专利名称：一种可用于制备长循环脂质体的巯基化聚乙二醇的合成方法
技术领域：
本发明涉及化学合成领域，具体涉及一种巯基化聚乙二醇衍生物的合成方法。 脂质体是一种磷脂双分子层构成的递药载体，具有很多优点，但是进入血液循环 后，容易被网状内皮系统吞噬，半衰期很短，而在脂质体膜表面引入聚合物分子后可形成空 间稳定的脂质体。研究最为广泛的聚合物是聚乙二醇。本发明研制的巯基化聚乙二醇可 以与马来酰亚胺化的磷脂反应生成聚乙二醇化的磷脂，从而制备出具有长循环作用的脂质 体；还可以与含有巯基的蛋白反应生成聚乙二醇化的蛋白，从而使该蛋白不易被网状内皮 系统吞噬。 巯基化聚乙二醇的合成方法已有文献报道Suzuki等(Biochimica etBiophysica Acta. 1245(1995)9-16)将聚乙二醇单甲醚在40°C与琥珀酸酐反应生成聚乙二醇-琥珀酸 酯(II)，再与N-羟基琥珀酰亚胺在脱水剂存在的条件下反应，生成聚乙二醇_琥珀酰亚胺 酯(III)，再通过与胱氨酸反应生成聚乙二醇-胱氨酸(IV)，经二硫苏糖醇(DTT)断键，通 过葡聚糖凝胶柱分离得到产品(1)。按文献方法在合成(II)时使用氯仿作为溶剂，4(TC反 应4h，结果仍有大量原料未反应；在制备(III)的过程中，按文献的方法难以进行，得不到 相应的中间体；按文献的方法合成(IV)后，不经分离纯化就直接断(IV)的二硫键，通过葡 聚糖凝胶分离，难以得到高纯度的巯基化聚乙二醇；并且文献缺乏对巯基化聚乙二醇衍生 物的可靠鉴定方法。 因此，本领域迫切需要提供一种如式I所示的巯基化聚乙二醇的制备方法，所述 的方法不仅可以有效进行，而且可以得到纯度高的式I化合物。 n = 3-125 ;优选n = 30-60。
发明内容
本发明旨在提供一种式I化合物的新的制备方法。
本发明中，提供了一种如式I所示的化合物的制备方法，所述的方法包括步骤
(1)将聚乙二醇单甲醚和琥珀酸酐混合于氯仿中，在60-9(TC条件下反应得到如
背景技术：
^(CH2CH2Q^~Me
3式II所示的化合物； (2)将式II化合物、N-羟基琥珀酰亚胺、脱水剂和有机碱混合，得到如式III所示 的化合物；所述的脱水剂选自1-乙基_3- (3- 二甲氨基丙基)_碳酰二亚胺盐酸盐、N， N- 二 异丙基碳二亚胺、或N， N-二环己基碳二亚胺；所说的有机碱选自N-甲基吗啉、三乙胺、妣 啶、或二甲氨基吡啶； (3)将式III化合物和半胱氨酸混合，得到如式IV所示的化合物；禾口
(4)将式IV化合物和二硫苏糖醇混合，得到如式I所示的化合物。
在另一优选例中，聚乙二醇单甲醚和琥珀酸酐的摩尔比为1 : 1-8。
在另一优选例中，步骤(1)的反应在吡啶存在下进行。 在另一优选例中，步骤(2)中式II化合物、N-羟基琥珀酰亚胺、脱水剂和有机碱
的摩尔比为i:i:i:3-i:6:2:6。 在另一优选例中，步骤(2)中脱水剂为l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚 胺盐酸盐；有机碱为N-甲基吗啉。 在另一优选例中，步骤(3)的反应在pH7. 4的缓冲液中进行。 在另一优选例中，步骤(3)中将式III化合物和半胱氨酸在pH7.4的缓冲液中混
合，然后进行硅胶层析分离得到如式iv所示的化合物。 在另一优选例中，硅胶层析流动相为二氯甲烷甲醇=7_12 : 1。 在另一优选例中，步骤(4)中式IV化合物和二硫苏糖醇的摩尔比为1 : 1-3.5。 在另一优选例中，将式IV化合物和二硫苏糖醇混合于pH8. 6的缓冲液中。 据此，本发明提供了一种如式I所示的巯基化聚乙二醇的制备方法，所述的方法
不仅可以有效进行，而且可以得到纯度高的式I化合物。
图1显示了本发明提供的式I化合物的制备方法流程图。 图2中的1显示了实施例1得到的式I化合物的薄层层析结果；而其中的2和3都 是当在第三步时，没有经过硅胶层析步骤，而通过第四步得到的化合物I的薄层层析结果。
具体实施例方式
发明人经过研究，发现了一种新的式I化合物的制备方法，所述的方法包括步骤 如图l所示 (1)将聚乙二醇单甲醚和琥珀酸酐混合于氯仿中，在60-9(TC条件下得到如式II 所示的化合物； (2)将式II化合物、N-羟基琥珀酰亚胺、脱水剂和有机碱混合，得到如式III所示 的化合物；所述的脱水剂选自1-乙基_3- (3- 二甲氨基丙基)_碳酰二亚胺盐酸盐、N， N- 二 异丙基碳二亚胺、或N， N-二环己基碳二亚胺；所说的有机碱选自N-甲基吗啉、三乙胺、妣 啶、或二甲氨基吡啶； (3)将式III化合物和半胱氨酸混合，得到如式IV所示的化合物；禾口 (4)将式IV化合物和二硫苏糖醇混合，得到如式I所示的化合物。 本发明步骤(1)在氯仿中的反应温度为60-9(TC，使反应速度加快；发明人意外地发现，在步骤(2)中使用有机碱可以使反应顺利进行；另外发明人在步骤(3)中通过使用硅
