：聚乙二醇修饰的科博肽及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种科博肽及其制备方法和用途，特别是涉及一种聚乙二醇修饰的科博肽及其制备方法和用途。
二.
背景技术：
蛋白质药物临床应用的安全性和有效性一直是世界各国医学工作者关注和研究的热点，由于其稳定性差，血浆清除率高，体内半衰期短，易产生抗原抗体反应，在临床治疗中受到很大的限制。因此研究人员采用了各种药物传递技术来提高蛋白质药物的疗效，降低蛋白质药物的副作用，包括采用不同的给药途径(如口服，鼻腔给药，透皮吸收)，不同的载体(如微球，脂质体，红细胞，单克隆抗体)，不同高分子材料(如多糖)，不同药物释放技术(如控释缓释技术，前药)。而目前在药物传递技术中研究最为广泛的就是聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰技术，这是近三十年来发展起来的一种用于改进蛋白质类药物体内药动学性质的新技术，它将活化的聚乙二醇分子键合到蛋白质分子表面上，影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变，目前大多数的研究是将多肽分子中的氨基作为修饰位点。制备蛋白质和聚乙二醇结合物的最常用的方法是利用PEG活化后形成的亲电子基团和蛋白质上的氨基进行反应，反应后可以在一个蛋白分子上共价连接数个聚合物长链，聚合物长链的数目取决于蛋白质分子上可供结合的位点数(自由氨基和其他亲电子基团)、修饰剂的化学性质，修饰剂的过量比例及反应条件。PEG的衍生物有芳化试剂(含氯化芳基基团，可以与蛋白质上的亲核基团反应)、酰化试剂(含酰基，与蛋白质通过酰基键相连)或烷化试剂(与蛋白质上的氨基形成仲氨连接)。研究证实，通过共价键用聚乙二醇来修饰蛋白质表面的氨基酸残基可以有效降低蛋白质的免疫原性，提高血浆半衰期，减少给药次数。但此方法修饰产物的生物活性保留较低和修饰后产物难于纯化的不足，不能满足蛋白质药物在临床应用方面的要求。
科博肽是从蛇毒中分离提纯的低分子多肽，其化学名称为蛇毒神经毒素(neurotoxin)，它是由68个氨基组成的单链多肽，四个二硫键维系其空间结构，分子量在7000道尔顿左右。长期的临床使用表明，科博肽具有良好的镇痛效果，具有无成瘾性、无耐受性，镇痛作用持久，使用方便的特点，对停用或禁戒海洛因后出现的各种生理和精神依赖症状均有一定疗效，应用范围广，尤其适用于慢性、顽固性、持续性疼痛治疗，出现疗效后可减量维持。由于对人体而言科博肽属异源蛋白，所以在使用过程中同样具有蛋白质药物所共有的特点，如具有免疫原性，半衰期短，稳定性差等，其中由科博肽引起的过敏反应已有报道(刘文，陈慧，郑惠科洛曲片致过敏性休克，药物不良反应杂志[J].2001，(3)196.)。因此，有必要采用蛋白质修饰技术以获得低免疫原性的科博肽，从而改善该蛋白质的药物动力学以提高其耐受性和减少给药次数。
三.
