聚乙二醇修饰的人血白蛋白及其制备方法

专利名称：：聚乙二醇修饰的人血白蛋白及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药
技术领域：
，特别是聚乙二醇修饰的人血白蛋白及其制备方法。
背景技术：
：人血白蛋白(humanserumalbumin,HSA)是一种含585个氨基酸残基的单链无糖基化蛋白质，是人血浆中最丰富的蛋白质，约占血浆总蛋白的60%。人血白蛋白是临床上常用的一种天然血液制品，由健康人的血浆中分离提取制成，属于血容量扩充药物，主要用于治疗失血、烧伤及创伤等引起的休克，脑水肿、大脑损伤所致的颅内压升高，以及低蛋白血症及肝硬化或肾病引起的水肿和腹水。人血白蛋白适应症广泛，且用量大(每个病人每天人血白蛋白用量达几克)，拥有巨大的市场需求量。近年来，由于血液来源紧张等原因致使人血白蛋白供应十分紧张，如何解决当前白蛋白紧缺的问题成为目前白蛋白研究的热点。基于此，科研工作者主要围绕以下两个方面展开研究，寻找人血白蛋白的替代品一是利用聚乙二醇(PEG)对非人源白蛋白进行修饰以消除其免疫原性，但其安全性让人担忧；二是利用基因重组技术生产人血清白蛋白(rHSA)，目前，利用细菌、真菌、植物及动物高效表达人血白蛋白已成功，但是实现药用级rHSA的大规模生产是个极具挑战性的课题。因为99.999%的纯度对于临床上一般的重组蛋白药物来说已经足够，而白蛋白的常规剂量通常为10g，该纯度的白蛋白中杂质绝对量(lmg)远远无法达到临床应用的要求。更高纯度rHSA的纯化步骤繁多，成本高，收率低，因此，目前rHSA工业化生产的例子很少，血浆来源人血白蛋白仍是临床用人血白蛋白的最主要来源。如果能够通过一定的手段增加人血白蛋白的分子量，将会大大增加人血白蛋白的血管保留率，延长其体内半衰期，降低用药频率，进而有效缓解人血白蛋白来源紧缺的问题。经检索，利用PEG及其衍生物修饰人血白蛋白制备人血白蛋白结合物，以延长给药周期，实现白蛋白长效给药的相关研究和应用还未见报道。
发明内容针对现有技术的不足，本发明提供了聚乙二醇(简称PEG，下同)修饰的人血白蛋白及其制备方法的技术方案，其目的在于克服上述人血白蛋白在临床应用中所存在的缺点。本发明所述的聚乙二醇修饰的人血白蛋白，分别由白蛋白分子上的34位半胱氨酸残基的巯基J-末端氨基或自由氨基结合聚乙二醇构成，所述34位半胱氨酸巯基定点单修饰所采用的修饰剂是聚乙二醇-马来酰亚胺(mPEG-MAL);所述N-末端氨基定点单修饰所采用的修饰剂为单甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD);所述自由氨基随机修饰所采用的修饰剂为单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺活性酯或氰尿酰氯活化的单甲氧基聚乙二醇，结合聚乙二醇的白蛋白分子上的自由氨基的修饰率是3%-78%;随着修饰反应的进行，其自由氨基的修饰率逐渐增大。上述的白蛋白的34位半胱氨酸的聚乙二醇定点单修饰产物中所述修饰剂mPEG-MAL的分子量范围为500-80000道尔顿。其中所述修饰剂mPEG-MAL的优选分子量范围为1000-40000道尔顿。其中所述修饰剂mPEG-MAL的形状为直链或分枝状。其中所述修饰剂mPEG-MAL的形状优选为分枝状。上述的白蛋白的N-末端氨基的聚乙二醇定点单修饰产物中所述修饰剂mPEG-ALD的分子量范围为1000-80000道尔顿。其中所述修饰剂mPEG-ALD的优选分子量范围为1000-40000道尔顿。其中所述修饰剂mPEG-ALD的形状为直链或分枝状。其中所述修饰剂mPEG-ALD的形状优选为分枝状。