胶层析，得到纯化的式IV化合物，从而进一步提高的终产物式I化合物的纯度。 另外，发明人还提供了可靠的鉴定方法对产物进行鉴别。 本文中所涉及的部分化合物如下表所示<formula>formula see original document page 6</formula><formula>formula see original document page 7</formula>表中，n = 3-125，优选n = 30-60 ;更佳地，n = 45。 在本发明的一个实施例中，提供了下述方法制备得到式I化合物 1)、在氯仿中，聚乙二醇单甲醚与琥珀酸酐溶解后，在吡啶存在下在60-9(TC回流，
生成聚乙二醇-琥珀酸酯(II); 2)、将(II)溶于二氧六环中，再依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、脱水剂和有机碱，脱 水生成(III); 3)、将胱氨酸分散于pH7.4的缓冲溶液中，加入(III)并不断用无机碱调节pH二 7.4，脱N-羟基琥珀酸亚胺生成(IV); 4)、将(IV)溶于pH8. 6的缓冲液中，通过加入二硫苏糖醇断二硫键生成(I)。
以上各步骤中，合成(II)时，以氯仿为溶剂，反应温度为60-9(TC ;聚乙二醇单甲
醚与琥珀酸酐的摩尔比为i : i-i : 8，优选i : 5 ;最后通过重结晶收集(n)产物。 在合成(III)时，所说的脱水剂选自l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺 盐酸盐、N， N- 二异丙基碳二亚胺、或N， N- 二环己基碳二亚胺，优选1-乙基-3-(3- 二甲氨 基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐；所说的有机碱选自N-甲基吗啉、三乙胺、吡啶、或二甲氨基吡 啶，优选N-甲基吗啉。 当所使用的脱水剂为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐，有机碱 为N-甲基吗啉时，(ni)、N-羟基琥珀酰亚胺、l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺
盐酸盐和N-甲基吗啉的摩尔比为i :i:i:3-i:6:2: 6，优选i :3:2:6。 在合成(IV)时，将胱氨酸分散于pH7. 4的缓冲溶液中，加入(III)并不断用无机 碱调节pH二 7.4，反应一定时间后，过滤除去不溶固体，滤液通过硅胶柱层析分离出(IV)， 再进行(I)的制备。 在合成(I)时，(IV)与二硫苏糖醇的摩尔比为1 : 1-3. 5，优选1 : 1。制得的(I) 通过MALDI-T0F确定分子量 亂DI-T0F(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization,亂DI)基质辅助 激光解吸电离飞行时间质谱，特点是准分子离子峰很强，几乎无碎片离子，适合与聚合物或 蛋白质分子量的测定。聚乙二醇是由不同聚合度的分子构成的混合物，在MALDI-TOF图谱 上它的分力量分布呈正态分布，每一个峰代表一个聚合度的分子。 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示
的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、
均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特
征的一般性例子。 本发明的主要优点在于 1、反应速度快； 2、得到的式I化合物纯度高。 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按
重量计。 本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶质的重量。 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 本发明实施例中所述的薄层层析是硅胶薄层层析，流动相为二氯甲烷甲醇=