发明内容
本发明的目的是克服科博肽作为药物使用所存在的不足，采用聚乙二醇修饰技术对科博肽的氨基进行修饰，来获得聚乙二醇修饰的科博肽。
本发明的技术方案是一种聚乙二醇修饰的科博肽，其结构通式为 其中m为单甲氧基的缩写，n1＝0～3，优选n1＝2，R代表去除一个氨基NH2的科博肽分子，聚乙二醇修饰的科博肽的分子量为10000～110000。
所述的聚乙二醇修饰的科博肽的分子量优选值为15000～70000。
所述的聚乙二醇修饰的科博肽的制备方法为在科博肽溶液中，加入磷酸氢二钠溶液，调节其pH值在4.5-9.5范围，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，所加入的活化的聚乙二醇或其衍生物与科博肽的摩尔比为0.1～100∶1，反应温度为4～40℃，反应时间为5～120分钟，将反应混合液采用凝胶过滤色谱柱进行色谱分离，即可得到聚乙二醇修饰的科博肽。
制备反应按下式进行 其中R-NH2为科博肽，mPEG为CH3O-(CH2CH2O)n2-CH2CH2OHm＝单甲氧基(monomethoxy)的缩写，n2＝44～2200，优选n2＝100～700；R代表代表去除一个氨基(NH2)的科博肽分子。
所述的聚乙二醇或聚乙二醇衍生物链的分子量为2000～100000。
所述的聚乙二醇或聚乙二醇衍生物链的分子量的优选值为5000～30000。
所述的科博肽为从蛇毒中提取的科博肽，或为用基因工程手段制备的重组科博肽，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠缓冲液，或为磷酸氢二钾缓冲液。
所述的聚乙二醇衍生物为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000，或为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000，或为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000，或为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000，或为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000，或为丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000，或为丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000，或为丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000，或为丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000，或为丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000。
在聚乙二醇修饰的科博肽的制备方法中，优选的反应条件为调节pH值在6.0～7.0范围，反应温度为20～25℃，反应时间为25～35分钟。
所加入的活化的聚乙二醇或其衍生物与科博肽的优选摩尔比为8～12∶1。
聚乙二醇修饰的科博肽在制备高效低毒的镇痛药物上的应用。
本发明的积极有益效果是1.本发明的聚乙二醇修饰的科博肽能够基本保持科博肽的生物活性，同时它比未修饰的科博肽有较低的免疫原性和更好的稳定性，因此作为镇痛药物，它比未修饰的科博肽有更大的优越性。
研究试验用小鼠扭体法比较聚乙二醇修饰科博肽和科博肽的镇痛效果，用小鼠扭体抑制率来表示镇痛效果，结果如下表
结果表明科博肽经聚乙二醇修饰后，其镇痛的生物活性得到了较高保留，同时作用时间延长。
2.同科博肽比较，本发明聚乙二醇修饰的科博肽的热稳定性明显增加热稳定性试验取科博肽和聚乙二醇修饰的科博肽(在液体状态，无任何保护剂)，分别置于25℃、37℃、45℃、60℃条件下，定时取样测定其生物活性。结果表明，科博肽在60℃下30min内活性不变，而聚乙二醇修饰的科博肽在90min内活性不变；在25℃时科博肽10天内活性不变，而聚乙二醇修饰的科博肽在30天内活性不变，因此，可以断定聚乙二醇修饰的科博肽的热稳定性明显增加。
3.同科博肽比较，本发明的聚乙二醇修饰的科博肽抵抗胰蛋白酶水解的能力明显增加
酶稳定性试验取0.1％胰蛋白酶溶液(pH7.8)2.7ml，分别加入0.3ml科博肽和聚乙二醇修饰的科博肽样品，37℃水浴，于0、0.5、1、2、4h取样0.3ml，测定样品的生物活性，结果表明科博肽在0.5h内活性迅速降到原来的20％，而聚乙二醇修饰的科博肽在1h内活性仅降到原来的50％，因此，聚乙二醇修饰的科博肽抵抗胰蛋白酶水解的能力明显增加。
4.同科博肽比较，本发明的聚乙二醇修饰的科博肽的毒性明显降低聚乙二醇修饰的科博肽与科博肽的急性毒性试验比较研究试验将四种不同浓度的聚乙二醇修饰的科博肽和科博肽注射至体重为20-25g的小鼠的腹腔内，每种浓度注射8只小鼠，计算聚乙二醇修饰科博肽和科博肽引起50％死亡的剂量(LD50)。(LD50计算方法参见Reed LJ and Muench H.Am.J.Hygiene，1938；27493.)，结果测定出科博肽LD50为0.20mg/kg，聚乙二醇修饰的科博肽10.0mg/kg。因此，科博肽经聚乙二醇修饰后，其毒性显著降低。
5.同科博肽比较，本发明的聚乙二醇修饰的科博肽的免疫原性显著降低。
聚乙二醇修饰的科博肽对实验动物免疫原性的研究试验以家兔作为制备抗血清的实验动物，采用福氏佐剂免疫法，并分别以科博肽和聚乙二醇修饰的科博肽作为抗原，剂量均为20μg/kg/次，每周1次，共5次。
分别以科博肽和聚乙二醇修饰的科博肽作为抗原，用双向免疫扩散法测定它们各自抗血清的效价，测定结果为科博肽组抗血清的效价为1∶16；聚乙二醇修饰的科博肽组抗血清的效价测不出。
分别以科博肽和聚乙二醇修饰的科博肽作为抗原，然后用科博肽组的抗血清作为第一抗体，再以辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG作为第二抗体，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定它们各自的免疫原性，测定结果为科博肽组为阳性，聚乙二醇修饰的科博肽组为阴性。
以上结果表明同科博肽比较，聚乙二醇修饰的科博肽的免疫原性显著降低。
四.