上述的白蛋白的自由氨基的聚乙二醇随机修饰产物中所述自由氨基随机修饰所采用的修饰剂为mPEG-SPA、mPEG-SC、mPEG-SBA、mPEG-NHS、mPEG2_NHS和氰尿酰氯活化的mPEG其中的一种。其中所述自由氨基随机修饰所采用的修饰剂优选为mPEG-SPA、mPEG-SBA和mPEG2-NHS。其中所述自由氨基随机修饰所采用的修饰剂的分子量范围为500-40000道尔顿。其中所述自由氨基随机修饰所采用的修饰剂的优选分子量范围为1000-20000道尔顿。其中所述自由氨基随机修饰所采用的修饰剂的形状为直链或分枝状。其中所述白蛋白的自由氨基的mPEG随机修饰产物为2-45个mPEG链连接在一个白蛋白分子上。本发明所述PEG修饰的人血白蛋白制备方法，由以下步骤组成(1)将mPEG-MAL与白蛋白按摩尔比为2-20:1的比例溶于10-lOOmmol/L磷酸盐缓冲液(含1Ommol/LEDTA)中，在p朋.0-7.0，温度20-37。C条件下，轻轻振荡10_30h，即得白蛋白34位半胱氨酸的mPEG定点单修饰产物。或者，将mPEG-ALD与纯白蛋白按摩尔比为2-10:1的比例溶于20-80mmol/L醋酸盐缓冲液中，以5-50mmol/L硼氢化钠为还原剂，在pH5.0_5.5、温度15-37。C条件下，振荡反应5-30h，将反应液pH调为4，稀盐酸稀释5倍，终止反应，即得白蛋白的N-末端氨基mPEG定点单修饰产物。或者，将mPEG-琥珀酰亚胺活性酯(如mPEG-SPA)与白蛋白按摩尔比2_40:1的比例溶于P朋.5-9.5、10-50mmol/L的磷酸盐或硼酸盐缓冲液中，4-30。C轻轻振荡反应0.5-24h，即得白蛋白自由氨基的mPEG随机修饰产物。或者，将氰尿酰氯活化的mPEG与人血白蛋白按摩尔比2-40:l的比例溶于pH8-10、10mmol/L四硼酸钠缓冲液中，温度4-3(TC条件下，振摇反应0.5-24h后，加甘氨酸终止修饰反应，即得白蛋白自由氨基的mPEG随机修饰产物。其中，上述白蛋白以白蛋白的蛋白含量进行摩尔计算。(2)采用离子交换层析法分别对mPEG修饰的人血白蛋白进行分离纯化，pH5.0-7.0、10-50mmol/L磷酸盐缓冲液平衡、上样，0-lmol/LNaCl线性梯度洗脱，收集洗脱峰，冷冻干燥，制得纯品。上述的白蛋白的34位半胱氨酸的聚乙二醇定点单修饰产物制备方法中所述修饰剂mPEG-MAL与白蛋白的摩尔比优选为2:1;磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L，pH值为6.5;反应温度为30°C;反应时间为20h。上述白蛋白的N-末端氨基的mPEG定点单修饰产物制备方法中所述修饰剂mPEG-ALD与白蛋白的摩尔比优选为5:1;所述醋酸盐缓冲液的浓度优选为50mmol/L;硼氢化钠的浓度优选为20mmol/L;所述醋酸盐缓冲液的pH优选为5.0;反应温度为30°C;反应时间为24h。上述白蛋白的自由氨基的mPEG随机修饰产物制备方法中所述mPEG-琥珀酰亚胺活性酯(如mPEG-SPA)与白蛋白摩尔比优选为5-20:1，反应缓冲液优选为pH8.0、50mmo1/L的磷酸盐缓冲液；反应温度为20°C;反应时间优选为10h。上述白蛋白的自由氨基的mPEG随机修饰产物制备方法中，所述氰尿酰氯活化的mPEG与白蛋白的摩尔比优选为10:1;四硼酸钠缓冲液的pH值优选为9.0;反应温度为20°C;反应时间优选为10h。上述的聚乙二醇修饰的人血白蛋白制备方法中所述离子交换层析法优选采用DEAES印haroseFF层析介质对mPEG修饰的人血白蛋白进行分离纯化。