7.5 : i。 实施例1 制备式I化合物A 第一步在100ml三颈瓶中加入30ml氯仿、聚乙二醇2000单甲醚(2. 0g， lmmol)、 琥珀酸酐(0. 603g，6mmo1)和0. 5ml吡啶，60°C油浴加热回流搅拌4h，用10ml 0. 5M盐酸 洗涤一次，再用水10ml洗涤两次，除去水层，用无水硫酸钠干燥氯仿层，过夜滤掉硫酸钠， 再将氯仿层转移到圆底烧瓶中，减压蒸馏除去氯仿层，经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇 2000-琥珀酸酯(II)，收率85. 34% 。由MALDI-T0F得到一系列M+钠峰1959、2003、2048、 2091、2136、2180、2224、2268、2312、2356等。 第二步在100ml三颈瓶中加入25ml 二氧六环、第一步得到的聚乙二醇2000-琥 珀酸酯(II) (1. 5g， 0. 7mmo1) 、 N-羟基琥珀酰亚胺(0. 245g， 3mmo1) 、 1-乙基-3- (3- 二甲氨 基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(0. 383g，2mmo1)和N-甲基吗啉(0. 61g，6mmo1) ， 50°C油浴 加热搅拌反应8h，蒸干溶剂，用氯仿30ml复溶，用0. 5M盐酸每次10ml洗涤三次，分离水 层，用无水硫酸钠干燥氯仿层，过滤出去硫酸钠，减压蒸馏得到聚乙二醇2000-琥珀酰亚胺 (III) 1. 14g。 第三步在100ml烧杯中加入0. 05M pH = 7. 4的HBS缓冲液50ml，将胱氨酸 (1.93g，8mmo1)混悬于缓冲液中，称取第二步得到的聚乙二醇2000-琥珀酰亚胺(III) (4. 42g，2mmo1)少量多次加到缓冲液中，并不断搅拌，同时用pH计监测pH值的变化，用0. 5M Na0H调节pH值为7. 4，室温反应12h，过滤除去不溶固体，滤液中加入甲苯50ml，抽真空蒸 干溶剂，重复几次，将得到固体用硅胶层析柱分离，流动相二氯甲烷甲醇=10 : l，合并 洗脱液为(IV)的溶媒，蒸干得到聚乙二醇2000-胱氨酸(IV)2.67g。 第四步在50ml三颈瓶中，加入10ml pH = 8. 6的1M Tris-HCl缓冲液，加入 第三步得到的聚乙二醇2000-胱氨酸(IV) (2. 2g，0. 5mmol)，再加入二硫苏糖醇(77mg， 0. 5mmo1)，室温反应lh，用葡聚糖凝胶G-50分离，以pH = 6. 8的0. 05M IBS缓冲液洗脱，合 并含有聚乙二醇2000-半胱氨酸(即巯基化聚乙二醇)(式I化合物A)的洗脱液，蒸干溶 剂得到2. 08g，收率94. 54% ，于-2(TC冰箱充氮气保存，用MALDI-T0F得到式I化合物A的 质谱。 由MALDI-TOF得到 一 系列加氢峰分别为1996、2040、2084、2128、2172、2216、 2260、2304、2348、2392、2436等。 得到的(I)薄层色谱显示为单点产物。见图1。
实施例2 制备式I化合物B 第一步在1000ml三颈瓶中加入300ml氯仿、聚乙二醇2000单甲醚(20. 0g， 10mmol)、琥珀酸酐(8. lg，80mmo1)和5ml妣啶，8(TC油浴加热回流搅拌4h，用lOOmlO. 5M盐 酸洗涤一次，再用水100ml洗涤两次，除去水层，用无水硫酸钠干燥氯仿层，过夜滤掉硫酸 钠，再将氯仿层转移到圆底烧瓶中，减压蒸馏除去氯仿层，经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇 2000-琥珀酸酯(n)，收率83. 21%。 第二步在500ml三颈瓶中加入125ml二氧六环、第一步得到的聚乙二醇2000-琥 珀酸酯(II) (8. Og， 3. 79,1) 、 N-羟基琥珀酰亚胺(1. 54g， 18. 9,1) 、1-乙基-3-(3- 二 甲氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(0. 383g，2mmo1)和N-甲基吗啉(0. 61g， 6mmo1) ， 5(TC油 浴加热搅拌反应8h，蒸干溶剂，用氯仿150ml复溶，用0. 5M盐酸每次40ml洗涤三次，分离 水层，用无水硫酸钠干燥氯仿层，过滤出去硫酸钠，减压蒸馏得到聚乙二醇2000-琥珀酰亚 胺(111)6. 12g。第三步在100ml烧杯中加入0. 05M pH = 7. 4的HBS缓冲液50ml，将胱氨 酸(1.44g，6mmo1)混悬于缓冲液中，称取第二步得到的聚乙二醇2000-琥珀酰亚胺(III) (4. 