图1是聚乙二醇修饰的科博肽的分离纯化图谱；图2是聚乙二醇修饰的科博肽的HPLC分析图谱；
图3是科博肽的HPLC分析图谱。
五.
具体实施例方式实施例一聚乙二醇修饰的科博肽的分离纯化与鉴定取1.1mg/ml的科博肽溶液2ml，加磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为6.5，再加入mPEG-SPA-5000固体15.7mg，溶解，混匀，于25℃反应30min，加入100mg甘氨酸终止反应。
取上述反应液，用截流分子量为10000的超滤膜浓缩至2ml，上柱分离。色谱条件如下层析填料Superdex 75pre grade柱规格1.6×60cm流动相0.05M Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.0流速0.4ml/min检测波长215nm收集每管2ml结果得到两个洗脱峰，分别为聚乙二醇修饰的科博肽和科博肽，具体结果参见图1，图中保留体积65.68的峰为聚乙二醇化科博肽峰，保留体积为72.56的峰为科博肽峰。
采用高效液相色谱(HPLC)对得到的组分峰进行分析，合并相同组分。色谱条件如下色谱柱Symmetry300TMC45μm；3.9×150mm检测波长215nm流动相A)水/三氟乙酸(100/0.1)B)水/三氟乙酸/乙腈(10/0.1/90)梯度洗脱方法B(0～18min，20％～100％)流速1.0ml/min柱温37℃，HPLC分析结果表明得到的聚乙二醇修饰的科博肽和科博肽的纯度均在95％以上，具体结果参见图2和图3，图中保留时间为12.850min的为聚乙二醇修饰科博肽，保留时间为12.440min的为科博肽。
采用SDS-PAGE对聚乙二醇修饰科博肽和科博肽进行分子量测定，结果表明聚乙二醇修饰科博肽的分子量在12000道尔顿，科博肽的分子量为7000道尔顿，二者相差5000左右，这表明该聚乙二醇修饰科博肽为单修饰，也即是结合了一分子的聚乙二醇。
实施例二取1.5mg/ml的科博肽溶液2ml，加2ml磷酸氢二钠缓冲液使溶液的pH值为6.5，再加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SPA-5000)固体1.6mg，溶解，混匀，取0.3ml置于带塞试管中，然后置于4℃条件下进行反应，30min后终止反应，将反应混合液采用凝胶过滤色谱柱进行色谱分离，即可得到聚乙二醇修饰的科博肽，比较修饰率，确定修饰条件，此时的修饰率为40％。
实施例三本实施例与实施例二基本相同，相同之处不重述，不同之处在于在10℃条件下进行反应，其修饰率为50％。
实施例四本实施例与实施例二基本相同，相同之处不重述，不同之处在于在25℃条件下进行反应，其修饰率为60％。
实施例五本实施例与实施例二一基本相同，相同之处不重述，不同之处在于在37℃条件下进行反应，其修饰率为45％。
从上述实施例二至实施例五可以得出反应温度在25℃时，所得到的聚乙二醇修饰的科博肽的修饰率最高。
实施例六取1.5mg/ml的科博肽溶液2ml，加2ml磷酸氢二钠缓冲液，使溶液的pH值为6.5，再加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SPA-5000)固体1.6mg，溶解，混匀，取0.3ml置于带塞试管中，然后置于25℃条件下进行反应，5min后终止反应，将反应混合液采用凝胶过滤色谱柱进行色谱分离，即可得到聚乙二醇修饰的科博肽，比较修饰率，确定修饰条件，此时的修饰率为40％。
实施例七本实施例与实施例六基本相同，相同之处不重述，不同之处在于反应时间为10min，其修饰率为45％。
实施例八本实施例与实施例六基本相同，相同之处不重述，不同之处在于反应时间为15min，其修饰率为50％。
实施例九本实施例与实施例六基本相同，相同之处不重述，不同之处在于反应时间为30min，其修饰率为60％。
实施例十本实施例与实施例六基本相同，相同之处不重述，不同之处在于反应时间为60min，其修饰率为60.5％。
实施例十一本实施例与实施例六基本相同，相同之处不重述，不同之处在于反应时间为120min，其修饰率为60.8％。
从上述实施例六至实施例十一可以得出反应时间超过30min后，所得到的聚乙二醇修饰的科博肽的修饰率没有明显提高。
实施例十二取0.5mg/ml的科博肽溶液2ml，置于带塞试管中，加入磷酸氢二钠缓冲液，使溶液的pH值为4.5，再加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SPA-5000)固体7.0mg，溶解，混匀，在25℃条件下反应30min后终止反应，将反应混合液采用凝胶过滤色谱柱进行色谱分离，即可得到聚乙二醇修饰的科博肽，比较修饰率，确定修饰条件，此时的修饰率为40％。