上述的聚乙二醇修饰的人血白蛋白制备方法中所述离子交换层析法分离纯化mPEG修饰的人血白蛋白所用的平衡液的pH值优选为6.5，浓度优选为10mmol/L。本发明制得的聚乙二醇修饰的人血白蛋白与天然白蛋白相比，具有半衰期延长，血浆清除减慢等优良特性，有利于减少用药频率，缓解白蛋白来源紧张问题。具体实施例方式为清楚说明本发明所述方法的技术特点，下面结合实际例子对本发明做进一步说明，但本发明不受这些实施例的限制。聚乙二醇修饰的人血白蛋白制备的关键是修饰条件的控制。在此仅以白蛋白34位半胱氨酸的mPEG定点单修饰的反应条件和产物分离纯化及其在小鼠体内的药代动力学研究为例以说明修饰产物的制备方法及药代动力学性质。实施例1:修饰剂mPEG-MAL对人血白蛋白的定点单修饰反应mPEG-MAL(Mr=20kD)与人血白蛋白(以蛋白含量计)按照摩尔比2:1溶于p朋.5、50mmol/L磷酸盐缓冲液(含10mmol/LEDTA)，30°C水浴摇床，轻轻振摇20h。取3yL修饰反应液，进行SDS-PAGE检测，考染结果见图1。图1显示，与HSA相比修饰反应液泳道(mixtures泳道)出现了一个新的条带，分子量大约在90kD左右。修饰反应中所用PEG修饰剂的分子量为20kD，白蛋白分子量为66.5kD，则由此可以推断新出现的条带即为PEG-cys34-HSA，且是一个HSA分子连接一条PEG链。实施例2:白蛋白34位半胱氨酸的mPEG定点单修饰产物(PEG-cys34-HSA)的分离纯化采用DEAES印haroseFF层析介质分离修饰产物。修饰反应液用pH6.5，lOmmol/L磷酸盐缓冲液稀释5倍后上样，平衡液为p朋.5，10mmol/L磷酸盐缓冲液，O.1-0.3mol/LNaCl线性梯度洗脱5CV，流速为5.Oml/min，检测波长为280nm。洗脱曲线显示为两个洗脱峰，分别收集，超滤脱盐浓縮，采用SDS-PAGE电泳检测样品纯度，电泳胶片采用先碘染再考染的方法，碘染色是针对PEG的特异染色方法，游离PEG和与蛋白质结合的PEG均能着色；考马斯亮蓝染色能使蛋白质着色，则两种染料均能着色的条带即为PEG-cy产-HSA。DEAE层析图谱和SDS-PAGE图谱分别见图2和图3。图3显示碘染图谱中DEAE峰1(泳道4)只有一个条带，其上方未出现条带，下方游离PEG(泳道6)相应位置也未出现条带，说明峰1既不含多修饰产物也不含游离PEG。结果表明所采用的阴离子交换层析不仅能除去未反应的PEG修饰剂和HSA，还能除去修饰反应中生成的少量多修饰产物，获得的PEG-HSA可达到电泳级纯度。实施例3:PEG-cys34-HSA和HSA的二级结构测定采用圆二色谱(CD)法测定PEG-cys"-HSA和HSA的二级结构。分别称取10mgHSA和9mgPEG-cys34-HSA，溶于pH7.4、50mmol/L磷酸盐缓冲液中，使其蛋白终浓度均为5ymol/L。使用1mm比色池，25。C下分别测定HSA和PEG_cys34-HSA在190_260nm波长范围内的CD光谱。采用随机专用软件计算HSA和PEG-cys34-HSA的二级结构。HSA和PEG-cys34-HSA的圆二色谱(CD)见图4。由图4可知，HSA与PEG-cys34-HSA的CD图谱具有类似的峰形，两者的CD图谱几乎完全重合，这说明两者的二级结构几乎完全一致，随机软件计算出的二级结构也进一步证实了这一点(见表1)，提示PEG修饰并未影响HSA的二级结构。表lPEG-cys34-HSA和HSA的二级结构组成<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例4:PEG-cys34-HSA和人血白蛋白在小鼠体内的药代动力学研究通过125I放射性标记蛋白的方法，研究人血白蛋白及PEG-cys34-HSA在小鼠体内的血浆半衰期和组织分布等，将人血白蛋白与其修饰物进行比较，以期得到一种半衰期延长的人血白蛋白修饰产物。