42g，2mmo1)少量多次加到缓冲液中，并不断搅拌，同时用pH计监测pH值的变化，用0. 5M NaOH调节pH值为7. 4，室温反应12h，过滤除去不溶固体，滤液中加入甲苯50ml，抽真空蒸 干溶剂，重复几次，将得到固体用硅胶层析柱分离，流动相二氯甲烷甲醇=10 : l，合并 洗脱液为(IV)的溶媒，蒸干得到聚乙二醇2000-胱氨酸(IV)2.59g。第四步在50ml三颈瓶中，加入10ml pH = 8. 6的1M Tris-HCl缓冲液，加入 第三步得到的聚乙二醇2000-胱氨酸(IV) (2. 2g，0. 5mmol)，再加入二硫苏糖醇(108mg， 0. 7mmo1)，室温反应lh，用葡聚糖凝胶G-50分离，以pH = 6. 8的0. 05M HBS缓冲液洗脱，合 并含有聚乙二醇2000-半胱氨酸(即巯基化聚乙二醇)(式I化合物B)的洗脱液，蒸干溶 剂得到2. 12g，收率96. 36%，于_201:冰箱充氮气保存。
得到的(I)薄层色谱显示为单点产物。
实施例3
制备式I化合物C 第一步在100ml三颈瓶中加入30ml氯仿、聚乙二醇2000单甲醚(2. Og， lmmol)、 琥珀酸酐(0. 10g， lmmol)和O. 5ml吡啶，60。C油浴加热回流搅拌4h，用10ml 0. 5M盐酸 洗涤一次，再用水10ml洗涤两次，除去水层，用无水硫酸钠干燥氯仿层，过夜滤掉硫酸钠， 再将氯仿层转移到圆底烧瓶中，减压蒸馏除去氯仿层，经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇 2000-琥珀酸酯(II)0. 873g，收率39. 45%。 第二步在500ml三颈瓶中加入125ml二氧六环、第一步得到的聚乙二醇2000-琥 珀酸酯(II) (8. Og， 3. 79,1) 、N-羟基琥珀酰亚胺(0. 45g， 3. 80,1) 、 1-乙基-3- (3- 二甲 氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(0. 728g，3. 8mmo1)和N-甲基吗啉(1. llg， 11. Ommol) ， 50°C 油浴加热搅拌反应8h，蒸干溶剂，用氯仿150ml复溶，用0. 5M盐酸每次40ml洗涤三次，分离 水层，用无水硫酸钠干燥氯仿层，过滤出去硫酸钠，减压蒸馏得到聚乙二醇2000-琥珀酰亚 胺(ni)2.69g。 第三步在100ml烧杯中加入0. 05M pH = 7. 4的HBS缓冲液50ml，将胱氨酸 (1.20g，5mmo1)混悬于缓冲液中，称取第二步得到的聚乙二醇2000-琥珀酰亚胺(III)(4. 42g，2mmo1)少量多次加到缓冲液中，并不断搅拌，同时用pH计监测pH值的变化，用0. 5M NaOH调节pH值为7. 4，室温反应12h，过滤除去不溶固体，滤液中加入甲苯50ml，抽真空蒸 干溶剂，重复几次，将得到固体用硅胶层析柱分离，流动相二氯甲烷甲醇=10 : l，合并 洗脱液为(IV)的溶媒，蒸干得到聚乙二醇2000-胱氨酸(IV)2.47g。第四步在50ml三颈瓶中，加入10ml pH = 8. 6的1M Tris-HCl缓冲液，加入第 三步得到的聚乙二醇2000-胱氨酸(IV) (2. 2g，0. 5mmol)，再加入二硫苏糖醇(61. 68mg， 0.4mmol)，室温反应lh，用葡聚糖凝胶G-50分离，无法将(I)与(IV)有效分离开。
实施例4
制备式I化合物D 第一步在100ml三颈瓶中加入30ml氯仿、聚乙二醇2000单甲醚(2. Og， lmmol)、 琥珀酸酐(0.08g， 0.8,1)和0.5ml吡啶，60°C油浴加热回流搅拌4h，用10ml 0. 5M盐酸 洗涤一次，再用水10ml洗涤两次，除去水层，用无水硫酸钠干燥氯仿层，过夜滤掉硫酸钠， 再将氯仿层转移到圆底烧瓶中，减压蒸馏除去氯仿层，经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇 2000-琥珀酸酯(II) 0. 727g，收率34. 41 % 。 第二步在500ml三颈瓶中加入125ml二氧六环、第一步得到的聚乙二醇2000-琥 珀酸酯(II) (8. Og， 3. 79,1) 、N-羟基琥珀酰亚胺(0. 35g， 3. 00,1) 、 1-乙基-3- (3- 二甲 氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(0. 709g，3. 7,1)和N-甲基吗啉(1. 