实施例十三本实施例与实施例十二基本相同，相同之处不重述，不同之处在于溶液的pH值调为5.5，其修饰率为50％。
实施例十四本实施例与实施例十二基本相同，相同之处不重述，不同之处在于溶液的pH值调为6.5，其修饰率为60％。
实施例十五本实施例与实施例十二基本相同，相同之处不重述，不同之处在于溶液的pH值调为7.5，其修饰率为50％。
实施例十六本实施例与实施例十二基本相同，相同之处不重述，不同之处在于溶液的pH值调为8.5，其修饰率为40％。
实施例十七本实施例与实施例十二基本相同，相同之处不重述，不同之处在于溶液的pH值调为9.5，其修饰率为35％。
从上述实施例十二至实施例十七可以得出反应溶液的pH值调为6.5时，所得到的聚乙二醇修饰的科博肽的修饰率最高。
实施例十八取1.5mg/ml的科博肽溶液2ml，加2ml磷酸氢二钠缓冲液，使溶液的pH值为6.5，取0.3ml置于带塞试管中，然后加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SPA-5000)固体0.016mg(相当于丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000同科博肽的摩尔比为0.1∶1)，溶解，混匀，反应30min后终止反应，将反应混合液采用凝胶过滤色谱柱进行色谱分离，即可得到聚乙二醇修饰的科博肽，比较修饰率，确定修饰条件，此时的修饰率为50％。
实施例十九本实施例与实施例十八基本相同，相同之处不重述，不同之处在于加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SPA-5000)固体0.16mg(相当于丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000同科博肽的摩尔比为1∶1)，此时的修饰率为55％。
实施例二十本实施例与实施例十八基本相同，相同之处不重述，不同之处在于加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SPA-5000)固体1.6mg(相当于丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000同科博肽的摩尔比为10∶1)，此时的修饰率为60％。
实施例二十一本实施例与实施例十八基本相同，相同之处不重述，不同之处在于加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SPA-5000)固体16mg(相当于丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000同科博肽的摩尔比为100∶1)，此时的修饰率为60％。
从上述实施例十八至实施例二十一可以得出当丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SPA-5000)同科博肽的摩尔比为10∶1时，所得到的聚乙二醇修饰的科博肽的修饰率最高。
用聚乙二醇的其它衍生物如丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SBA-2000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SBA-5000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SBA-10000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SBA-20000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000(mPEG-SBA-30000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SPA-2000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SPA-10000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SPA-20000)或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000(mPEG-SPA-30000)分别代替上述实施例中的丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SPA-5000)，可以组成多个实施例，得到与实施例二至实施例二十一相似的结果，这些都在本发明的范围之内，在此不一一详述。