(1)人血白蛋白和PEG-cys34-HSA的125I放射性标记采用Iodogen法对蛋白质进行放射性标记。取涂布好的Iodogen管放置到室温，于管底加入pH7.4、0.05mol/L的磷酸盐缓冲液100PL，轻轻旋摇而后加入PEG-cys34-HSA(7mg/mL)10yL或人血白蛋白(5mgpro/mL)，迅速于铅盒内取Na125I2.5yL加入反应管中并将反应管置于铅防护盒中，室温反应20min，反应过程中每隔3min将反应管取出轻轻旋摇一次。用pH7.4、0.05mol/L的磷酸盐缓冲液150yL终止碘化反应并静止放置10min。采用S印hadexG_25层析柱分离纯化放射标记产物，预先用1%BSA(牛血清白蛋白)饱和并用PBS(O.01mol/L，pH7.4)平衡，流速O.3ml/min，每管lml，测定各管的放射性计数(cpm)，绘制放射性层析分离曲线，收集放射峰。(2)人血白蛋白及PEG-cys34-HSA在小鼠体内药代动力学和组织分布研究雄性昆明种小鼠90只，按体重随机分为30组(每组3只)，前15组为人血白蛋白组，后15组为修饰人血白蛋白组。每只小鼠快速尾静脉注射给药100iU，给药后5min、20min、45min、lh、4h、8h、12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h(15个时间点)眼眶取血0.lml，三氯乙酸沉淀，离心，于Y-能谱仪上测定放射性，记录结果用于计算药物体内半衰期等药代动力学参数。将动物颈椎脱臼处死，对时间点lh、4h、12h和24h的小鼠，解剖后取心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪等组织，生理盐水冲洗，切成重量小于lOOmg的小块称重并测定放射性，计算每克湿组织放射性占注射剂量的比值(％InjectedDose/g)，同时计算lh、4h、12h和24h时间点时每lml血液放射性占注射剂量的比值(％InjectedDose/ml)，比较不同组织(含血液)中人血白蛋白和PEG-cys34-HSA的分布情况。人血白蛋白与PEG-cys34-HSA小鼠体内药代动力学参数利用中国药理学会推荐的药代动力学程序"3P97"进行计算，根据AIC进行房室模型判别，结果表明小鼠尾静脉注射给药人血白蛋白和PEG-cys34-HSA符合二室模型，按二室模型法进行拟合，主要药代动力学参数见表2;图5显示的是人血白蛋白和PEG-HSA小鼠尾静脉注射后的血浆浓度的时间曲线；图6为人血白蛋白和PEG-cys34-HSA小鼠尾静脉注射后1，4，12和24h的组织分布图。由表2可知PEG-cys34-HSA的AUC和半衰期(t1/2)升高为未修饰前的2.2倍左右，另外，总体清除率也有所降低，这些结果都提示PEG-cy^-HSA在血循环中具有更好的保留率。由图6可知:PEG-cys"-HSA在各组织各时间点的分布(肾脏中lh和4h除外)均多于HSA，尤其在血浆中，PEG-cys34-HSA明显高于人血白蛋白，说明PEG_cys34-HSA较人血白蛋白能更好的保留在血液中，有利于在较长时间内发挥其增加血容量和维持血浆胶体渗透压的生理和药理功能。另外PEG-cys"-HSA在肾和肺中的组织分布较高，可能是由于肾和肺的组织血流量较大，血循环好，人血白蛋白向组织的扩散较快。PEG-cys34-HSA与人血白蛋白相比，并未显示明显的组织分布特异性，即人血白蛋白在修饰后其组织分布特点并未发生明显变化，只是分布的量上有所升高，说明PEG修饰并未影响人血白蛋白的组织分布规律。