11g，11.0mmol)，50。C 油浴加热搅拌反应8h，蒸干溶剂，用氯仿150ml复溶，用0. 5M盐酸每次40ml洗涤三次，分离 水层，用无水硫酸钠干燥氯仿层，过滤出去硫酸钠，减压蒸馏得到聚乙二醇2000-琥珀酰亚 胺(111)2. 34g。 第三步在lOOml烧杯中加入O. 05M pH = 7. 4的HBS缓冲液50ml，将胱氨酸 (0. 96g， 4mmo1)混悬于缓冲液中，称取第二步得到的聚乙二醇2000-琥珀酰亚胺(I11) (4. 42g，2mmo1)少量多次加到缓冲液中，并不断搅拌，同时用pH计监测pH值的变化，用0. 5M NaOH调节pH值为7. 4，室温反应12h，过滤除去不溶固体，滤液中加入甲苯50ml，抽真空蒸 干溶剂，重复几次，将得到固体用硅胶层析柱分离，流动相二氯甲烷甲醇=10 : l，合并 洗脱液为(IV)的溶媒，蒸干得到聚乙二醇2000-胱氨酸(IV)2.51g。第四步在50ml三颈瓶中，加入10ml pH = 8. 6的1M Tris-HCl缓冲液，加入第
三步得到的聚乙二醇2000-胱氨酸(IV) (2. 2g，0. 5mmol)，再加入二硫苏糖醇(154. 2mg，
lmmol)，室温反应lh，用葡聚糖凝胶G-50分离，以pH = 6. 8的0. 05M HBS缓冲液洗脱，合并
含有聚乙二醇2000-半胱氨酸(即巯基化聚乙二醇)(式I化合物D)的洗脱液，蒸干溶剂
得到2. 12g，收率96. 36%，于_201:冰箱充氮气保存。 实施例5 制备式I化合物E 第一步在100ml三颈瓶中加入30ml氯仿、聚乙二醇2000单甲醚(2. Og， lmmol)、 琥珀酸酐(0. 41g，4mmo1)和0. 5ml吡啶，60°C油浴加热回流搅拌4h，用10ml 0. 5M盐酸 洗涤一次，再用水10ml洗涤两次，除去水层，用无水硫酸钠干燥氯仿层，过夜滤掉硫酸钠， 再将氯仿层转移到圆底烧瓶中，减压蒸馏除去氯仿层，经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇 2000-琥珀酸酯(II) 1. 66g，收率78. 41 % 。 第二步在100ml三颈瓶中加入25ml 二氧六环、第一步得到的聚乙二醇2000-琥珀酸酯(II) (1.5g，0. 7mmo1) 、 N-羟基琥珀酰亚胺(0. 245g， 3mmol) 、 1-乙基-3-(3-二甲氨 基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(0. 383g，2mmo1)和N-甲基吗啉(0. 61g，6mmo1) ， 50°C油浴 加热搅拌反应8h，蒸干溶剂，用氯仿30ml复溶，用0. 5M盐酸每次10ml洗涤三次，分离水 层，用无水硫酸钠干燥氯仿层，过滤出去硫酸钠，减压蒸馏得到聚乙二醇2000-琥珀酰亚胺 (ni)1.23g。 第三步在100ml烧杯中加入0. 05M pH = 7. 4的HBS缓冲液50ml，将胱氨酸 (1. 44g， 6mmo 1)混悬于缓冲液中，称取第二步得到的聚乙二醇2000-琥珀酰亚胺(111) (4. 42g，2mmo1)少量多次加到缓冲液中，并不断搅拌，同时用pH计监测pH值的变化，用0. 5M Na0H调节pH值为7. 4，室温反应12h，过滤除去不溶固体，滤液中加入甲苯50ml，抽真空蒸 干溶剂，得到固体4. llg。经薄层色谱显示有其他杂质。第四步在50ml三颈瓶中，加入10ml pH = 8. 6的1M Tris-HCl缓冲液，加入 第三步得到的聚乙二醇2000-胱氨酸(IV) (2. 2g，0. 5mmol)，再加入二硫苏糖醇(77mg， 0. 5mmo1)，室温反应lh，用葡聚糖凝胶G-50或柱层析分离，都无法分离杂质和(I)。
实施例6
制备式I化合物F 第一步在100ml三颈瓶中加入30ml氯仿、聚乙二醇2000单甲醚(2. 0g， lmmol)、 琥珀酸酐(0. 603g，6mmo1)和0. 5ml吡啶，60°C油浴加热回流搅拌4h，用10ml 0. 5M盐酸 洗涤一次，再用水10ml洗涤两次，除去水层，用无水硫酸钠干燥氯仿层，过夜滤掉硫酸钠， 再将氯仿层转移到圆底烧瓶中，减压蒸馏除去氯仿层，经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇 2000-琥珀酸酯(II)收率84. 67%。 第二步在100ml三颈瓶中加入25ml 二氧六环、第一步得到的聚乙二醇2000-琥 珀酸酯(n)(1.5g，0. 7mmo1) 、 N-羟基琥珀酰亚胺(0. 