权利要求
1.一种聚乙二醇修饰的科博肽，其结构通式为 其中m为单甲氧基的缩写，n1＝0～3，R代表去除一个氨基NH2的科博肽分子，聚乙二醇修饰的科博肽的分子量为10000～110000。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的科博肽，其特征是n1＝2，聚乙二醇修饰的科博肽的分子量为15000～70000。
3.一种权利要求1所述的聚乙二醇修饰的科博肽的制备方法，在科博肽上连接聚乙二醇或聚乙二醇衍生物链，其特征是在科博肽溶液中，加入磷酸盐缓冲液，调节其pH值在4.5-9.5范围，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，所加入的活化的聚乙二醇或其衍生物与科博肽的摩尔比为0.1～100∶1，反应温度为4～40℃，反应时间为5～120分钟，将反应混合液采用凝胶过滤色谱柱进行色谱分离，即可得到聚乙二醇修饰的科博肽。
4.根据权利要求3所述的聚乙二醇修饰的科博肽的制备方法，其特征是所述的聚乙二醇或聚乙二醇衍生物链的分子量为2000～100000。
5.根据权利要求4所述的聚乙二醇修饰的科博肽的制备方法，其特征是所述的聚乙二醇或聚乙二醇衍生物链的分子量为5000～30000。
6.根据权利要求3所述的聚乙二醇修饰的科博肽的制备方法，其特征是所述的科博肽为从蛇毒中提取的科博肽，或为用基因工程手段制备的重组科博肽，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠缓冲液，或为磷酸氢二钾缓冲液。
7.根据权利要求3所述的聚乙二醇修饰的科博肽的制备方法，其特征是所述的聚乙二醇衍生物为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000，或为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000，或为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000，或为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000，或为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000，或为丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000，或为丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000，或为丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000，或为丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000，或为丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000。
8.根据权利要求3所述的聚乙二醇修饰的科博肽的制备方法，其特征是调节pH值在6.0～7.0范围，反应温度为20～25℃，反应时间为25～35分钟。
9.根据权利要求3所述的聚乙二醇修饰的科博肽的制备方法，其特征是所加入的活化的聚乙二醇或其衍生物与科博肽的摩尔比为8～12∶1。
10.聚乙二醇修饰的科博肽在制备高效低毒的镇痛药物上的应用。
全文摘要
本发明涉及一种科博肽及其制备方法和用途，特别是涉及一种聚乙二醇修饰的科博肽及其制备方法和用途。聚乙二醇修饰的科博肽的结构通式为(Ⅰ)，其制备方法为在科博肽溶液中，加入磷酸氢二钠溶液，调节其pH值在4.5－9.5范围，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，所加入的活化的聚乙二醇或其衍生物与科博肽的摩尔比为0.1～100∶1，反应温度为4～40℃，反应时间为5～120分钟，将反应混合液采用凝胶过滤色谱柱进行色谱分离，即可得到聚乙二醇修饰的科博肽。本发明的聚乙二醇修饰的科博肽能够基本保持科博肽的生物活性，同时它比未修饰的科博肽有较低的免疫原性和更好的稳定性，因此作为镇痛药物，它比未修饰的科博肽有更大的优越性。
文档编号A61P25/04GK1730494SQ20051001781
公开日2006年2月8日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者任晚琼, 朱天新, 刘永杰, 刘国良, 魏舒 申请人:河南省中泰药业有限公司