PEG-cys34-HSA和人血白蛋白在小鼠体内的药代动力学研究表明人血白蛋白经过PEG修饰后半衰期延长，血浆清除减慢，且PEG修饰并未影响人血白蛋白的组织分布规律。PEG修饰改善了人血白蛋白的药代动力学性质，有助于降低用药频率，缓解人血白蛋白来源紧张的问题。表2人血白蛋白与PEG-cys34-HSA小鼠体内药代动力学参数<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求聚乙二醇修饰的人血白蛋白，由白蛋白分子上的34位半胱氨酸残基的巯基、N-末端氨基或自由氨基结合聚乙二醇构成，其特征是所述34位半胱氨酸巯基定点单修饰所采用的修饰剂是聚乙二醇-马来酰亚胺(mPEG-MAL)；所述N-末端氨基定点单修饰所采用的修饰剂为聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)；所述自由氨基随机修饰所采用的修饰剂为聚乙二醇-琥珀酰亚胺活性酯或氰尿酰氯活化的单甲氧基聚乙二醇，结合聚乙二醇的白蛋白分子上的自由氨基的修饰率是3％-78％。2.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的人血白蛋白，其特征是所述修饰剂mPEG-MAL的分子量范围为500-80000道尔顿，所述修饰剂mPEG-ALD的分子量范围为1000-80000道尔顿，所述修饰剂聚乙二醇-琥珀酰亚胺活性酯或氰尿酰氯活化的甲氧基聚乙二醇的分子量范围为500-40000道尔顿。3.如权利要求2所述的聚乙二醇修饰的人血白蛋白，其特征是所述修饰剂mPEG-MAL的优选分子量范围为1000-40000道尔顿，所述修饰剂mPEG-MAL的形状为直链或分枝状；所述修饰剂mPEG-ALD优选分子量范围为1000-40000道尔顿，所述修饰剂mPEG-ALD的形状为直链或分枝状；所述聚乙二醇-琥珀酰亚胺活性酯或氰尿酰氯活化的单甲氧基聚乙二醇的优选分子量范围为1000-20000道尔顿，所述聚乙二醇-琥珀酰亚胺活性酯或氰尿酰氯活化的单甲氧基聚乙二醇的形状为直链或分枝状。4.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的人血白蛋白，其特征是所述聚乙二醇-琥珀酰亚胺活性酯包括聚乙二醇_琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)、聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)、聚乙二醇-琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)和聚乙二醇_N_羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG-NHS/mPEG2-NHS)，所述自由氨基随机修饰所采用的修饰剂为mPEG-SPA、mPEG-SC、mPEG-SBA、mPEG-NHS、mPEG厂NHS、氰尿酰氯活化的单甲氧基聚乙二醇其中的一种。5.如权利要求4所述的聚乙二醇修饰的人血白蛋白，其特征是所述自由氨基随机修饰所采用的修饰剂，优选mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG2_NHS。6.如权利要求l所述的聚乙二醇修饰的人血白蛋白，其特征是所述白蛋白的自由氨基的聚乙二醇修饰产物为2-45个聚乙二醇链连接在一个白蛋白分子上。7.