245g，3mmo1)和1-乙基-3-(3-二甲 氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(0. 383g， 2mmo1) ， 50°C油浴加热搅拌反应8h，用薄层色谱显 示无(III)生成。 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范 围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术 实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将 被视为涵盖于该权利要求范围之中。
权利要求
一种如式I所示的化合物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤(1)将聚乙二醇单甲醚和琥珀酸酐混合于氯仿中，在60-90℃条件下反应得到如式II所示的化合物；(2)将式II化合物、N-羟基琥珀酰亚胺、脱水剂和有机碱混合，得到如式III所示的化合物；所述的脱水剂选自1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐、N，N-二异丙基碳二亚胺、或N，N-二环己基碳二亚胺；所说的有机碱选自N-甲基吗啉、三乙胺、吡啶、或二甲氨基吡啶；(3)将式III化合物和半胱氨酸混合，得到如式IV所示的化合物；和(4)将式IV化合物和二硫苏糖醇混合，得到如式I所示的化合物。
2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，聚乙二醇单甲醚和琥珀酸酐的摩尔比 为1 : 1-8。
3. 如权利要求l所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)的反应在吡啶存在下进行。
4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中式II化合物、N-羟基琥珀酰亚胺、脱水剂和有机碱的摩尔比为i :1:1:3-1:6:2:6。
5. 如权利要求l所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中脱水剂为l-乙基-3-(3-二 甲氨基丙基)_碳酰二亚胺盐酸盐；有机碱为N-甲基吗啉。
6. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)的反应在pH7.4的缓冲液中进行。
7. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中将式III化合物和半胱氨酸 在PH7. 4的缓冲液中混合，然后进行硅胶层析分离得到如式IV所示的化合物。
8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，硅胶层析流动相为二氯甲烷甲醇=7-12 : i。
9. 如权利要求l所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中式IV化合物和二硫苏糖醇 的摩尔比为1 : 1-3. 5。
10. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将式IV化合物和二硫苏糖醇混合于 pH8.6的缓冲液中。
全文摘要
本发明公开了一种如式I所示的化合物的制备方法。所述的方法包括步骤(1)将聚乙二醇单甲醚和琥珀酸酐混合于氯仿中，在60-90℃条件下得到如式II所示的化合物；(2)将式II化合物、N-羟基琥珀酰亚胺、脱水剂和有机碱混合，得到如式III所示的化合物；所述的脱水剂选自1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐、N，N-二异丙基碳二亚胺、或N，N-二环己基碳二亚胺；所说的有机碱选自N-甲基吗啉、三乙胺、吡啶、或二甲氨基吡啶；(3)将式III化合物和半胱氨酸混合，得到如式IV所示的化合物；和(4)将式IV化合物和二硫苏糖醇混合，得到如式I所示的化合物。本发明还提供了可靠的式I所示的化合物的鉴定方法。n＝3-125。
文档编号C08G65/48GK101768263SQ200810205019
公开日2010年7月7日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者蔡正艳, 邓家欣, 陶涛 申请人:上海医药工业研究院