如权利要求l所述的聚乙二醇修饰的人血白蛋白制备方法，其特征是包括以下步骤(1)将mPEG-MAL与人血白蛋白，按摩尔比为2-20:1的比例溶于10-100mmol/L磷酸盐缓冲液(含10mmol/LEDTA)中，在p朋.0-7.0，温度20-37。C条件下，轻轻振荡10_30h，即得白蛋白34位半胱氨酸的聚乙二醇定点单修饰产物；或将mPEG-ALD与人血白蛋白按摩尔比为2-10:1的比例溶于pH5.0-5.5、20-80,l/L的醋酸盐缓冲液中，以5-50,1/L的硼氢化钠为还原剂，15-37t:条件下，振荡反应5-30h，将反应液pH调为4，稀盐酸稀释5倍，终止反应，即得白蛋白的N-末端氨基聚乙二醇定点单修饰产物；或将聚乙二醇_琥珀酰亚胺活性酯(如mPEG-SPA)与白蛋白按摩尔比2-40:1的比例溶于p朋.5_9.5、10-50mmol/L的磷酸盐或硼酸盐缓冲液中，4-3(TC轻轻振荡反应0.5-24h;或将氰尿酰氯活化的单甲氧基聚乙二醇与白蛋白按摩尔比2-40:1的比例溶于pH8-10、10mmol/L四硼酸钠缓冲液中，4-3(TC条件下，振摇反应0.5-24h后，加甘氨酸终止修饰反应，即得聚乙二醇随机修饰白蛋白产物；其中，上述白蛋白均以白蛋白的蛋白含量进行摩尔计算。(2)采用离子交换层析法分别对聚乙二醇修饰的人血白蛋白进行分离纯化，pH5.0-7.0，10-50mmol/L磷酸盐缓冲液平衡上样，0-lmol/LNaCl线性梯度洗脱，收集洗脱峰，冷冻干燥，制得纯品。8.如权利要求7所述聚乙二醇修饰的人血白蛋白的制备方法，其优选法特征是所述mPEG-MAL与白蛋白的摩尔比为2:1，磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L，pH值为6.5，反应温度为30°C，反应时间为20h;所述mPEG-ALD与白蛋白的摩尔比为5:1，醋酸盐缓冲液的pH值为5.O，浓度为50mmol/L，硼氢化钠的浓度为20mmol/L，反应温度为3(TC，反应时间为24h;所述聚乙二醇-琥珀酰亚胺活性酯(如mPEG-SPA)与白蛋白的反应条件中，摩尔比为5-20:1，反应缓冲液为pH8.0、50mmol/L的磷酸盐缓冲液，反应温度为20°C，反应时间为10h。9.如权利要求7所述聚乙二醇修饰的人血白蛋白的制备方法，其优选法特征是所述四硼酸钠缓冲液的pH值为9.O，浓度为10mmol/L，所述摩尔比为10:l，反应温度为20°C，反应时间为10h。10.如权利要求7所述聚乙二醇修饰的人血白蛋白的制备方法，其优选法特征是所述离子交换层析法采用DEAES印haroseFF层析介质对聚乙二醇修饰的人血白蛋白进行分离纯化；所述离子交换层析法分离纯化聚乙二醇修饰的人血白蛋白所用的平衡液的PH值优选为6.5，浓度优选为10mmol/L。全文摘要本发明涉及生物医药
技术领域：
，特别是聚乙二醇修饰的人血白蛋白及其制备方法。所述聚乙二醇修饰的人血白蛋白，由白蛋白分子上的34位半胱氨酸残基的巯基、N-末端氨基或自由氨基结合聚乙二醇构成。其中定点单修饰所采用的修饰剂分别是聚乙二醇-马来酰亚胺和聚乙二醇-丙醛，自由氨基随机修饰所采用的修饰剂聚乙二醇-琥珀酰亚胺活性酯或氰尿酰氯活化的单甲氧基聚乙二醇，结合聚乙二醇的白蛋白分子上的自由氨基的修饰率是3％-78％。本发明制得的聚乙二醇修饰的人血白蛋白与天然白蛋白相比，具有半衰期延长，血浆清除减慢等优良特性，有利于减少用药频率，缓解白蛋白来源紧张问题。文档编号C07K14/765GK101709085SQ20091022954公开日2010年5月19日申请日期2009年11月2日优先权日2009年11月2日发明者仲立军,刘欣晏,刘纯慧,庞广礼,王凤山,谭海宁,赵婷,马山申请人:山东泰邦生物制品有限公司;山东大学药学院